Method Article
L'obiettivo di questa tecnica è quello di valutare serotonina (5-HT) in funzione di neurotrasmettitore l'animale vivo e respiro libero con farmacologica risonanza magnetica (phMRI) e una sfida per via endovenosa con un inibitore selettivo della ricaptazione della serotonina (SSRI), fluoxetina.
Farmacologico MRI (phMRI) è un metodo nuovo e promettente per studiare gli effetti delle sostanze sulla funzione del cervello che potrà poi essere usati per svelare sottostanti meccanismi neurobiologici alla base dell'azione dei farmaci e neurotrasmettitori disturbi, quali depressione e ADHD. Come la maggior parte dei metodi di imaging (PET, SPECT, CT) rappresenta un progresso nello studio delle patologie cerebrali e la relativa funzione di percorsi neurotrasmettitori in modo non invasivo nel rispetto della connettività complessiva neuronale. Inoltre fornisce anche lo strumento ideale per la traduzione alle indagini cliniche. MRI, mentre ancora dietro in strategie di imaging molecolare rispetto al PET e SPECT, ha il grande vantaggio di avere una elevata risoluzione spaziale e senza necessità per l'iniezione di un mezzo di contrasto o molecole radio-marcate, evitando l'esposizione a radiazioni ionizzanti ripetitiva . Risonanza magnetica funzionale (fMRI) è ampiamente utilizzato in ambiente di ricerca e clinica, dove è generally combinato con un compito psico-motoria. phMRI è un adattamento del fMRI che consente lo studio di un sistema neurotrasmettitore specifico, come la serotonina (5-HT), in condizioni fisiologiche o patologiche dopo l'attivazione tramite somministrazione di un farmaco specifico impegnativo.
L'obiettivo del metodo qui descritto è di valutare cervello 5-HT funzione in free-respirazione animali. Sfidando il 5-HT sistema, mentre allo stesso tempo l'acquisizione di immagini di risonanza magnetica funzionale nel corso del tempo, la risposta del cervello a questa sfida può essere visualizzato. Diversi studi su animali hanno già dimostrato che il farmaco-indotto un aumento dei livelli extracellulari di esempio 5-HT (distaccanti, selettivi del re-uptake bloccanti, ecc) evocano regionali specifici cambiamenti nel livello di ossigenazione del sangue segnali MRI dipendenti (BOLD) (segnale dovuto ad una variazione dei livelli emoglobina ossigenata / deossigenata si verificano durante l'attivazione del cervello attraverso un aumento dell'apporto ematico per fornire l'ossigeno e glucose ai neuroni esigenti) fornendo un indice di funzione neurotrasmettitore. È stato inoltre dimostrato che questi effetti possono essere invertito trattamenti che diminuzione 5-HT disponibilità 16,13,18,7. In ratti adulti, i cambiamenti segnale BOLD acuta dopo somministrazione degli SSRI sono stati descritti in diversi 5-HT regioni del cervello collegate, vale a dire le aree corticali, ippocampo, ipotalamo ed il talamo 9,16,15. La stimolazione del sistema 5-HT e la sua risposta a questo problema può essere quindi usato come una misura della sua funzione sia negli animali e nell'uomo 2,11.
Preparazione per l'animale in vivo RMN
1. Incannulamento chirurgico
2. Monitoraggio
Durante l'intera procedura di imaging, varie risposte fisiologiche devono essere continuamente monitorati ed essere quanto più costante possibile. Ciò è essenziale, dal momento che queste risposte possono variare notevolmente sopra la finestra tempo stesso segnale phMRI e anche influenzare il segnale di interesse. È altresì importante, dato che l'animale viene posto in MAGNet ed è quindi fuori dalla vista e non suscettibili di controlli standard della profondità dell'anestesia (tep per esempio pinch), per garantire un'adeguata profondità dell'anestesia. Inoltre, dato che molti farmaci modificare i parametri cardiovascolari come la pressione sanguigna, la misurazione di questi è fondamentale per garantire possa tener conto di effetti fisiologici a livello mondiale di azione del farmaco nei dati phMRI. Vedere anche la sezione 4 per i valori di base e le risposte attese alla infusione di 5 mg / kg fluoxetina.
In vivo imaging
Una rappresentazione schematica della configurazione fMRI sperimentale è data in Figura 2.
3. Parametri di imaging
Elaborazione dei dati
4. Le risposte fisiologiche
Attesi risposte fisiologiche alla sfida dipendono dal farmaco scelto. Di seguito, i valori di base generalmente accettati (su ratti maschi adulti) e le risposte attese alla infusione endovenosa di 5 mg / kg fluoxetina sono dati.
5. Pre-elaborazione dei dati MRI
Qui si descrive diverse fasi della pre-elaborazione dei dati di RM, al fine di optimalize i dati per l'analisi statistica. Citiamo gli strumenti che vengono utilizzati nel nostro laboratorio, tuttavia molti strumenti differenti sono disponibili.
5,1 preparazione dei dati
5,2 movimento di correzione
5,3 cervello segmentazione
6. Dati l'analisi dells
Obiettivo dell'analisi statistica dei dati MR è quello di determinare i voxel che presentano varianza aggiuntiva imputabile alla sfida della droga in modo statisticamente robusto. Diversi approcci metodologici sono disponibili per questo, anche se i pacchetti software numerabili. La scelta effettuata è dipendente dalla disponibilità di software e della conoscenza / esperienza al vostro laboratorio e la domanda di ricerca specifica. Qui diamo un metodo suggerito come viene utilizzato nel nostro laboratorio.
6,1
6,2
Il passo successivo è quindi quello di verificare statisticamente la prima serie di immagini in tempo 4D di ogni animale contro il precedente modello GLM stabilito. Per questo, abbiamo usato il programma FEAT FSL (FMRI Strumento di analisi di esperti, v5.98) 17,24. Tuttavia, altri strumenti di analisi fMRI sono dispobile pure. All'interno dello strumento di analisi, un'analisi di primo livello deve essere istituito. Ciò richiede i seguenti passaggi:
6,3
Dopo questo, gli primo livello analisi di tutti gli animali possono essere combinati in di livello superiore (gruppo) analisi statistiche. Questo è strettamente dipendente al proprio disegno dello studio proprio e domande di ricerca.
6,4
Risposte farmacologiche fisiologici possono essere accoppiati o correlato al segnale MR, se desiderato. Vedere anche la sezione 6.2.3 sull'aggiunta di confondere EV.
7. Risultati rappresentativi
ove_content "> Quando il farmaco stimolante (5 mg / kg iv fluoxetina) entra nel sistema vascolare, una risposta chiara fisiologico indicato dovrebbe essere visibile nella frequenza respiratoria (up) e la pressione sanguigna (in basso). Queste risposte normalizzarsi in media entro 5-10 minuti . In figura 3 la caduta della pressione sanguigna è chiaramente visibile.La media andamento nel tempo del segnale dovrebbe mostrare una linea di base relativamente stabile e un chiaro effetto della sfida. Preferibilmente, non ci dovrebbe essere sfida-indipendente deriva nel segnale. Un esempio rappresentativo di un corso di tempo medio di segnale può essere visto in figura 5A. Artefatti, quali depressione respirazione / guasto o modifiche anestesia sono spesso chiaramente visibili nel segnale. La depressione respiratoria influenzerà negativamente il segnale in tutto il cervello. Questo può essere visto in Figura 5B.
Dopo analisi primo livello, il pattern di attivazione dovrebbe essere principalmente positivo e locaTed in regioni determinate solo (cioè aree della corteccia, ippocampo, ipotalamo ed il talamo, vedi Figura 6A). Se l'intero cervello è disattivato, questo è spesso un'indicazione di anestesia troppo profonda e / o carenza di ossigeno durante la scansione. Un esempio di questo può essere visto in Figura 6B.
Figura 1. Posizione di posizionamento delle cannule nell'arteria femorale e vena.
Figura 2 Rappresentazione schematica della configurazione MRI;. Tutta l'apparecchiatura deve essere non ferromagnetico ed è collegato ad un sistema modulare che permette l'acquisizione di immagini gated evitando interferenze da moto dovuto alla respirazione e / o battito cardiaco. La temperatura corporea viene regolata tramite un modulo di riscaldamento per monitorare e controllare la temperatura degli animali durante l'imaging. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 3. Esempio rappresentativo di dati di pressione del sangue. Vi è una netta diminuzione della pressione sanguigna visibile direttamente dopo l'inizio dell'infusione (barra rossa). I valori normali sono raggiunti nuovamente entro 10 min. dopo la somministrazione sfida.
Figura 4. A) pattern di attivazione prevista utilizzando il programma di analisi MRI Stimolare (il rosso è l'attivazione positiva, il blu è l'attivazione negativo). B) Corso Tempo medio di tutti i voxel attivati (variazione ≥ 1% rispetto al basale) in tutti gli animali. C) Esempio del modello GLM con conseguente FSL / FEAT. Click qui per ingrandire la figura.
Figura 5.
Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 6.
5-HT phMRI è uno strumento promettente per valutare la funzione dei neurotrasmettitori in animali in vivo. Visualizza la risposta del cervello ad un 5-HT sfida con la RM funzionale. MRI ha il grande vantaggio di avere una elevata risoluzione spaziale e non è necessario che l'iniezione di mezzo di contrasto o di molecole radio-marcate evitando così l'esposizione ripetuta alle radiazioni ionizzanti. Questa tecnica è applicabile sia in soggetti umani e animali, e quindi molto adatto per la ricerca traslazionale dei sistemi neurotrasmettitoriali e disturbi psichiatrici. La sua applicazione non è ovviamente limitato al 5-HT percorso ed è già stata ampiamente utilizzata per valutare gli effetti di farmaci dopaminergici sia negli animali e nell'uomo 5,15 22.
Tuttavia, phMRI in piccoli animali rimane difficile, come già sottolineato in articoli di revisione da parte di Martin e Steward Sibson 11 e 20. Una di queste sfide è il mantenimento of stabili i parametri fisiologici durante l'acquisizione dell'immagine. La maggior parte degli anestetici può alterare la funzione cardiovascolare e dato che phMRI è criticamente dipendente sui parametri cardiovascolari / emodinamica è essenziale per garantire che i cambiamenti emodinamici sono esclusivamente attribuibili alla sfida dato farmaco. E 'quindi di vitale importanza che pCO 2 livelli rimangono costanti durante l'acquisizione di base. Ventilazione meccanica può per garantire la stabilità fisiologica, ed è spesso usato in questo tipo di esperimenti. Abbiamo però scelto di usare free-respirazione animali lasciare aperta la possibilità di effettuare studi longitudinali in futuro. Invece, ampiamente monitorato (e alterata) frequenza respiratoria e valori dei gas ematici per garantire la stabilità fisiologica all'interno dei normali intervalli prima di iniziare la scansione funzionale e in questo modo di mantenere stabile reattività vascolare e quindi T2 * / T2 segnale. La letteratura sugli effetti degli anestetici generali in materia di emodinamica cerebrale e metabolism è abbondante 20 e oltre la portata di questo manoscritto. Abbiamo scelto di usare l'anestesia gassosa con isoflurano ± 2% in questo specifico protocollo, perché con anestetici inalatori, la profondità dell'anestesia può essere rapidamente e facilmente controllabile. Questo è importante nella nostra configurazione per essere sicuri normali gamma stabili pCO 2 livelli prima dell'inizio della acquisizione delle immagini. Isoflurano è il più comunemente usato inalante anestetico oggi e permette una rapida induzione e recupero, che è importante per gli studi longitudinali. Produce anche minima depressione cardiovascolare e respiratoria e induce buon rilassamento dei muscoli scheletrici.
In secondo luogo, la somministrazione endovenosa del farmaco sfida è più complicata in piccoli animali che negli esseri umani. L'intervento che è necessario per l'incannulamento dell'arteria femorale e la vena richiede personale ben addestrato ed esperto. A causa di queste procedure invasive è momentaneamente principalmente utilizzati nelle procedure terminali. Tuttavia, il monitoraggio non invasivo della omeostasi sangue e vena iniezione di coda potrebbero essere utilizzati per studi longitudinali 23.
In aggiunta, ci sono alcune limitazioni di carattere più generale alla tecnica, che non sono specifici per animali phMRI. Inoltre, come sottolineato da Martin e Sibson 11, una confondere potenziale di tutti gli studi fMRI è che essa si assume che le variazioni dell'attività cerebrale evocata dalla sfida riflettono i cambiamenti nell'attività neuronale, piuttosto che periferici effetti sistemici. Soprattutto nelle strutture profonde del cervello, una comprensione relativamente povero di accoppiamento neurovascolare (rapporto tra i cambiamenti di attività neuronali e le variazioni emodinamiche) rimane. Studi di tipo eseguita da Logothetis 10 per determinare accoppiamento neurovascolare nella corteccia non sono ancora stati eseguiti in altre parti del cervello. È quindi noto che un aumento del segnale BOLD in strutture importanti come il corpo striato o amigdala è telling chi siamo l'attività neuronale. Il meglio potremmo dire in questo momento è che la regione del cervello reagisce alla sfida dato e che a seconda del trattamento e / o le condizioni, siamo in grado di monitorare i cambiamenti significativi della reattività del cervello. Questo può essere verificato in gran parte, cercando in entrambi i dati MRI e le risposte fisiologiche. Lo schema generale di attivazione cervello dovrebbe essere regione specifica e con limitato alle superfici, in questo caso, un elevato 5-HT innervazione, e non tanto una risposta generale vascolare. Inoltre, un diverso profilo temporale tra cambiamenti vascolari ed emodinamici è previsto. Considerando che le variazioni della pressione del sangue ritorneranno ai valori basali pochi minuti, l'effetto del farmaco sulla attivazione BOLD è nel caso di visibile fluoxetina fino alla fine della acquisizione dell'immagine e corrispondono alle note proprietà farmacocinetiche di questo farmaco. Infine, le risposte fisiologiche di tutti gli animali dovrebbero essere simili al fine di rendere inter-soggetto confronti. Nonetheless, è noto che un regolamento neurogena del flusso ematico locale da 5-HT esistono 4. Pertanto non si può escludere che variazioni locali di segnale BOLD possono attribuire ai cambiamenti vascolari dovute al rilascio di 5-HT nella vicinanza di navi. Sebbene questi effetti non sono associati a locali attivazione neuronale e possono pertanto essere considerate come falsi risultati positivi, è anche un indice del funzionamento complessivo specifico di 5-HT sistema (vedi anche 3).
Passi critici di questa tecnica sono quindi di monitorare risposte fisiologiche ampiamente e assicurarsi che le condizioni fisiologiche dell'animale sono stabili prima e durante l'acquisizione dell'immagine. Anche le condizioni di scanner deve essere il più stabile possibile ed esattamente lo stesso per ogni animale. La stabilità del segnale della sequenza deve essere verificata e confermata prima dell'inizio dell'esperimento. Inoltre, assicurarsi di avere sempre grandi abbastanza potenza statistica, anche con Grou soggetto piccolops. Per una bella recensione sulle considerazioni sperimentali di animali phMRI in generale, vedere Steward 20 e per un ulteriore esempio di un protocollo sperimentale per fMRI farmacologica nel ratto e nel topo, vedere la Ferrari 5.
Eventuali modifiche della tecnica qui descritti sono numerosi. Si potrebbe:
Quali scelte si fanno nel setup sperimentale è fortemente dipendente dalle possibilità di e / o l'esperienza all'interno del vostro laboratorio e il tipo di domanda di ricerca che si desidera rispondere.
Non abbiamo nulla da rivelare.
Questo lavoro è finanziato dall 'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) (no Veni. 916.86.125), assegnato a L. Reneman. Il finanziatore ha avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o la preparazione del manoscritto. Non ci sono conflitti di interesse.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nome del reagente / apparecchiatura | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
Isoflurano | ABBOTT Abbott Laboratories Ltd., Maidenhead, UK | No B506 | Mescolare con aria medicale |
Aria medicale | BOC Healthcare | ||
Riscaldamento pad | Harvard Apparatus | 507223F Sistema completo Blanket omeotermi con sonda flessibile, Medium, 230 VAC, 50 Hz | |
Silk l igature | http://www.harvardapparatus.com/ | 2-0 di seta nera intrecciata non assorbibile Num Cat 51-7631 | |
PE-50 Cannula | http://www.scientificlabs.co.uk/~~V | Portex tubi PE 0.58x0.96mm | 0,58 ID 0,96 millimetri OD |
Eparina sodica | Leo Laboratories Ltd, Bucks., UK | Eparina di sodio 1000IU/ml | 15 U / ml |
Tessuto adesivo Vetbond | 3M | ttp :/ / solutions.3m.co.uk/wps/portal/3M/en_GB/HealthCare/Home/ProdInfo/VetProducts / "target =" _blank "> M tessuto adesivo Vetbond | |
Sistema di controllo | SA Instruments | http://www.i4sa.com Modello sistema di monitoraggio 1025L | Monitor respirazione e la temperatura |
Trasduttore di pressione | BIOPAC Systems Corp | BLOOD TRASDUTTORE DI PRESSIONE - TSD104A MP150 SISTEMA DI ACQUISIZIONE DATI - WIN - MP150WSW | Monitor pressione arteriosa |
RapidLab sangue analizzatore di gas | Siemens Diagnostics | RAPIDLab 248/348 Sistemi | |
Animale scanner 4.7T | Agilent Technologies (precedentemente Magnex) 4.7T frequenza di 199,845 MHz | ||
MR letto stereotassico compatibile | m2m Imaging Corp | Rat letto: elemento PA Multi AHS 50-72-1003/100 | |
Bobina | m2m Imaging Corp | Volume TH / Rx RQD1 72/112 200 | |
Fluoxetina cloridrato | Sigma-Aldrich | F-132 | 5mg/kg in soluzione salina |
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