Recolección y enfriamiento Cryo-cristales de proteínas de membrana cultivadas en mesofases lipídicas para la Determinación de la estructura por cristalografía macromolecular

Resumen

En este documento se describen procedimientos implementados en la membrana Caffrey Estructural y Biología Grupo funcional a los cristales de la cosecha y crio cool-proteína de membrana lipídicas se cultivan en las fases cúbicas y una esponja para su uso en la determinación de estructura macromolecular usando cristalografía de rayos X.

Resumen

Una ruta importante para la comprensión de cómo las proteínas funcionar a un nivel mecanístico es tener la estructura de la proteína diana disponible, idealmente en la resolución atómica. Actualmente, sólo hay una manera de capturar información tal como se aplica a proteínas de membrana integral (Figura 1), y los complejos se forman, y que el método es macromolecular cristalografía de rayos X (MX). Para hacer MX cristales de calidad de difracción que se necesitan, en el caso de proteínas de membrana, no se forman fácilmente. Un método para la cristalización de proteínas de membrana que incluye el uso de mesofases lipídicas, específicamente las fases cúbicas y esponja ^1-5, ha ganado considerable atención de tarde debido a los éxitos que ha tenido en el campo de receptor acoplado a proteína G ^6-21 ( www . mpdb.tcd.ie ). Sin embargo, el método, en adelante referido como el método en meso o lipídica fase cúbica, viene con su propio técnicodesafíos. Éstos se producen, en parte, debido a la naturaleza generalmente viscosa y pegajosa de la mesofase lipídica en la que los cristales, que son a menudo micro-cristales, crecen. Manipular cristales se vuelve difícil como resultado y tan particularmente durante la cosecha ^22,23. Los problemas se presentan también en la etapa que precede a la cosecha que requiere que las placas sándwich de vidrio en el que los cristales crecen (Figura 2) ^24,25 se abre para exponer el bolo mesofase, y los cristales de la misma, para la cosecha, crio-enfriamiento y X eventuales La difracción de rayos recogida de datos.

Las variantes de mesofase cúbicos y esponja (Figura 3) desde el que los cristales deben ser cosechadas tienen reologías ^4,26 profundamente diferentes. La fase cúbica es viscoso y pegajoso similar a una pasta de dientes de espesor. Por el contrario, la fase de esponja es más fluida con una clara tendencia a fluir. En consecuencia, los diferentes enfoques para la apertura de pozos de cristalización containing cristales que crecen en la fase cúbica y la esponja se llaman para como de hecho se requieren diferentes métodos para la recolección de los cristales de los dos tipos de mesofase. Los protocolos para hacer precisamente eso se han ido perfeccionando y aplicado en la membrana de Biología Estructural y Funcional (MS & FB) Group, y se describen en detalle en este artículo Jove (Figura 4). Se dan ejemplos de situaciones en las que los cristales son cosechadas con éxito y crio-enfriado. También proporcionamos ejemplos de casos en los que surgen problemas que conducen a la pérdida irrecuperable de cristales y describir cómo estos problemas pueden ser evitados. En este artículo se proporciona el Visor con instrucciones paso a paso para la apertura de pozos de cristalización de vidrio sándwich, para la cosecha y para la crio-enfriamiento cristales de proteínas de membrana que crecen en cúbico y en las fases de esponja.

Protocolo

1. Laboratorio Set-up Pre-cosecha

1. En preparación para la cosecha, llenar la espuma seca Dewar con nitrógeno líquido y ponedlo al lado del microscopio donde la recolección se llevará a cabo.
2. Sumerja el disco de almacenamiento, extremo abierto hacia arriba, en el nitrógeno líquido en el interior del Dewar espuma y deje que se enfríe por completo.
3. Asegurar un micro-montaje de un tamaño que coincida con el cristal que se recogerá en una varita magnética (Figura 5). Es importante tener a mano un número de repuesto varitas magnéticas precargado con micro-soportes para atender situaciones en las que es necesario cosechar varios cristales de la que bolo. Varitas de repuesto deben estar disponibles en todo momento.
4. Colocar una micropipeta, puntas y la solución precipitante que se usó para el crecimiento de cristales junto a la cosecha microscopio. Puede ser necesaria para cubrir la mesofase y para evitar el secado cuando el bien se abre.
5. Tenga un cuaderno y una pluma en el banco cerca y / oabrir el ordenador. Estos serán utilizados para registrar las observaciones relativas a la calidad, aspecto, ubicación, número de almacenamiento disco, etc, de los cristales a medida que se recogen, se crio-enfriado y se colocó en almacenamiento.
6. Si un asistente está disponible para ayudar con la cosecha que persona debe entender claramente el protocolo que se siguió, el orden en el que los diversos pasos se llevará a cabo, y su papel en el proceso general.

Con todos los materiales y equipos en su lugar nuestra siguiente tarea consiste en:

2. Identificar las placas y pozos que contienen cristales

1. El método más simple y directa de encontrar cristales cosechables es la inspección de los pozos a mano utilizando un microscopio con normalidad y con luz polarizada cruzada. Ajuste de la intensidad de luz de iluminación del microscopio puede ayudar a localizar los cristales.
2. Alternativamente, un reproductor de imágenes, donde las placas se seleccionan automáticamente con normal y cruzarse polarizand luz, se puede utilizar para buscar cristales.
3. Valorar con ojo registra imágenes digitales en una pantalla de ordenador.
4. Detalle claramente los pozos con cristales para la recolección y registro de comentarios sobre el tamaño, la calidad y la ubicación de los cristales en la mesofase en el ordenador portátil o en un ordenador.
5. Retire la placa que contiene cristales se recogerá a partir de imágenes.

3. La apertura de un bien con mesofase cúbico. Método 1

Las placas en las que crecen los cristales por el método de meso son placas de vidrio de sándwich (figura 2). Con el fin de acceder a la mesofase y los cristales de su interior, es necesario abrir el pozo. Esto se hace mediante el uso de una herramienta de corte de vidrio para cortar el cubreobjetos superior que sella el pozo que puede entonces ser retirado.

Existen varios enfoques para cortar y retirar el cubreobjetos de más de una cristalización bien. El uno para utilizar está dictada por la o Tipof mesofase en la que el cristal se encuentra en crecimiento. Esto puede ser la fase cúbica muy viscosa y pegajosa (Figura 3A) o su variante más fluido, la fase de esponja (Figura 3B). En este artículo de vídeo se muestra cómo abrir pozos, y para recoger los cristales de ambos materiales de alojamiento.

1. Coloque el sándwich de vidrio de placa de cristalización en el escenario de un microscopio de luz.
2. Uso de una herramienta de corte de vidrio puntuación ligeramente el cubreobjetos con dos círculos concéntricos situados por encima del espaciador y justo fuera del perímetro del pozo. Con una herramienta de corte nueva puntuación requiere una presión mínima aplicada. Vuelva a colocar la herramienta por una nueva cuando la presión necesaria para anotar aumenta aún fraccionada, lo que suele ocurrir después de abrir 10 pozos.
3. Romper el vidrio en el espacio entre los dos círculos marcados con el fin de liberar el cubreobjetos interior. Esto genera gran cantidad de fragmentos de vidrio y polvo. Borrar a la basura con un hisopopapel toalla.
4. Eliminar el cubreobjetos liberado agarrándolo con unas pinzas de punta fina y la inclinación lejos de y fuera del pozo. En este caso, la fase cúbica permanece pegada y en su lugar sobre la placa de base del pozo.
5. Acerca la imagen para obtener una vista más clara de la mesofase cúbico que ya está listo para su uso en la cosecha cristal.

4. La apertura de un pozo con mesofase cúbico. Método 2

1. Uso de la herramienta de corte de vidrio puntuación de líneas rectas paralelas en el cubreobjetos a un lado del pozo y que se extienden a través de la misma también. Esto permite un acceso más fácil a las pinzas y la retirada del cubreobjetos.

En esta demostración particular, el cubreobjetos grietas en liberar el cubreobjetos de la superficie del espaciador pegajoso. En el proceso, el cubreobjetos se desplaza en posición y el precipitado se separa de la fase cúbica. Cuando el cubreobjetos se levantó algunos de precipitante va con ella. Nos quedamos con un b expuestosOLUS de mesofase sin precipitante circundante. Inmediatamente, añadir 1 l precipitante fresco en la parte superior del bolo utilizando una micropipeta para evitar que la mesofase se seque y experimentando un cambio de fase que puede dañar los cristales. El bolo está ahora listo para ser usado en la recolección de cristal.

5. La apertura de un bien con la Fase Esponja. Sin éxito

La fase de esponja es menos indulgente para trabajar con debido a su capacidad de flujo. Si que los resultados de flujo en la fase de esponja en contacto con el perímetro de la capilaridad y ayudarán a eliminar la mesofase y los cristales se perderá. Un ejemplo de que esto ocurra se muestra en este video clip.

1. Captura de la fase esponja y alternar entre la luz polarizada normal y cruzado para localizar los cristales en la fase de esponja.
2. En la preparación para abrir el marcador y así cortar el cubreobjetos como se describe en la Sección 3. En el proceso, el cubreobjetos grietas. En el intento deING para abrir el bien los cambios precipitantes en la dirección de la grieta y, finalmente, entra en contacto con el espaciador. Con el precipitante en cierta fase de la esponja y de su carga de cristales que se han perdido.

En esta secuencia particular, los polarizadores en el microscopio no está completamente cruzado y los cristales pueden ser vistas como objetos brillantes en el mismo tiempo que el pozo y su contenido permanece visible.

6. La apertura de un bien con la Fase Esponja. Con éxito

1. Captura de la fase esponja e identificar un cristal, tanto en luz polarizada normal y cruzado.
2. Score, cortar y remover una sección de cubreobjetos cubriendo el bien, como en la sección 4.1. Luz polarizada cruzada incompleta se utiliza para realizar un seguimiento del cristal.
3. Introducir un trozo de papel de seda seco a través de la abertura en el cubreobjetos y en el pozo hasta que toque la solución precipitante. Wick lejos la solución de cuidadomente hasta que esté casi todo se ha ido y luego retire el tejido. Esto hace que el precipitante restante y la fase de esponja, con el cristal todavía en su lugar, para retraer bajo el cubreobjetos.
4. Puntuación, cortar y retirar con una pinza el resto del cubreobjetos, como en la sección 4,1. En este caso, la fase de esponja se divide; algunos restos en el pozo y se pega a algunos que el cubreobjetos. El cristal está en el bolo en el cubreobjetos. Debido a que hay presente precipitante muy poco, la fase de esponja empieza a sufrir una transición de fase probablemente debido a la desecación. Esto puede ser visto como un anillo de birrefringencia que migra hacia el centro del bolo. Añadir inmediatamente precipitante para el bolo de detener la transición. El bolo está ahora listo para su uso en la recolección de cristal.

7. La recolección y Cristales Cryo-enfriamiento de la fase cúbica

1. Ir y venir entre la luz polarizada normal y cruzado para localizar los cristales en bolo fase cúbica en el pozo abierto. En tsu secuencia de vídeo hasta cuatro cristales birrefringentes se puede ver en las bolo fase cúbica con luz polarizada cruzada.
2. Utilice una. Montado crio-bucle (Figura 5) para sondear la mesofase recién expuesto para cristales, cristales para pescar y luego para sumergirlos, contenida en el crio-bucle, en nitrógeno líquido en el Dewar inmediatamente después de la cosecha Idealmente, la cosecha y el complemento de enfriamiento debería ocurrir en un movimiento continuo y rápido. Como mesofase poco nulidad aproximándose lo posible deben ser cosechados con el cristal. En nuestra experiencia, la crio-protector no se necesita con meso-cultivadas en cristales.
3. Dado que no es posible mirar por el cristal en la crio-bucle inmediatamente después de la cosecha inspeccionar el bolo mesofase utilizado para la recolección para verificar que el cristal ya no está allí lo que sugiere que fue extraído con éxito.

8. Cosecha y Cryo-enfriamiento cristales de la fase de esponja

1. Ir y venir entre la luz polarizada normal y cruzado para localizar cristales en la fase de bolo esponja en el pozo abierto. En esta secuencia de vídeo de muchos cristales birrefringentes se puede ver en el bolo bajo luz polarizada cruzada.
2. Utilice una. Montado crio-bucle (Figura 5) para pescar cristales de la fase de esponja y para sumergirlos, contenida en o sobre el cryoloop, en nitrógeno líquido en el Dewar inmediatamente después de la cosecha Al igual que con la recolección en la fase cúbica, idealmente, el proceso de crio-enfriamiento debe suceder inmediatamente el cristal se recogieron con el menor tiempo posible transcurrido entre el evento y la cosecha real inmersión en nitrógeno líquido. Tan poco fase de adhesión esponja de lo posible deben ser cosechados con el cristal. Como se ha señalado, la crio-protector no es necesaria con en meso-crecido cristales.

9. Almacenamiento de cristales en Dewars

1. Después de haber sumido al circuito montado en líquido nitrogen colocarlo en una de las ranuras de fijación de la pastilla de almacenamiento en el Dewar espuma. Todas las manipulaciones se realizan con el lazo, la parte superior de la varilla magnética y disco de la sumerge en nitrógeno líquido.
2. Anote la ubicación y los detalles de la cosechada y cristal crio-enfriado en el bloc de notas y / o en el equipo.
3. Cuando el disco en el Dewar espuma está llena o el día de recolección, para la transferencia se completa el disco en un soporte de disco de lado en un almacenamiento o un transporte Dewar llena con nitrógeno líquido. Los cristales pueden ser enviadas en Dewars transporte a la instalación de sincrotrón para la difracción de recolección de datos.

10. Los resultados representativos

Los objetivos de los ejercicios de recolección y enfriamiento crio-demostrado aquí son para transferir un cristal de la mesofase de alojamiento en crio-bucles, para vitrificar el cristal de bucle y para colocarlo en el almacenamiento en nitrógeno líquido en un Dewar. La situación ideal es cuando la cosecha y la cryo-enfriamiento se realiza de tal manera que la calidad de difracción del cristal se conserva en el proceso. Como mesofase menos posible deben cosecharse con el cristal. Esto se hace para localizar el cristal y el centrado en el haz de rayos X que mucho menos difícil, para acelerar la crio-refrigeración con el fin de vitrificación, y para minimizar la dispersión de fondo de interferir la mesofase durante la recolección de datos de difracción. Algunos ejemplos de crio-refrigerados muestras en las que se puede y no el cristal puede ser visto se muestra en la Figura 6. Cuando el cristal no puede ser visto por el ojo normalmente es necesario recurrir a barrido de difracción con el fin de encontrar el cristal y centrarlo en el haz durante la recopilación de datos ^27.

Figura 1. Representación esquemática de una membrana biológica que muestra la bicapa lipídica y en el que are encuentra una variedad de proteínas.

Figura 2. A plena carga y sellado de 96 pocillos placa de vidrio sándwich cristalización. Cada pocillo contiene 50 nl fase cúbica y una solución precipitante l. Para mayor claridad, la fase cúbica se ha manchado con el rojo Sudán y la solución precipitante incluye azul de metileno. De la referencia 5.

Figura 3. Cristales de proteínas de membrana que crecen en la mesofase lipídica. Una. La fase cúbica con un cristal de la bacteriorodopsina a partir de H. halobium. B. La esponja que contiene una fase cristalina de la BtuB vitamina B12 receptor / transportista,, a partir de E. coli. De la referencia 25. Las fases cúbicas y una esponja contrastantes appearances como es evidente por la comparación de los paneles A y B. La fase cúbica en su A es extremadamente viscosa y mantiene la forma original. No fluye. Esto es particularmente evidente en los bordes de los bolo de mesofase que tienen una apariencia rugosa. Por contrato, la fase de esponja es considerablemente menos viscoso y fluye. Por lo tanto, la fase de esponja no puede retener su forma original y sus bordes son característicamente suave. Precipitantes que incluyen Jeffamine, PEG 400, 2-metil-2 ,4-pentanodiol, pentaeritritol propoxilato, butanodiol y hexanodiol, puede resultar en una transición de la fase cúbica a la esponja ^4,26.

Figura 4. El diagrama de flujo resume los pasos involucrados en la producción, cosecha y enfriamiento criogénico de meso-cultivadas en cristales de proteínas de membrana (A). Sólo los pasos rodeado por el rojo discontinuolínea, y se describe en detalle en (B), están previstas en este artículo JoVE. El panel A es de referencia 3. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 5. Un vacío crio-loop montado sobre un eje que se mantiene en su lugar por una varita magnética. Expanded Vistas del pasador (A) y micro mount-(B) de esta importante herramienta para la recolección y de refrigeración criogénica se muestran. El bucle de vacío al final de la micro-montaje en B es 30 m de diámetro. Si bien no haber probado otros tipos de bucle ampliamente, nos encontramos con que la MiTeGen bucles de trabajo se muestra bien tanto con las fases cúbicas y esponja.

Figura 6. Cosechadas y crio-enfriada de cristales de proteínas de membrana en crio-bucles según lo visto con un microscopio en línea en una línea de luz de sincrotrón. A, b. Ejemplos de cristales cosechadas (Caa3 citocromo oxidasa ³⁴ (A), diacilglicerol quinasa, DgkA (B)), donde los cristales (flecha azul) son visibles a través de la mesofase crio-enfriado en un ejemplo de la crio-bucle. C. de donde el cristal cosechado no es visible en la mesofase crio-enfriado en un crio-bucle. La punta del bucle se identifica con una flecha roja. La adhesión crio-enfriado mesofase se identifica con una flecha azul.

Discusión

En este artículo de vídeo demostramos cómo los cristales crecidos en una mesofase lipídica se cosechan y crio-enfriado en preparación para su uso en la recolección de datos de difracción y en última instancia para la determinación de la estructura. La mesofase de alojamiento puede ser la fase cúbica viscoso y pegajoso o la fase de esponja más fluido ^4. Como las placas sándwich de vidrio se abren y cómo los cristales se cosechan mucho depende del tipo de mesofase. Por ello es importante saber cuál de los dos uno está tratando con anticipación. La identidad de los lípidos de alojamiento y el precipitante utilizado son importantes a este respecto, y la apariencia física de los bolo mesofase en la cristalización bien se puede utilizar para distinguirlos (Figura 3). La recolección de los dos tipos de mesofase se ilustra en este artículo.

La recolección de pequeños cristales de una mesofase lipídico en placas intermedias de vidrio es un proceso laborioso que requiere tiempo, habilidad, experiencia, paciencia y una mano firme. Es importante dejar de lado una cantidad adecuada de tiempo para la cosecha y para establecer el laboratorio de forma que todos los suministros y equipos están a la mano de antelación. Una segunda persona para ayudar con la cosecha no es esencial, pero es recomendable. Esa persona puede ayudar con el suministro de pre-marcadas placas para el individuo que hace la recolección, así como la colocación de la crio-enfriados lazos montados con cristales recogidos en el disco de almacenamiento. El asistente también puede desempeñar un papel de apoyo importante en la documentación de las observaciones hechas en los cristales durante la cosecha que podría resultar crucial durante la recolección de datos de difracción. En ausencia de un asistente, un activada por la voz de audio de grabación de dispositivo podría ser utilizado con ventaja para la documentación.

Siguiendo el protocolo descrito en este artículo le ayudará a obtener el Visor de marcha con la cosecha cristal. Sin embargo, es importante apreciar que el proceso no es sencillo y que practice se necesita antes de lanzarse a cosechar valiosos cristales de proteínas de membrana. Se recomienda por lo tanto que las placas de prueba con cristales de proteínas que no son particularmente valiosos se experimentó con primero. Esto proporcionará al neófito con una valiosa experiencia en el corte de vidrio, la eliminación de fragmentos de vidrio, levantando el cubreobjetos encima de la mesofase, usando la característica de polarización en el microscopio para observar cristales y seguirles la pista durante la cosecha y, finalmente, el manejo de los diferentes tipos de mesofases y la cosecha de los mismos. La textura de la mesofase, y por extensión la facilidad con la que los cristales pueden ser cosechadas, cambia con el tiempo durante la cristalización. Es importante por lo tanto para practicar la cosecha con cristales de menor valor, pero con los que han crecido en las mismas condiciones como las más valiosas. Es posible hacer crecer cristales de lisozima y taumatina por el método en meso o lipídica fase cúbica ²⁸ y estos deben ser consiEred a modo de ganar familiaridad con los materiales y el método. También se debe considerar trabajar con sin proteínas mesofase primeros en aprender de sus caprichos.

Los procedimientos demostrados aquí se han realizado a un cómodo 20 ° C o menos. Es posible hacer crecer cristales por el método de meso a temperaturas más bajas. Así, monooleína como el lípido de alojamiento en un estado de fase metaestable puede ser utilizado a 4 ° C ^1,2,29,30. Una alternativa es utilizar el diseño racional 7,9 MAG para la cristalización a baja temperatura ^31. Hacemos crysallogenesis baja temperatura de forma rutinaria con ciertas metas de proteínas de membrana. En este caso, el crecimiento de cristales y la cosecha se realiza en una cabina de refrigerador a 4 º C. Trabajar en estas condiciones tiene sus propios desafíos no menos importante de los cuales es la necesidad de atuendo cálido y confortable.

El siguiente paso en el proceso global de determinación de la estructura utilizando crys macromolecularestallography es recoger datos de difracción en cristales recolectados y complemento enfriado como se demuestra en este artículo. En meso-grown cristales son generalmente pequeñas. Sin embargo, la difracción útil recogida de datos ha sido posible con los cristales que tienen una dimensión máxima de 20 micras ^9. Para este propósito, micro-haz sincrotrón radiación X se usa y es el foco de un artículo JoVE separado en esta serie ^32,33.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre de reactivo	Empresa	Número de catálogo	Componentes
Pinzas curvas	Sigma	F4142	Herramienta
Puntas de pipeta desechables	Gilson	Vario	Desechable
Espuma dewar	Spearlab	FD-500	Herramienta
Vidrio y metal contenedores de residuos	Daniels Healthcare	DD479OL	Herramienta
Bucles de cosecha	MiTeGen	Vario	Herramienta
La recolección microscopio	Nikon	SMZ1500	Herramienta
Laboratorio portátil	Vario	NA	Herramienta
Empuje magnéticomuestra el botón de carga varita	Hampton Research / dimensiones moleculares	HR4-729/MD7-411	Herramienta
Puck Original (para su uso con ALS estilo robots solamente)	Sistemas de Posicionamiento Crystal	CP-111-035	Herramienta
Dispositivos de pipeteo	Gilson	Vario	Herramienta
Soluciones precipitantes	Vario	Vario	Reactivo
Puck Bent Cryo-Tong	Sistemas de Posicionamiento Crystal	CP-111-030	Herramienta
Puck Cane envío Dejado de lado (original ALS-style) con mango de gancho y la barra de bloqueo	Sistemas de Posicionamiento Crystal	CP-111-029	Herramienta
El agua purificada	Millipore		Reactivo
Gafas ajustadas de seguridad	Varios	NA	Herramienta
Bases de muestra Pin - Magnetic (no cobre)	Sistemas de Posicionamiento Crystal	CP-111-015	Herramienta
Envío dewar	Taylor-Wharton	CX100	Herramienta
Los tejidos	NA	NA	Desechable
Carburo de tungsteno de vidrio de corte (Scriber TCT)	Herramientas Silverline (Yeovil, Reino Unido)	633657	Herramienta