Method Article
מטרת טכניקה זו היא להעריך (5-HT) סרוטונין תפקוד עצבי של בעל החיים חי ונושם חופשי עם הדמיה תרופתי באמצעות תהודה מגנטית (phMRI) ואת האתגר תוך ורידי עם סרוטונין סלקטיביים מעכבי ספיגה חוזרת (SSRI), פלואוקסטין.
תרופתי MRI (phMRI) היא שיטה חדשה מבטיחה לחקור את ההשפעות של חומרים על תפקוד המוח, כי בסופו של דבר יכול להשתמש בהם כדי לפענח מנגנונים הנוירוביולוגי הבסיסיים העומדים מאחורי הפעולה סמים הנוירוטרנסמיטר הקשורות הפרעות, כגון דיכאון, הפרעות קשב וריכוז. כמו רוב שיטות ההדמיה (PET, SPECT, CT) הוא מייצג התקדמות בחקירה של הפרעות במוח והפונקציה בנושא של הנוירוטרנסמיטר המסלולים בצורה לא פולשנית ביחס של קישוריות עצבית הכוללת. יתר על כן הוא גם מספק כלי אידיאלי עבור תרגום חקירות קליניים. MRI, תוך מאחור אסטרטגיות הדמיה מולקולרית לעומת PET ו SPECT, יש יתרון גדול יש רזולוציה מרחבית גבוהה צורך בהזרקה של חומר ניגוד או מולקולות רדיו שכותרתו, ובכך למנוע חשיפה חוזרת ונשנית לקרינה מייננת . MRI תפקודי (fMRI) נעשה שימוש נרחב במסגרת מחקר קליני, שם הוא גרבשילוב עם המשימה enerally פסיכו מוטורית. phMRI הוא עיבוד של fMRI המאפשר חקירה של מערכת מוליך עצבי ספציפי, כגון סרוטונין (5-HT), בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים לאחר ההפעלה באמצעות מתן התרופה אתגר ספציפי.
מטרת השיטה המתוארת כאן היא להעריך 5-HT תפקוד המוח על נשימה חופשית לבעלי חיים. על ידי תיגר על מערכת 5-HT ובמקביל רכישת תפקודית תמונות MR לאורך זמן, התגובה של המוח לאתגר זה ניתן דמיינו. מספר מחקרים בבעלי חיים כבר הוכיחו כי סמים עלייה ברמות של תאיים כגון 5-HT (סוכני שחרור, סלקטיביים חוסמי ספיגה חוזרת, וכו ') לעורר באזור ספציפיים לשינויים ברמת החמצן בדם אותות ה-MRI התלויים (BOLD) (האות בשל שינוי של רמות המוגלובין מחומצן / deoxygenated המתרחשים במהלך הפעלת המוח באמצעות עלייה של אספקת הדם לספק חמצן גרםlucose לתאי העצב בדרישה) מתן מדד תפקוד עצבי. כמו כן הוכח כי אלה תופעות יכול להיות הפוך על ידי טיפולים 5-HT ירידה זמינות 16,13,18,7. אצל חולדות בוגרות, שינויים אותות מודגש הבאים חריפה הממשל SSRI תוארו במספר אזורים 5-HT במוח קשורים, כלומר אזורים בקליפת המוח, בהיפוקמפוס, בהיפותלמוס ו התלמוס 9,16,15. גירוי של מערכת 5-HT ותגובה שלה לאתגר זה יכול לשמש כמדד ובכך תפקידו הן חיות ובני אדם 2,11.
הכנת החיה in vivo MRI דימות
1. כירורגי Cannulation
2. ניטור
במהלך ההליך כולו הדמיה, התגובות הפיזיולוגיות כמה יש לעקוב כל הזמן להיות כל הזמן כמו קבוע ככל האפשר. זה חיוני, כי תגובות אלו יכולות להשתנות במידה רבה על חלון הזמן כמו האות phMRI וגם להשפיע על האות של עניין. כמו כן, חשוב, בהתחשב בכך את בעל החיים ימוקמו תואר שניgnet ולכן הוא מחוץ לטווח הראייה ולא מקובל בדיקות סטנדרטיות של עומק ההרדמה (למשל קמצוץ הבוהן), כדי להבטיח מספיק עומק ההרדמה. בנוסף, בהתחשב בכך תרופות רבות לשנות פרמטרים לב וכלי דם כגון לחץ דם, מדידות אלה היא קריטית כדי להבטיח ניתן לקחת בחשבון את השפעות פיזיולוגיות העולמי הפעולה של התרופה בנתוני phMRI. ראה גם סעיף 4 על ערכי הבסיס ואת התגובות הצפויות עירוי של פלואוקסטין מ"ג / ק"ג 5.
In vivo הדמיה
ייצוג תרשים סכמטי של הניסוי fMRI ניתנת באיור 2.
3. הדמיה פרמטרים
עיבוד נתונים
4. תגובות פיזיולוגיות
התגובות הפיזיולוגיות צפויים לאתגר תלויים סמים הנבחר. להלן, ערכי בסיס מקובלים (של חולדות זכרים בוגרים) ואת התגובות הצפויות עירוי IV של פלואוקסטין מ"ג / ק"ג 5 מקבלים.
ילדה = "jove_title"> 5. Preprocessing נתוני ה-MRI
כאן אנו מתארים מספר שלבים של העיבוד המקדים של הנתונים מר כדי optimalize את הנתונים עבור ניתוח סטטיסטי. אנו מזכירים את הכלים בהם נעשה שימוש במעבדה שלנו, לעומת זאת כלים שונים זמינים.
5.1 נתונים הכנה
5.2 Motion תיקון
5.3 המוח פילוח
6. נתונים Analysiשל
מטרת הניתוח הסטטיסטי של הנתונים MR היא לקבוע את ווקסלים אשר התערוכה השונות נוסף המיוחס לאתגר את התרופה באופן חזק מבחינה סטטיסטית. גישות מתודולוגיות שונות זמינות עבור זה, גם חבילות תוכנה numerable. הבחירה שאתה עושה תלוי בזמינות של התוכנה והידע / ניסיון במעבדה שלך שאלת המחקר הספציפי שלך. כאן אנחנו נותנים השיטה כפי שהוצע משמש במעבדה שלנו.
6.1
6.2
השלב הבא הוא לבדוק סטטיסטית אז הסדרה גלם 4D זמן תמונה של כל חיה על מודל GLM הקודמת הוקמה. לשם כך, השתמשנו תוכנית FSL FEAT (FMRI מומחה כלי ניתוח, v5.98) 17,24. עם זאת, שאר כלי הניתוח-fMRI הם available גם כן. בתוך כלי ניתוח, ניתוח הרמה הראשונה צריך להגדיר. זה דורש את השלבים הבאים:
6.3
אחרי זה, 1 ברמת הניתוחים של כל בעלי החיים ניתן לשלב גבוה יותר (קבוצה) ניתוח ברמה סטטיסטית. זה תלוי במידה רבה מערך המחקר שלך ואת שאלות המחקר.
6.4
תגובות פיזיולוגיות סמים ניתן יחד או בקורלציה לאות MR, אם תרצה בכך. ראה גם סעיף 6.2.3 על הוספת לבלבל של EV.
7. נציג תוצאות
ove_content "> כאשר התרופה מאתגר (5 מ"ג / ק"ג IV פלואוקסטין) מזין את מערכת כלי הדם, תגובה פיזיולוגית ברורה צריך להיות גלוי קצב הנשימה (למעלה) ולחץ דם (למטה). תגובות אלו לנרמל בממוצע בתוך 5-10 דקות . באיור 3 זה ירידה בלחץ הדם נראה בבירור.במהלך הזמן הממוצע האות צריך להראות בסיס יציב יחסית, השפעה ברורה של האתגר. רצוי, לא אמורה להיות אתגר להיסחף עצמאית האות. למשל נציג כמובן אותות הזמן הממוצע שניתן לראות באיור 5 א. חפצים, כגון דיכאון הנשימה / כישלון או שינויים הרדמה לעיתים נראית בבירור האות. דיכוי נשימתי יהיה להשפיע לרעה על האות במוח כולו. ניתן לראות זאת ב 5 ב איור.
לאחר ניתוח הרמה הראשונה, דפוס ההפעלה צפויה להיות חיובית בעיקר locaטד באזורים מסוימים בלבד (כלומר אזורים בקליפת המוח, בהיפוקמפוס, בהיפותלמוס ו התלמוס; ראה איור 6 א). אם המוח כולו מבוטלת, זה בדרך כלל סימן של הרדמה עמוקה מדי ו / או מחסור בחמצן במהלך הסריקה. דוגמה לכך ניתן לראות באיור 6 ב.
באיור 1. מיקום מיקום של cannulas בעורק וריד הירך ו.
איור 2 ייצוג תרשים סכמטי של ה-MRI,. כל הציוד צריך להיות לא פרומגנטי והוא מחובר למערכת מודול המאפשר רכישת מגודרת של תמונות של הימנעות הפרעות בתנועה עקב ונשימה / או פעימות לב. טמפרטורת הגוף מווסתת גם באמצעות מודול חימום לפקח ולשלוט על הטמפרטורה חיה במהלך ההדמיה. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר .
איור 3. דוגמה מייצגת של נתונים ללחץ דם. יש מגמה ברורה של ירידה בלחץ הדם לעין מיד לאחר תחילת עירוי (פס אדום). ערכים נורמליים הם הגיעו שוב בתוך 10 דקות. לאחר מתן אתגר.
איור 4. דפוס) ההפעלה הצפוי באמצעות תוכנת ניתוח MRI לעידוד (אדום הוא הפעלת חיובית, כחול הוא הפעלת שלילי). ב) זמן כמובן ממוצע של כל ווקסלים הפעיל (≥ 1% שינוי מתחילת המחקר) של כל בעלי החיים. ג) דוגמה של מודל GLM וכתוצאה מכך FSL / Feat. Clאיכס כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 5.
לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
איור 6.
5-HT phMRI הוא כלי מבטיח להערכת תפקוד עצבי בבעלי חיים in vivo. הוא מדמיין את תגובת המוח לאתגר 5-HT עם MR הדמיה תפקודית. MRI יש יתרון גדול יש רזולוציה מרחבית גבוהה ולא צריך הזרקת חומר ניגוד או מולקולות רדיו שכותרתו וכך למנוע חשיפה חוזרת לקרינה מייננת. טכניקה זו ישימה במקצועות הן בני אדם ובעלי חיים, ולכן מתאים מאוד מחקר translational של מערכות נוירוטרנסמיטרים והפרעות פסיכיאטריות. היישום שלה הוא כמובן לא רק מסלול 5-HT וכבר נעשה שימוש נרחב על מנת להעריך השפעות הסמים דופאמין הן חיות ובני אדם 5,15 22.
עם זאת, phMRI בבעלי חיים קטנים עדיין מאתגרת, כפי שכבר הצביע החוצה מאמרי ביקורת על ידי מרטין Sibson 11 ואב הבית 20. אחד האתגרים הללו היא תחזוקה oפריץ פרמטרים פיזיולוגיים יציב במהלך רכישת התמונה. רוב הרדמה יכול לשנות את תפקוד הלב וכלי הדם וכן בהתחשב בכך phMRI תלויה באופן קריטי על פרמטרים לב וכלי דם / hemodynamic זה חיוני כדי להבטיח כי כל שינוי המודינמים הם לייחס אך ורק לאתגר את התרופה שניתנה. לכן חשוב ביותר כי 2 רמות PCO נשארים קבועים במהלך הרכישה הבסיסי. להנשמה מלאכותית יכול לעזור להבטיח יציבות פיזיולוגית, ומשמש בדרך כלל בסוג כזה של ניסויים. אנחנו לעומת זאת בחרה להשתמש נשימה חופשית חיות לעזוב פתוחה את האפשרות לבצע מחקרים ארוכי טווח בעתיד. במקום זאת, אנו פיקוח נרחב (ושינה) קצב הנשימה גז ערכים דם כדי להבטיח יציבות פיזיולוגית בתוך טווחי רגילות לפני תחילת הסריקה תפקודית ובדרך זו לשמור על תגובתיות כלי דם יציבה ולכן T2 * / T2 האות. הספרות על השפעות בהרדמה כללית על ופרמטרים המודינמיים ו metabolis המוחמ 'הוא שופע 20 ומעבר להיקף של כתב היד הזה. בחרנו להשתמש בהרדמה עם גז% ± 2 isoflurane בפרוטוקול ספציפי זה, כי עם הרדמה משאיפת, את עומק ההרדמה ניתן לשלוט בקלות במהירות. זה חשוב ההגדרה שלנו על מנת להבטיח יציבות לטווח נורמלי PCO 2 רמות לפני תחילת רכישת התמונה. Isoflurane היא נשימתית הרדמה הנפוץ ביותר כיום ומאפשר לזירוז החלמה מהירה, וזה חשוב עבור מחקרים ארוכי טווח. זה גם מייצר דיכאון הלב וכלי הדם ומערכת הנשימה מינימלי גורם להרפיה טובה של שרירי השלד.
שנית, עירוי לוריד של התרופה אתגר מסובך יותר אצל בעלי חיים קטנים יותר מאשר אצל בני אדם. הניתוח הדרוש cannulation של העורק עורק הירך ודורש צוות מיומן ומנוסה. בשל אלה הליכים פולשניים זה כרגע משמש בעיקר בהליכי מסוף. עם זאת, לא פולשנית לניטור של הומאוסטזיס דם בווריד הזרקת הזנב יכול לשמש מחקרים ארוכי טווח 23.
בנוסף, ישנן מספר מגבלות כלליות יותר לטכניקה, אשר אינן ספציפיות עבור בעלי חיים phMRI. בנוסף, כפי שציין מרטין Sibson 11, לבלבל את הפוטנציאל של כל המחקרים-fMRI היא כי ההנחה היא כי שינויים בפעילות המוח שעוררו אתגר משקפים שינויים בפעילות העצבית ולא תופעות מערכתיות הפריפריה. בעיקר מבנים מוחיים עמוקים יותר, ההבנה הדלה יחסית של צימוד neurovascular (הקשר בין הפעילות העצבית שינויים ושינויים המודינמים) נשאר. מחקרים מהסוג שביצע Logothetis 10 כדי לקבוע צימוד neurovascular בקליפת טרם בוצעו בחלקים אחרים של המוח. לא ידוע אם כן מה עליה אות BOLD מבנים חשובים כגון הסטריאטום או האמיגדלה היא אפשר לדעתגרם לנו על הפעילות העצבית. הכי טוב אפשר לומר שברגע זה הוא אזור במוח מגיב על האתגר נתון זה תלוי בטיפול ו / או התנאים, אנו יכולים לעקוב אחר שינויים משמעותיים של תגובתיות המוח. במידה רבה זה יכול להיות מאומת על ידי הסתכלות על שני נתוני ה-MRI ותגובות פיזיולוגיות. תבנית כללית של פעילות המוח צריך להיות באזור מסוים מוגבלת לאזורים עם, במקרה זה, עצבוב גבוה 5-HT, ולא עד כמה התגובה של כלי הדם באופן כללי. כמו כן, הפרופיל הזמני שונה בין שינויים בכלי הדם ואת hemodynamic צפוי. ואילו שינויים בלחץ הדם לחזור ערכי הבסיס שלהם בתוך מספר דקות, את ההשפעה של התרופה על הפעלת מודגש במקרה של פלואוקסטין הנראה עד סוף רכישת התמונה מתאימות יודעים המאפיינים פרמוקוקינטיים של תרופה זו. לבסוף, את התגובות הפיזיולוגיות של כל בעלי החיים צריך להיות דומה כדי לעשות השוואות בין הנושא. Nonetheless, ידוע כי תקנה neurogenic של זרימת הדם המקומית על ידי 5-HT קיימים 4. לכן לא ניתן לשלול כי שינויים מקומיים של האות BOLD יכול לייחס לשינויים בכלי הדם בשל שחרור של 5-HT על הקרבה של כלי. למרות השפעות אלו אינם קשורים להפעלה עצבית מקומית ולכן יכול להיחשב תוצאות חיוביות שגויות, הוא גם אינדקס של פונקציה ספציפית הכוללת של המערכת 5-HT (ראו גם 3).
השלבים הקריטיים של הטכניקה הזו ולכן הם לעקוב אחר התגובות הפיזיולוגיות בהרחבה על מנת לוודא כי התנאים הפיזיולוגיים של בעל החיים הם יציבים לפני ובמהלך רכישת התמונה. גם התנאים סורק צריכה להיות יציבה ככל האפשר בדיוק את אותו הדבר עבור כל חיה. יציבות האות של רצף יש לבדוק ואישר לפני תחילת הניסוי. יתר על כן, הקפד תמיד יש כוח סטטיסטי מספיק גדול, אפילו עם Grou נושא קטןPS. לסקירה נחמדה על השיקולים ניסיוניים של בעלי חיים phMRI באופן כללי, ראה המשרתים 20 ו לדוגמה נוספת של פרוטוקול הניסוי עבור fMRI תרופתי אצל חולדות ועכברים, ראה פרארי 5.
שינויים אפשריים של הטכניקה המתוארות כאן הן רבות. אחד יכול:
אילו הבחירות שתבצע בהגדרת הניסוי תלויה מאוד את האפשרויות ו / או ניסיון בתחום המעבדה שלך ואת סוג של שאלת המחקר היית רוצה לענות.
אין לנו מה למסור.
עבודה זו ממומנת על ידי ארגון הולנד למחקר מדעי (NWO) (ללא Veni. 916.86.125), הוענק ל Reneman. למממן לו שום תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם או הכנת כתב היד. אין ניגוד עניינים.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
שם מגיב / ציוד | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
Isoflurane | אבוט אבוט מעבדות בע"מ, Maidenhead, בריטניה | לא B506 | מערבבים עם רפואי אוויר |
רפואי אוויר | BOC בריאות | ||
כרית חימום | הרווארד המנגנון | 507223F מערכת שלמה שמיכה Homeothermic עם Probe בינוני גמיש, 230 VAC, 50 הרץ | |
משי l igature | http://www.harvardapparatus.com/ | 2-0 משי שחור קלוע שאינם נספגים חתול מס '51-7631 | |
PE-50 קנית | http://www.scientificlabs.co.uk/~~V | Portex Tubing PE 0.58x0.96mm | 0.58 מזהה 0.96 מ"מ OD |
הפרין סודיום | ליאו מעבדות בע"מ, דולר., בריטניה | הפרין 1000IU/ml | 15 U / ml |
רקמות Vetbond דבק | 3M | ttp :/ / / solutions.3m.co.uk/wps/portal/3M/en_GB/HealthCare/Home/ProdInfo/VetProducts _blank "היעד =" "> זכר דבק רקמות Vetbond | |
מערכת ניטור | SA מכשירים | http://www.i4sa.com ניטור 1025L דגם מערכת | מפקחת נשימה וטמפרטורה |
לחץ מתמר | Biopac Systems Corp | מתמר הלחץ דם - TSD104A MP150 רכישת Data System - WIN - MP150WSW | צגים לחץ דם |
גז RapidLab דם Analyzer | סימנס אבחון | RAPIDLab 248/348 מערכות | |
בעלי חיים 4.7T סורק | Agilent Technologies (לשעבר Magnex) 4.7T בתדר 199.845 MHz | ||
MR המיטה stereotactic תואם | M2M הדמיה קורפ | המיטה עכברוש: אלמנט הרשות הפלסטינית רב AHS 50-72-1003/100 | |
סליל | M2M הדמיה קורפ | נפח TH / Rx RQD1 72/112 200 | |
פלואוקסטין הידרוכלוריד | Sigma-Aldrich | F-132 | 5mg/kg ב מלוחים |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved