Method Article
Le but de cette technique est d'évaluer la fonction des neurotransmetteurs sérotonine (5-HT) chez l'animal vivant et libre-respiratoire avec l'imagerie par résonance magnétique pharmacologique (phMRI) et un défi par voie intraveineuse avec un inhibiteur sélectif du recaptage de la sérotonine (ISRS), la fluoxétine.
Pharmacologique IRM (phMRI) est une méthode nouvelle et prometteuse pour étudier les effets des substances sur le fonctionnement du cerveau qui peuvent finir par être utilisées pour élucider les mécanismes neurobiologiques sous-jacents derrière l'action des médicaments et des neurotransmetteurs troubles liés, comme la dépression et le TDAH. Comme la plupart des méthodes d'imagerie (TEP, SPECT, CT), il représente un progrès dans l'enquête sur les troubles du cerveau et de la fonction liée à des voies de neurotransmetteurs d'une manière non-invasive à l'égard de la connectivité globale neuronale. En outre, il fournit également l'outil idéal pour la traduction des investigations cliniques. IRM, alors que toujours en retard dans les stratégies d'imagerie moléculaire par rapport au PET et SPECT, a le grand avantage d'avoir une haute résolution spatiale et pas besoin de l'injection d'un agent de contraste ou de molécules radio-marquées, ce qui évite l'exposition répétée à des radiations ionisantes . L'IRM fonctionnelle (IRMf) est largement utilisé dans l'établissement de recherche et de clinique, où il est généralement combiné avec une tâche psycho-moteur. phMRI est une adaptation de l'IRMf permet de l'enquête d'un système de neurotransmetteur spécifique, tels que la sérotonine (5-HT), dans des conditions physiologiques ou pathologiques qui suivent l'activation via l'administration d'un médicament spécifique difficile.
L'objectif de la méthode décrite ici est d'évaluer le cerveau 5-HT dans la fonction libre-respiratoires des animaux. En remettant en question le système 5-HT, tout en acquérant des images IRM fonctionnelles au fil du temps, la réponse du cerveau à ce défi peut être visualisée. Plusieurs études chez l'animal ont déjà démontré que la drogue induit une augmentation des niveaux extracellulaires de par exemple 5-HT (agents de libération, sélectifs du recaptage de bloqueurs, etc) évoquent spécifiques à la région variations du niveau de l'oxygénation du sang (BOLD) signaux IRM (signal dû à un changement des taux d'hémoglobine oxygénée / désoxygénée survenant lors de l'activation du cerveau à travers une augmentation de l'approvisionnement en sang pour fournir de l'oxygène et glucose aux neurones exigeants) fournissant un indice de la fonction des neurotransmetteurs. Il a également été montré que ces effets peuvent être inversés par des traitements qui diminuent la 5-HT disponibilité 16,13,18,7. Chez les rats adultes, les changements suivants signal BOLD aiguë administration ISRS ont été décrites dans plusieurs 5-HT régions du cerveau liées, à savoir les zones corticales, l'hippocampe, hypothalamus et le thalamus 9,16,15. La stimulation du système 5-HT et de sa réponse à ce défi peut être ainsi utilisé comme une mesure de sa fonction dans les deux animaux et les humains 2,11.
Préparation des animaux in vivo pour l'IRM
1. Canulation chirurgicale
2. Surveillance
Au cours de la procédure d'imagerie tout entier, plusieurs réponses physiologiques doivent être constamment surveillés et être maintenue aussi constante que possible. Cela est essentiel, étant donné que ces réponses peuvent varier considérablement au cours de la fenêtre en même temps que le signal phMRI et affectent également le signal d'intérêt. Il est également important, étant donné que l'animal sera placé dans la MAgnet et est donc hors de la vue et ne se prêtent pas à des contrôles standards de profondeur de l'anesthésie (pincement de l'orteil, par exemple), pour assurer convenablement la profondeur de l'anesthésie. En outre, étant donné que de nombreux médicaments modifient les paramètres cardiovasculaires comme l'hypertension artérielle, la mesure de ceux-ci est essentielle pour assurer peut être tenu compte des effets globaux physiologiques de l'action du médicament dans les données phMRI. Voir aussi la section 4 pour les valeurs de référence et les réponses attendues à la perfusion de 5 mg / kg de fluoxétine.
L'imagerie in vivo
Une représentation schématique de l'installation expérimentale IRMf est donné dans la figure 2.
3. Paramètres d'imagerie
Informatique
4. Les réponses physiologiques
Attendus réponses physiologiques à l'défi dépendent de la drogue choisie. Ci-dessous, les valeurs de référence généralement reconnus (des rats mâles adultes) et les réponses attendues à la perfusion iv de 5 mg / kg la fluoxétine sont donnés.
5. Les données de prétraitement IRM
Nous décrivons ici les différentes étapes du prétraitement des données de résonance magnétique afin d'optimaliser les données pour l'analyse statistique. Nous mentionnons les outils qui sont utilisés dans notre laboratoire, mais de nombreux outils différents sont disponibles.
5.1 La préparation des données
5.2 Correction de mouvement
5,3 segmentation du cerveau
6. Données Analysis
Objectif de l'analyse statistique des données MR est de déterminer les voxels qui présentent variance supplémentaire attribuable à relever le défi de drogue d'une manière statistiquement robuste. Diverses approches méthodologiques sont disponibles pour ce, même sous forme de paquets logiciels innombrables. Le choix que vous faites dépend de la disponibilité des logiciels et des connaissances / expérience à votre laboratoire et votre question de recherche spécifique. Ici, nous donnons une méthode suggérée que celle utilisée dans notre laboratoire.
6.1
6.2
La prochaine étape est donc de tester statistiquement l'image brute 4D séries chronologiques de chaque animal par rapport au modèle GLM établi précédente. Pour cela, nous avons utilisé le programme de FLS FEAT (IRMF outil d'analyse d'experts, v5.98) 17,24. Toutefois, d'autres outils d'analyse IRMf sont disponible aussi bien. Dans l'outil d'analyse, une analyse de premier niveau doit être mis en place. Cela nécessite les étapes suivantes:
6.3
Après cela, les analyses de premier niveau de tous les animaux peuvent être combinés dans échelons supérieurs (groupe) des analyses statistiques. Cela est très dépendante de la conception de votre propre étude et les questions de recherche.
6.4
Réponses physiologiques de médicaments peut être couplé ou lié au signal MR, si on le souhaite. Voir aussi la section 6.2.3 sur l'ajout de confondre EV.
7. Les résultats représentatifs
ove_content "> Lorsque le médicament stimulant (5 mg / kg iv fluoxétine) pénètre dans le système vasculaire, une réponse claire physiologique doit être visible dans le taux de respiration (en haut) et la pression artérielle (en bas). Ces réponses normaliser en moyenne dans les 5-10 min . Dans la figure 3 de cette baisse de la pression artérielle est clairement visible.Le cours moyen du signal de temps devrait montrer un niveau de référence relativement stable et un effet évident de relever le défi. De préférence, il devrait y avoir aucune dérive défi-indépendante dans le signal. Un exemple représentatif d'une évolution dans le temps moyen du signal peut être vu dans la figure 5A. Les artefacts, tels que la dépression respiratoire / échec ou des modifications en matière d'anesthésie sont souvent clairement visibles dans le signal. La dépression respiratoire affectera négativement le signal dans le cerveau tout entier. Cela peut être vu sur la figure 5B.
Après analyse de premier niveau, le modèle d'activation devrait être essentiellement positive et de localisationTed dans des régions spécifiques seulement (c.-à-aires corticales, l'hippocampe, l'hypothalamus et le thalamus; voir la figure 6A). Si l'ensemble du cerveau est désactivé, ce qui est souvent une indication de l'anesthésie trop profonde et / ou manque d'oxygène lors de la numérisation. Un exemple de ceci peut être vu dans la figure 6B.
Figure 1. Lieu du stage des canules dans l'artère et la veine fémorales.
Figure 2 Représentation schématique de l'installation IRM;. Tout le matériel doit être non-ferromagnétique et est relié à un système de module qui permet l'acquisition d'images gated éviter les interférences de mouvement dû à la respiration et / ou battement de coeur. La température du corps est également régie par un module de chauffage pour surveiller et contrôler la température des animaux lors de l'imagerie. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. Exemple représentatif des données de pression artérielle. Il ya une nette diminution de la pression artérielle visible directement après le début de la perfusion (barre rouge). Les valeurs normales sont de nouveau atteint moins de 10 min. après l'administration défi.
Figure 4. Un modèle) d'activation prévue en utilisant le programme d'analyse IRM Stimuler (le rouge est d'activation positive, le bleu est l'activation négative). B) Bien sûr le temps moyen de tous les voxels activés (changement ≥ 1% par rapport au départ) chez tous les animaux. C) Exemple du modèle GLM résultant en FLS / FEAT. Cleuillez ici pour voir plus grand chiffre.
Figure 5.
Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 6.
5-HT phMRI est un outil prometteur pour évaluer la fonction des neurotransmetteurs chez les animaux in vivo. Il visualise la réponse du cerveau à un défi 5-HT avec une RM fonctionnelle imagerie. IRM a le grand avantage d'avoir une haute résolution spatiale et pas besoin de l'injection de produit de contraste-agent ou molécules radio-marquées, évitant ainsi l'exposition répétée à des radiations ionisantes. Cette technique est applicable chez les sujets à la fois humaines et animales et donc très adapté à la recherche translationnelle des systèmes de neurotransmetteurs et de troubles psychiatriques. Son application n'est bien sûr pas limitée à la voie de la 5-HT et a déjà été largement utilisé pour évaluer les effets des médicaments dopaminergiques dans les deux 5,15 animaux et les humains 22.
Néanmoins, phMRI chez les petits animaux reste difficile, comme déjà souligné dans des articles d'examen par Martin et Sibson 11 et Steward 20. Un de ces défis est le o de maintenancef stables paramètres physiologiques au cours de l'acquisition d'images. La plupart des anesthésiques peut altérer la fonction cardio-vasculaire et étant donné que phMRI dépend de manière critique sur les paramètres cardiovasculaires / hémodynamique, il est essentiel de s'assurer que toutes les modifications hémodynamiques sont attribuables uniquement à relever le défi médicament donné. Il est donc extrêmement important que pCO 2 niveaux restent constants lors de l'acquisition de référence. La ventilation mécanique peut pour aider à assurer la stabilité physiologique, et est souvent utilisé dans ce type d'expériences. Nous avons cependant choisi d'utiliser de libre-respiratoires des animaux de laisser ouverte la possibilité d'effectuer des études longitudinales dans le futur. Au lieu de cela, nous avons longuement surveillé (et modifié) le taux de respiration et les valeurs des gaz du sang pour assurer la stabilité physiologique dans les limites normales avant le début du balayage fonctionnelle et de cette façon afin de préserver la réactivité vasculaire stable et donc T2 * / T2 signal. Littérature sur les effets des anesthésiques généraux sur l'hémodynamique cérébrale et metabolism est abondante 20 et au-delà de la portée de ce manuscrit. Nous avons choisi d'utiliser l'anesthésie au gaz à ± 2% d'isoflurane dans ce protocole spécifique, car avec des anesthésiques par inhalation, la profondeur de l'anesthésie peut être rapidement et facilement contrôlable. Ceci est important dans notre configuration pour assurer normales gamme stables pCO 2 niveaux avant le début de l'acquisition de l'image. L'isoflurane est l'inhalation le plus couramment utilisé aujourd'hui anesthésie et permet une induction rapide et la récupération, ce qui est important pour les études longitudinales. Il produit également un minimum de dépression cardiovasculaire et respiratoire et induit la relaxation des muscles squelettiques bonne.
Deuxièmement, l'administration intraveineuse du médicament stimulant est plus compliqué chez les petits animaux que chez les humains. La chirurgie qui est nécessaire pour la canulation de l'artère et la veine fémorales exige un personnel bien formé et expérimenté. En raison de ces procédures invasives, il est pour le moment essentiellement utilisés dans des procédures terminales. Cependant, la surveillance non invasive de l'homéostasie du sang et l'injection veine de la queue peut être utilisé pour des études longitudinales 23.
En outre, il existe certaines limitations plus générales à la technique, qui ne sont pas spécifiques pour les animaux phMRI. En outre, comme l'a souligné Martin et Sibson 11, un potentiel de confondre de toutes les études d'IRMf, c'est que l'on suppose que les changements dans l'activité cérébrale évoquée par le défi de refléter les changements dans l'activité neuronale plutôt que des effets systémiques périphériques. Surtout dans les structures cérébrales plus profondes, une compréhension relativement faible de couplage neurovasculaire (relation entre les changements d'activité neuronale et les changements hémodynamiques) reste. Les études de ce genre effectuée par Logothetis 10 pour déterminer le couplage neurovasculaire dans le cortex n'ont pas encore été effectuée dans d'autres parties du cerveau. Il est donc inconnue ce une augmentation du signal BOLD dans les structures importantes telles le striatum ou amygdale est Telling nous au sujet de l'activité neuronale. Le mieux que nous pourrions dire à ce moment, c'est que la région du cerveau réagit à relever le défi donné et que, selon le traitement et / ou des conditions, nous pouvons surveiller les changements importants de la réactivité du cerveau. Cela peut largement être vérifié en regardant à la fois les données de l'IRM et les réponses physiologiques. Le schéma général de l'activation cérébrale devrait être la région spécifique et limité à des zones avec, dans ce cas, une forte innervation 5-HT, et non comme beaucoup une réponse générale vasculaire. En outre, un profil temporel différent entre les changements vasculaires et hémodynamiques est attendue. Considérant que les changements de pression sanguine revenir à leurs valeurs de base en quelques minutes, l'effet de la drogue sur l'activation BOLD est dans le cas de la fluoxétine visible jusqu'à la fin de l'acquisition de l'image et correspondent à des propriétés pharmacocinétiques connaissent de ce médicament. Enfin, les réponses physiologiques de tous les animaux devraient être similaires dans le but de faire des comparaisons inter-disciplinaires. Nonetheleart, il est connu que d'un règlement neurogène de la circulation sanguine locale par 5-HT existent 4. Par conséquent, il ne peut pas être exclu que des changements locaux de signal BOLD peut attribuer à des changements vasculaires dues à la libération de 5-HT à la proximité des vaisseaux. Bien que ces effets ne sont pas associés à l'activation neuronale locale et peut donc être considéré comme faux résultats positifs, il est également un indice de la fonction globale spécifique du système 5-HT (voir aussi 3).
Les étapes critiques de cette technique sont donc à surveiller les réponses physiologiques largement et à faire en sorte que les conditions physiologiques de l'animal sont stables avant et pendant l'acquisition d'image. Aussi les conditions de scanner doit être aussi stable que possible et exactement le même pour chaque animal. La stabilité du signal de votre séquence doit être vérifiée et confirmée avant le début de votre expérience. En outre, assurez-vous d'avoir toujours assez de puissance statistique importante, même avec Grou petit sujetps. Pour une belle revue sur les considérations expérimentales d'animaux phMRI en général, voir Steward 20 et pour un exemple supplémentaire d'un protocole expérimental pour l'IRMf pharmacologique chez le rat et la souris, voir Ferrari 5.
Les modifications possibles de la technique décrites ici sont nombreux. On pourrait:
Quels choix que vous faites dans le dispositif expérimental est fortement dépendante des possibilités et / ou l'expérience au sein de votre laboratoire et le type de question de recherche que vous souhaitez répondre.
Nous n'avons rien à communiquer.
Ce travail est financé par l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO) (pas de Veni. 916.86.125), attribué à L. Reneman. Le bailleur de fonds n'a joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte de données et l'analyse, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Il n'y a pas de conflits d'intérêts.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nom du réactif / équipements | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
L'isoflurane | ABBOTT Abbott Laboratories Ltd, Maidenhead, Royaume-Uni | Pas de B506 | Mélanger avec l'air médical |
Air médical | BOC Healthcare | ||
Coussin chauffant | Harvard Apparatus | 507223F Système complet de couverture homéothermes avec sonde flexible, Moyen, 230 VAC, 50 Hz | |
Soie l igature | http://www.harvardapparatus.com/ | 2-0 soie noire tressée non résorbable Cat Num 51-7631 | |
PE-50 Canule | http://www.scientificlabs.co.uk/~~V | Portex tubes PE 0.58x0.96mm | 0,58 0,96 OD ID mm |
L'héparine sodique | Leo Laboratories Ltd, Bucks., Royaume-Uni | 1000IU/ml héparine sodique | 15 U / ml |
Adhésif tissulaire Vetbond | 3M | ttp :/ / solutions.3m.co.uk/wps/portal/3M/en_GB/HealthCare/Home/ProdInfo/VetProducts / "target =" _blank "> adhésives M tissus Vetbond | |
Système de surveillance | SA Instruments | http://www.i4sa.com Système de surveillance du modèle 1025L | La respiration et la température Moniteurs |
Capteur de pression | Systèmes Corp Biopac | CAPTEUR DE PRESSION DU SANG - TSD104A MP150 SYSTÈME D'ACQUISITION DE DONNEES - WIN - MP150WSW | La pression artérielle Moniteurs |
Analyseur des gaz du sang Rapidlab | Siemens Diagnostics | Rapidlab 248/348 Systems | |
Scanner animale 4,7 T | Agilent Technologies (anciennement Magnex) Fréquence 4,7 T 199,845 MHz | ||
Lit MR stéréotaxique compatible | m2m Imaging Corp | Lit Rat: PA élément multi PAPA 50-72-1003/100 | |
Bobine | m2m Imaging Corp | TH Volume / Rx RQD1 72/112 200 | |
Chlorhydrate de fluoxétine | Sigma-Aldrich | F-132 | 5mg/kg dans une solution saline |
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