Сбор и охлаждения Cryo-кристаллы мембранных белков Выращивается в липидный Мезофазы для определения структуры по кристаллографии макромолекул

Резюме

Здесь описаны процедуры, осуществляемые в мембране Кэффри Структурно-функциональная группа биологии для уборки и крио-прохладный мембранных белков кристаллов, выращенных в липидной кубической фазы и губки для использования в составе определения макромолекулярных использованием рентгеновской кристаллографии.

Аннотация

Важный путь к пониманию того, как белки функционируют на уровне механистических должна иметь структуру белка-мишени доступны, в идеале с атомным разрешением. В настоящее время есть только один способ захвата такой информации применительно к интегральные мембранные белки (рис. 1), и они образуют комплексы, и этот метод является макромолекулярных рентгеновской кристаллографии (MX). Чтобы сделать MX кристаллов дифракция качества необходимы которая, в случае мембранные белки, не образуют легко. Метод кристаллизации мембранных белков, что связано с использованием липидных мезофаз, в частности, кубические и губки фазах ^1-5, получила значительное внимание опозданием в связи с успехами она имела в G-белком рецептор поля ^6-21 ( WWW . mpdb.tcd.ie ). Тем не менее, метод, далее именуемый в мезо или липидные кубический метод фазы, поставляется с собственным техническимпроблемы. Они возникают, в частности, в связи с обычно вязкий и липкий характер липидного мезофазы, в котором кристаллы, которые часто являются микро-кристаллы, расти. Управление кристаллов становится трудно в результате так и, в частности во время сбора урожая ^22,23. Проблемы возникают также на этапе, который предшествует сбор, который требует, что стекло сэндвич-плиты, в которых растут кристаллы (рис. 2) ^24,25 открыто разоблачать мезофазы болюса, и кристаллы в нем, для сбора урожая, крио-и возможного охлаждения X -лучей коллекции дифракционных данных.

Кубической и губки мезофазы вариантов (рис. 3), из которых кристаллы должны быть собраны имеют совершенно другой rheologies ^4,26. Кубической фазы является вязким и липким похожее на толстую зубную пасту. В отличие от этого, губка фазе больше жидкости с отчетливая тенденция к потоку. Соответственно, разные подходы для открытия кристаллизации скважин containiнг выращивания кристаллов в кубической и губка фазы призвал как, впрочем, разные методы, необходимые для сбора кристаллов из двух типов мезофазы. Протоколы делать именно это были усовершенствованы и внедрены в мембране структурной и функциональной биологии (MS & FB) группы, и подробно описана в этой статье Юпитера (рис. 4). Приведены примеры ситуаций, когда кристаллы успешно собирают и крио-охлаждаются. Мы также предоставляем примеры случаев, когда возникают проблемы, которые приводят к безвозвратной потере кристаллов и описать, как эти проблемы можно избежать. В этой статье просмотра снабжен шаг за шагом инструкции для открытия стекла скважин сэндвич кристаллизации, для уборки и для крио-охлаждения кристаллы мембранных белков растет в кубической и в губки фаз.

протокол

1. Лаборатория Настройка предварительного сбора

1. В ходе подготовки к уборке, заполните сухой пеной Дьюара с жидким азотом и поместить его рядом с микроскопом, где сбор состоится.
2. Погрузитесь хранения шайбу, открыть в конечном итоге, в жидком азоте внутри пены Дьюара и дайте ей полностью здорово.
3. Закрепить микро-горе размере, который соответствует кристаллу быть собраны на магнитной палочкой (рис. 5). Важно иметь под рукой несколько запасных магнитные палочки с предустановленной микро-крепления для удовлетворения ситуациях, когда необходимо собрать несколько кристаллов из одного болюса. Запасные палочки должны быть доступны в любое время.
4. Поместите микропипетки, советы и осадителя решение, которое было использовано для роста кристаллов рядом с уборки микроскопом. Это может быть необходимо для покрытия мезофазы и для предотвращения высыхания, когда и открыто.
5. У блокнот и ручку на скамейку рядом, и / иликомпьютер открывать. Они будут использоваться для записи замечаний, касающихся качества, внешний вид, расположение, хранение шайбу номера и т.д., кристаллы, как они собираются, крио-охлаждают и помещают в хранилище.
6. Если помощник доступны, чтобы помочь с уборкой, что человек должен четко понимать протокол, который будет следовать, порядок, в котором различные шаги будут иметь место, и их роль в общем процессе.

Со всеми материалами и оборудованием на место нашей следующей задачей является:

2. Определить Плиты и скважин, которые содержат кристаллы

1. Самый простой и прямой метод нахождения заготовки кристаллов заключается в проверке скважин вручную, используя микроскоп с нормальным и со скрещенными поляризованного света. Регулировка освещенности свет на микроскопом может помочь в поиске кристаллов.
2. Кроме того, тепловизор, где плиты проверяются автоматически с нормальной и пересек поляризуютг свет, может быть использована для поиска кристаллов.
3. Оценить на глаз записаны цифровые изображения на мониторе компьютера.
4. Очевидно отметить те скважин с кристаллами для сбора и записи комментариев от размера, качества и расположения кристаллов в мезофазы в ноутбуке или компьютере.
5. Снимите пластину, содержащую кристаллы для уборки от тепловизора.

3. Открытие и с кубической мезофазы. Способ 1

Пластинами, в которых растут кристаллы в в методе мезо являются стеклянные трехслойных пластин (рис. 2). Для того, чтобы получить доступ к мезофазы и кристаллы в них, необходимо, чтобы открыть хорошо. Это делается с помощью инструмента резки стекла, чтобы сократить верхний покровного стекла, что тюлени и которые затем могут быть удалены.

Есть несколько подходов для резки и снятия покровного стекла из более чем кристаллизации хорошо. Из них использовать продиктовано Type OF мезофазы, в котором находится кристалл растет. Это может быть очень вязким и липким кубической фазы (рис. 3А) или его более гибким вариантом, фаза губки (рис. 3В). В этом видео статье мы покажем, как открыть колодцы и собирать кристаллы из обоих этих материалов хостинга.

1. Поместите кристаллизации стекла плита на сцене световой микроскоп.
2. Используя инструмент резки стекла счетом покровного стекла слегка с двумя концентрическими кругами расположены выше распорки и только за пределами периметра хорошо. С нового режущего инструмента, забив требует минимальных приложенного давления. Заменить инструмент новый, когда давление, необходимое для оценки возрастает еще незначительно, обычно это происходит после открытия 10 скважин.
3. Разбейте стекло в пространстве между двумя кругами забил с целью освобождения внутреннего покровного стекла. Это порождает множество осколков стекла и пыли. Очистите их прочь с смоченнуюбумажным полотенцем.
4. Снимите освободил покровного стекла, удерживая его с тонкой наконечником пинцеты и наклоняя ее от и выключение хорошо. В этом случае кубической фазы остается застрял, и на место на плите скважины.
5. Увеличьте масштаб, чтобы получить более четкое представление кубических мезофазы которая сейчас готова для использования в кристалле уборки урожая.

4. Открытие Ну с кубическими мезофазы. Способ 2

1. Использование стекла режущего инструмента оценки прямые параллельные линии в покровного стекла с одной стороны хорошо, что проходят по хорошо себя. Это позволяет легче пинцетом доступа и удаления покровного стекла.

В данной демонстрации, покровного стекла трещины в освобождении от покровного стекла липкой поверхности прокладки. В процессе покровного стекла сдвиги в положении и осадителя отделяется от кубической фазы. Когда покровного стекла поднимают некоторые из осадителя идет с ним. Нам остается открытой бОлус мезофазных без каких-либо окружающих осадителя. Сразу же добавить 1 мкл свежей осадителя в верхней части болюса помощью микропипетки, чтобы предотвратить мезофазы от высыхания и переживает этап изменений, которые могут повредить кристаллы. Болюс готов для использования в кристалле уборки урожая.

5. Открытие Ну с фазы губки. Безуспешно

Губка фазы меньше прощать работать, потому что его способности потока. Если этого потока приводит к губке фазы контакта по периметру и капиллярность обнажу мезофазы и кристаллы будут потеряны. Примером этого случая показано на этом видео.

1. Увеличить на губку фазы и переключаться между обычным и скрещенные поляризованный свет, чтобы найти кристаллы в губку фазу.
2. В рамках подготовки к открытию и оценки и сократить покровного стекла, как описано в разделе 3. В процессе покровного стекла трещины. В попыткеING, чтобы открыть и осадителя сдвиги в направлении трещины и в конце концов он вступает в контакт с прокладкой. С осадителя идет некоторые из фазы губки и его груз кристаллов, которые были утеряны.

В этой конкретной последовательности, поляризаторы на микроскоп не полностью пересек и кристаллы можно рассматривать как яркие объекты, в то же время, что хорошо и ее содержимое остаются видимыми.

6. Открытие Ну с фазы губки. Успешно

1. Увеличить на губку фазы и выявления кристаллов, как в нормальных и скрещенных поляризованного света.
2. Оценка, вырезать и удалить раздел покровного стекла охватывающий также, как и в разделе 4.1. Не полностью пересек поляризованного света используется для отслеживания кристалла.
3. Представьте кусок сухой салфеткой через отверстие в покровного стекла, а в колодец, пока она не коснется осадителя решение. Вика от решения осторожныют, пока он почти все ушли, а затем удалить ткань. Это приводит к тому, оставшихся осадителя и губки фазы, с кристально-прежнему на месте, чтобы убрать под покровного стекла.
4. Оценка, вырезать и удалить с помощью пинцета остальной части покровного стекла, как и в разделе 4.1. В этом случае, губки фаза распадается, а некоторые остаются в скважине и палочки для покровного стекла. Кристалла в болюсной на покровного стекла. Потому что есть очень мало осадителя настоящее время фаза губка начинает испытывать фазовый переход вероятно, из-за высыхания. Это можно рассматривать как кольцо двулучепреломления, который мигрирует к центру болюса. Сразу добавить осадителя в болюс, чтобы остановить переход. Болюс готов для использования в кристалле уборки урожая.

7. Сбор и охлаждения Cryo-кристаллов из кубической фазы

1. Вернитесь назад и вперед между нормальным и скрещенные поляризованный свет, чтобы найти кристаллы в кубических болюса фазы в открытую хорошо. В тего видеоряд до четырех двулучепреломляющей кристаллы можно увидеть в кубической фазе болюса со скрещенными поляризованного света.
2. Используйте установлен крио-цикла (рис. 5), чтобы исследовать свежеобнаженного мезофазы для кристаллов, выловить кристаллов, а затем погрузить их, содержащейся в крио-цикл, в жидкий азот в сосуд Дьюара сразу же после уборки урожая. В идеале, заготовки и оснастки охлаждение должно произойти в одном непрерывном и быстром движении. Как мало придерживаясь мезофазы по возможности должна быть собрана с кристаллом. По нашему опыту, крио-защитным не требуется с в мезо-выращенных кристаллов.
3. Так как это не возможно, чтобы смотреть на кристалл в крио-цикл сразу же после сбора урожая проверку мезофазы болюса использоваться для уборки чтобы убедиться, что кристалл больше не существует, предполагая, что он был собран успешно.

8. Сбор и охлаждения Cryo-кристаллы из губки фазы

1. Вернитесь назад и вперед между нормальным и скрещенные поляризованный свет, чтобы найти кристаллы в болюсной губки фазы в открытую хорошо. В этом видео последовательности многих двулучепреломляющей кристаллы можно увидеть в болюса при скрещенных поляризованного света.
2. Используйте установлен крио-цикла (рис. 5), чтобы выловить кристаллов из губки фазы и окунуться них, которые содержатся или cryoloop, в жидкий азот в сосуд Дьюара сразу же после уборки урожая. Как и уборки из кубической фазы, в идеале, крио-процесс охлаждения должно произойти сразу же кристалл собирают с как можно меньше времени возможно, прошедшее между фактическим событием уборки и погружая в жидкий азот. Как мало придерживаясь фаза губки по возможности должна быть собрана с кристаллом. Как уже отмечалось, крио-защитным не требуется с в мезо-выращенных кристаллов.

9. Хранение Кристаллы в Dewars

1. Погрузившись установлены петли в жидком Н.И.Trogen поместить его в одну из проведения слотов для хранения шайбу в пену Дьюара. Все манипуляции производятся с петлей, в верхней части магнитной палочкой и шайбу погруженной в жидкий азот.
2. Запишите расположение и детали собирают и крио-охлаждением кристалла в ноутбук и / или на компьютере.
3. Если шайба в пену Дьюара является полным или уборки в течение дня завершения передачи шайбу в отложены держатель шайбу в хранении или транспорте Дьюара с жидким азотом. Кристаллы могут быть отправлены в транспорте Dewars на объект синхротрон для сбора дифракционных данных.

10. Представитель Результаты

Цели сбора и крио-охлаждение упражнений показал здесь, чтобы передать кристалла от хостинга мезофазы в крио-петли, чтобы остекловывать петлю кристалла и поместить его на хранение в жидкий азот в сосуд Дьюара. Идеальной является ситуация, где сбор урожая и сРе-охлаждение сделано таким образом, что дифракционные качество кристалла сохраняется в процессе. Как мало мезофазы по возможности должна быть собрана с кристаллом. Это необходимо для того размещении кристалла и центрирования его в рентгеновский луч, который гораздо менее сложной, чтобы ускорить крио-охлаждение с целью стеклования, и свести к минимуму вмешательство фоне разброс от мезофазы во время сбора дифракционных данных. Некоторые примеры крио-охлажденных образцах, где кристалл может и не может рассматриваться показано на рисунке 6. В случае, если кристалл не видно на глаз, как правило, приходится прибегать к дифракции растеризации, чтобы найти кристалл и в центре его в луч для сбора данных ^27.

Рисунок 1. Схематическое изображение биологических мембран показывает липидного бислоя и на котором арэлектронной расположены различные белки.

Рисунок 2. Полностью загружены и опечатаны 96-а стекло сэндвич кристаллизации пластин. Каждая лунка содержит 50 нл кубической фазы и 1 мкл осадка раствор. Для ясности, кубическая фаза была окрашенных Суданом Красное и осадителя решение включает в себя метиленовый синий. Из Ссылка 5.

Рисунок 3. Кристаллы мембранных белков, растущих в липидных мезофазы.. Кубической фазы с кристаллической бактериородопсина из H. halobium. B. губки фазу, содержащую кристаллы витамина В12 рецептор / транспортер, BtuB, от E. палочки. Из Reference 25. Кубической и губки фаз контрастной appearances как видно, сравнивая панели А и В. кубической фазы в очень вязкой и сохраняет свою первоначальную форму. Это не течь. Это особенно заметно на краях мезофазы болюса, которые имеют шероховатую внешний вид. По контракту, губки фазы значительно меньше, вязкой и течет. Таким образом, фаза губки не в состоянии сохранить свою первоначальную форму и ее края характерна гладкая. Осадителей, которые включают Jeffamine, ПЭГ 400, 2-метил-2 ,4-pentandiol, пентаэритрита пропоксилат, бутандиол и гександиол, может привести к переходу из кубической фазы губки ^4,26.

Рисунок 4. Схеме приведены этапы производства, сбора и крио-охлаждение в мезо-выращенных кристаллов мембранного белка (А). Только те шаги, окруженные красной пунктирнойлинии, и подробно описан в (B), которые описаны в этой статье Юпитера. Панель от Reference 3. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 5. Пустые крио-цикл установлен на булавку, которая удерживается на месте на магнитной палочкой. Расширенное видом на штифт (A) и микро-крепление (B) этого важного инструмента для уборки и крио-охлаждение показано на рисунке. Пустой цикл в конце микро-горе в B составляет 30 мкм в диаметре. Хотя с не проверял другие типы цикла широко, мы находим, что MiTeGen петли показаны хорошо работают как с кубической и губки фаз.

Рисунок 6. Заготовленные и крио-охлажденных кристаллах мембранных белков в крио-цикл, если смотреть с в линию микроскоп на синхротроне beamline. A, B. Примеры собранных кристаллов (Caa3 цитохромоксидазы ³⁴ (А), диацилглицерол киназы, DgkA (B)), где кристаллы (синяя стрелка) видны через крио-охлажденного мезофазы на крио-цикла. C. Пример, где кристалл заготовленной не видна в крио-охлажденного мезофазы на крио-цикла. Кончик цикла отождествляется с красной стрелкой. Соблюдение крио-охлажденного мезофазы отождествляется с синими стрелками.

Обсуждение

В этом видео статье мы показали, как кристаллы, выращенные в липидных мезофазы собирают и крио-охлаждали в подготовке для использования в коллекцию дифракционных данных и в конечном итоге для определения структуры. Мезофазы хостинг может быть вязким и липким кубической фазы или больше жидкости губкой фазы ^4. Как стеклянных пластин сэндвич открыты и, как кристаллы собирают очень многое зависит от мезофазы типа. Поэтому важно знать, какую из двух речь идет о заранее. Личность хостинг липидов и осадителя использовали важны в этом отношении, и внешность мезофазы болюса при кристаллизации также может быть использован, чтобы сказать им друг от друга (рис. 3). Сбор от обоих типов мезофазы было показано в этой статье.

Уборочная мелких кристаллов из липидных мезофазы в стеклянных пластин бутерброд кропотливый процесс, который требует времени, умения, экспериментовience, терпение и твердая рука. Важно, чтобы выделить достаточное количество времени для сбора урожая и создать лабораторию, чтобы все материалы и оборудование под рукой заранее. Второй человек, чтобы помочь с уборкой урожая не является необходимым, но рекомендуется. Этот человек может помочь с предоставлением заранее отмеченные пластины на отдельные делают заготовки, а также размещения крио-охлаждением установлены петли с кристаллами собраны в хранилище шайбу. Помощник может также играть важную роль в поддержке документирования наблюдений на кристаллы сделанные во время сбора урожая, которые могут сыграть решающую роль в процессе сбора дифракционных данных. При отсутствии помощников, голосовые аудио-и записывающее устройство может быть использовано для преимуществ для документации.

В соответствии с протоколом, описанным в этой статье, поможет получить средства просмотра и работает с кристаллом уборки урожая. Тем не менее, важно понимать, что этот процесс не простой и, что праctice необходимо перед запуском в уборке ценные кристаллы белков мембраны. Поэтому рекомендуется, что тест пластины с кристаллами белки, которые не являются особенно ценными быть экспериментировал с первым. Это обеспечит неофита с ценный опыт в резке стекла, удаляя осколки стекла, поднимая покровного стекла из более чем мезофазы, с помощью поляризационных функций на микроскоп, чтобы увидеть кристаллы и отслеживать их во время сбора урожая, и, наконец, обработку различных типов мезофаз и сбор урожая от них. Текстура мезофазы, и расширением легкость, с которой кристаллы могут быть собраны, меняется со временем в процессе кристаллизации. Поэтому важно, чтобы практиковать уборки с менее ценных кристаллов, но с теми, которые росли в тех же условиях, как и более ценными. Это позволит выращивать кристаллы лизоцима и тауматин в в мезо или липидные кубический метод фазового ²⁸ и это следует рассматЭред путем получения знакомство с материалами и метод. Следует также рассмотреть вопрос о сотрудничестве с белком без мезофазы первыми узнавать своих капризов.

Процедуры продемонстрировали здесь было все сделано на комфортном 20 ° C или около того. Это можно выращивать кристаллы в методе мезо при низких температурах. Таким образом, моноолеина как хостинг липидов в метастабильное фазовое состояние может быть использована при 4 ° С ^1,2,29,30. Альтернативой является использование рационально разработан 7,9 MAG для низкой температуры кристаллизации ^31. Мы делаем низких температур crysallogenesis регулярно с определенными целями мембранного белка. В этом случае, рост кристаллов и сбор урожая производится в душевой 4 ° C холодильнике. Работая в таких условиях имеет свои собственные проблемы, не последним из которых является потребность в теплой и удобной одежде.

Следующим шагом в общем процессе определения структуры использования макромолекулярных кристалловtallography является сбор данных дифракции на кристаллах собраны и оснастка охлаждается, как показано в этой статье. в мезо-выращенных кристаллов, как правило, небольшие. Тем не менее, полезно дифракции сбора данных стало возможным с кристаллов с максимальным размером 20 мкм ^9. Для этого, микро-лучевой синхротронного рентгеновского излучения используется и находится в центре внимания отдельной статьи Юпитер в этой серии ^32,33.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Компоненты
Изогнутый пинцет	Сигма	F4142	Инструмент
Одноразовые наконечники	Gilson	Различный	Одноразовый
Пена Дьюара	Spearlab	FD-500	Инструмент
Контейнеры Стеклянные и металлические отходы	Daniels Здоровье	DD479OL	Инструмент
Уборочная петли	MiTeGen	Различный	Инструмент
Уборочная микроскопом	Nikon	SMZ1500	Инструмент
Лаборатория ноутбуков	Различный	Не Доступно	Инструмент
Магнитные толчокКнопка загрузки образца палочки	Hampton Research / Молекулярная Размеры	HR4-729/MD7-411	Инструмент
Оригинальный Puck (для использования с ALS-стиле роботов только)	Системы позиционирования кристалла	CP-111-035	Инструмент
Пипетки	Gilson	Различный	Инструмент
Осадителя решения	Различный	Различный	Реагент
Puck Бент Cryo-Тонг	Системы позиционирования кристалла	CP-111-030	Инструмент
Puck отложен Cane доставка (оригинал ALS-стиль) с крючковатым ручку и замок стержня	Системы позиционирования кристалла	CP-111-029	Инструмент
Дистиллированная вода	Millipore		Реагент
Защитные очки	Различные	Не Доступно	Инструмент
Примеры Основы Pin - магнитный (без меди)	Системы позиционирования кристалла	CP-111-015	Инструмент
Доставка Дьюара	Taylor-Wharton	CX100	Инструмент
Ткани	Не Доступно	Не Доступно	Одноразовый
Карбида вольфрама стеклорез (TCT Scriber)	Silverline Инструменты (Yeovil, Великобритания)	633657	Инструмент