Colheita e Cryo-resfriamento cristais de proteínas de membrana crescida no mesofases lipídicas para a determinação da estrutura de Cristalografia Macromolecular

Resumo

Aqui é descrito procedimentos implementados na membrana Caffrey Estrutural e Grupo Biologia Funcional para colheita e crio-cool cristais de proteína de membrana lipídica cultivadas em fases cúbicas e esponja de uso na determinação estrutura usando cristalografia de macromoléculas de raios-X.

Resumo

Uma via importante para a compreensão de como proteínas funcionar a um nível mecanístico é ter a estrutura da proteína alvo disponível, idealmente em resolução atómica. Presentemente, há apenas uma maneira para captar informação, tais como aplicado a proteínas integrais de membrana (Figura 1), e os complexos se formam, e esse método é a cristalografia de raios-X macromolecular (MX). Para fazer cristais de qualidade MX difracção que são necessários, no caso de proteínas de membrana, não se formam prontamente. Um método para cristalizar proteínas da membrana que envolve o uso de mesofases lipídicos, especificamente as fases cúbicos e esponja ^1-5, ganhou atenção considerável devido tarde para o sucesso que teve no campo receptor acoplado à proteína G ^6-21 ( www . mpdb.tcd.ie ). No entanto, o método, doravante referida como a em meso ou método fase lipídica cúbico, vem com sua própria técnicadesafios. Estas surgem, em parte, devido à natureza geralmente viscoso e pegajoso da mesofase lipídico no qual os cristais, os quais são muitas vezes micro-cristais, crescer. Manipulando cristais torna-se difícil, como resultado e, particularmente, durante a colheita, ^22,23. Os problemas surgem também no passo que precede a colher que requer que as placas de vidro em sanduíche no qual os cristais crescem (Figura 2) ^24,25 são abertos para expor o bolus de mesofase, e os cristais na mesma, para a colheita, crio-arrefecimento e X eventuais -ray de coleta de dados de difração.

As variantes de mesofase cúbicos e esponja (Figura 3) a partir da qual devem ser colhidas cristais têm reologias ^4,26 profundamente diferentes. A fase cúbica é viscosa e pegajosa semelhante a uma pasta de dentes de espessura. Por outro lado, a fase de esponja é mais fluida com uma clara tendência para fluir. Por conseguinte, as diferentes abordagens para a abertura de poços de cristalização containicristais ng crescem na fase cúbica e esponja são chamados como, aliás, para diferentes métodos são necessários para a colheita de cristais a partir dos dois tipos de mesofase. Protocolos para fazer apenas que foram refinados e aplicados no Membrane Biology estrutural e funcional (MS & FB) de grupo, e são descritos em detalhe neste artigo JoVE (Figura 4). São dados exemplos de situações em que os cristais são colhidos com sucesso e crio-arrefecido. Nós também dar exemplos de casos onde os problemas surgem que levam à perda irreparável de cristais e descrever como esses problemas podem ser evitados. Neste artigo o Viewer é fornecido com o passo-a-passo para a abertura de poços de vidro de cristalização de sanduíche, para a colheita e para crio-refrigeração cristais de proteínas da membrana que crescem em cúbico e em fases de esponja.

Protocolo

1. Laboratório de Set-up pré-colheita

1. Em preparação para a colheita, preencher a espuma seca Dewar com nitrogênio líquido e colocá-lo ao lado do microscópio, onde a colheita está a ter lugar.
2. Submergir o disco de memória, abra acabam, no nitrogênio líquido dentro do Dewar espuma e deixe-o esfriar completamente.
3. Assegurar uma micro-montagem de um tamanho que corresponde ao cristal a ser colhido numa varinha magnética (Figura 5). É importante ter à mão um número de reposição varas magnéticas pré-carregado com micro-montagens para atender a situações em que é necessária a colheita de cristais a partir das várias um bolus. Spare varinhas devem estar disponíveis em todos os momentos.
4. Coloque uma micropipeta, pontas e a solução precipitante que foi utilizado para o crescimento de cristais ao lado do microscópio colheita. Pode ser necessário para cobrir a mesofase e para evitar a secagem quando o poço é aberto.
5. Tenha um caderno e uma caneta no banco por perto e / ouo computador abrir. Estes serão utilizados para gravar observações sobre a qualidade, a aparência, a localização, número de puck armazenamento, etc, dos cristais à medida que são colhidas, crio-arrefecida e colocada em armazém.
6. Se um assistente está disponível para ajudar com a colheita que pessoa deve entender claramente que o protocolo seja seguido, a ordem em que os vários passos será realizada, e o seu papel no processo global.

Com todos os materiais e equipamentos em local a nossa próxima tarefa é:

2. Identificar Pratos e poços que contêm cristais

1. O método mais simples e direta para encontrar cristais cultiváveis ​​é inspecionar poços à mão usando um microscópio com normal e com luz polarizada cruzada. Ajustar a intensidade da luz que ilumina o microscópio pode ajudar a localizar cristais.
2. Alternativamente, um gerador de imagens, onde as placas são rastreadas automaticamente com normal e cruzado polarized luz, pode ser usado para procurar cristais.
3. Avaliar por olho gravado imagens digitais em um monitor de computador.
4. Marcar claramente os poços com cristais para colheita e registro de comentários sobre o tamanho, qualidade e localização dos cristais na mesofase no notebook ou em um computador.
5. Remova a placa contendo cristais para a colheita a partir do sensor de imagem.

3. Abrindo um poço com mesofase cúbico. Método 1

As placas em que os cristais cresçam pelo método de meso são placas de vidro em sanduíche (figura 2). A fim de aceder a mesofase e os cristais, são preferíveis, é necessário abrir o poço. Isto é feito por meio de uma ferramenta de corte para cortar o vidro lamela superior que veda o bem que pode, então, ser removido.

Existem várias abordagens para o corte e remoção da lamela em mais de uma cristalização bem. O que deve ser usado é ditada pelo tipo of mesofase na qual o cristal se encontra em crescimento. Esta pode ser a fase muito viscosa e pegajosa cúbico (Figura 3A) ou a sua variante mais fluidos, a fase esponja (Figura 3B). Neste artigo de vídeo que mostram como abrir poços e na colheita de cristais de ambos os materiais de hospedagem.

1. Coloque a placa de vidro cristalização sanduíche no palco de um microscópio de luz.
2. Utilizando uma ferramenta de corte de vidro score a lamela levemente com dois círculos concêntricos situados acima do espaçador e do lado de fora do perímetro da cavidade. Com uma ferramenta de corte novo, requer pressão aplicada pontuação mínima. Substituir a ferramenta com um novo quando a pressão necessária para contagem aumenta ainda fraccionada, o que normalmente ocorre após a abertura de 10 poços.
3. Quebra-se o vidro no espaço entre os dois círculos marcados com o propósito de libertar o lamela interior. Isso gera muitos cacos de vidro e pó. Limpá-las com uma umedecidotoalha de papel.
4. Retire a lamínula libertou segurando-o com uma pinça de ponta fina e inclinando-o longe de dentro e fora do poço. Neste caso, a fase cúbica permanece preso no lugar e na placa de base do poço.
5. Aumentar o zoom para obter uma visão mais clara da mesofase cúbico que agora está pronto para ser utilizado na colheita de cristal.

4. Abrindo um Bem com mesofase cúbico. Método 2

1. Utilizando a ferramenta de corte de vidro pontuação linhas rectas paralelas na lamela a um lado do poço, e que se estendem por todo o poço em si. Isto permite um acesso mais fácil a pinça e retirada da lamela.

Nesta demonstração particular, a lamela rachaduras na libertação da lamela da superfície pegajosa espaçador. No processo, a lamela muda de posição e o precipitante separa da fase cúbica. Quando a lamela é levantado algum do precipitante a acompanha. Ficamos com um b expostosolus de mesofase sem qualquer precipitante circundante. Imediatamente, adicionar um precipitante ul fresco no topo do bolo utilizando uma micropipeta para impedir a mesofase de secar e passando por uma mudança de fase que podem danificar os cristais. O bólus está agora pronto para ser usado na colheita de cristais.

5. Abrindo um Bem com a Fase Esponja. Sem sucesso

A fase esponja é menos tolerante a trabalhar com devido à sua capacidade de fluir. Se que os resultados de fluxo na fase esponja contactando o perímetro da capilaridade assim vai chamar a mesofase e os cristais serão perdidos. Um exemplo de que isso aconteça é mostrada neste vídeo.

1. Zoom sobre a fase de esponja e alternar entre normal e cruzado luz polarizada para localizar cristais na fase de esponja.
2. Em preparação para a abertura do escore bem e cortar a lamela, como descrito na Seção 3. No processo, a lamela rachaduras. Na tentativação para abrir a bem os deslocamentos precipitantes na direcção da fenda e, eventualmente, que entra em contacto com o separador. Com o precipitante de alguma da fase esponja e da sua carga de cristais que se perderam.

Nesta sequência particular, os polarizadores no microscópio não são completamente cruzados e os cristais podem ser vistos como objectos brilhantes ao mesmo tempo que o poço e os seus conteúdos permanecem visíveis.

6. Abrindo um Bem com a Fase Esponja. Com sucesso

1. Zoom sobre a fase de esponja e identificar um cristal, tanto em normal e cruzado luz polarizada.
2. Pontuação, cortar e remover uma seção de lamínula cobrindo o bem, como na Seção 4.1. Incompleta cruzou a luz polarizada é usada para manter o controle do cristal.
3. Introduzir uma folha de papel de seda seca, através da abertura na lamela e para dentro do poço até ela tocar a solução precipitante. Pavio fora a solução cuidadosoly até que seja quase todos embora e depois remover o tecido. Isso faz com que o precipitado restante e fase esponja, com o cristal ainda no lugar, para retrair sob a lamela.
4. Pontuação, cortar e remover com uma pinça o resto da lamela, como na Seção 4.1. Neste caso, a fase esponja divide; alguns permanece no poço e algumas varas para a lamela. O cristal é em bolus na lamela. Pois há muito pouca presente precipitante, a fase esponja começa a sofrer uma transição de fase provavelmente devido a secagem. Isto pode ser visto como um anel de birrefringência que migra em direcção ao centro do bolo. Imediatamente adicionar precipitante para o bolus para deter a transição. O bolo já está pronto para uso em colheita de cristal.

7. Colheita e Cryo-arrefecimento cristais a partir da fase cúbica

1. Ir e voltar entre normal e cruzado luz polarizada para localizar cristais nas bolus fase cúbicos no bem aberto. Em ta sua sequência de vídeo até quatro cristais birrefringentes pode ser visto nos bolus fase cúbica com luz polarizada cruzada.
2. Use uma. Montado crio-loop (Figura 5) para sondar a mesofase recém exposta para cristais, para pescar cristais e, em seguida, ao mergulhá-los, contido no crio-loop, em azoto líquido no vaso Dewar imediatamente após a colheita Idealmente, a colheita ea pressão refrigeração deve acontecer em um movimento contínuo e rápido. Como mesofase pouco aderente quanto possível, deve ser colhida com o cristal. Em nossa experiência, crio-protetor não é necessária com no meso-crescidos cristais.
3. Uma vez que não é possível olhar para o cristal no crio-loop imediatamente após a colheita, inspeccionar o bolus mesofase usado para colher a fim de verificar que o cristal já não existe sugerindo que foi colhida com sucesso.

8. Colheita e Cryo-arrefecimento Cristais da Fase Sponge

1. Ir e voltar entre normal e cruzado luz polarizada para localizar cristais no bolo fase esponja no poço aberto. Nesta sequência de vídeo muitos cristais birrefringentes pode ser visto no bolus sob luz polarizada cruzada.
2. Use uma. Montado crio-loop (Figura 5) para pescar cristais a partir da fase de esponja e mergulhá-los, contido dentro ou sobre a cryoloop, em azoto líquido no vaso Dewar imediatamente após a colheita Tal como acontece com a colheita da fase cúbica, idealmente, o processo de crio-resfriamento deve acontecer imediatamente o cristal é colhida com tão pouco tempo quanto possível decorrido entre o evento de colheita real e mergulhar em nitrogênio líquido. Como fase esponja pouco aderente quanto possível, deve ser colhida com o cristal. Como se observa, crio-protetor não é necessária com no meso-crescidos cristais.

9. Armazenar em Cristais Dewars

1. Depois mergulhou o circuito montado em ni líquidoTrogen colocá-lo em uma das ranhuras de fixação do disco de armazenamento no Dewar espuma. Todas as manipulações são realizadas com o circuito, a parte superior da varinha magnética e o disco imerso em azoto líquido.
2. Registrar o local e detalhes da colheita e crio-refrigerado cristal no notebook e / ou no computador.
3. Quando o disco no Dewar cheio de espuma ou de captura para o dia é completada a transferência do disco para dentro de um suporte de disco de um dispositivo de armazenamento em prateleira ou um Dewar transporte cheio com azoto líquido. Os cristais podem ser enviados em Dewars de transporte para a instalação síncrotron para a coleta de dados de difração.

10. Resultados representativos

Os objetivos dos exercícios de colheita e crio-refrigeração demonstrado aqui são para transferir um cristal da mesofase hospedagem em crio-loops, para vitrificar o cristal em loop e colocá-lo no armazenamento em nitrogênio líquido em um Dewar. A situação ideal é quando a colheita e cryo-arrefecimento é feito de tal modo que a qualidade de difracção do cristal é preservada durante o processo. Como mesofase pouco quanto possível, deve ser colhida com o cristal. Isto é para tornar a localização do cristal e centrando-o no feixe de raios-X que muito menos exigente, para acelerar o arrefecimento da crio-com vista à vitrificação, e para minimizar a interferência de fundo de dispersão a partir da mesofase durante a recolha de dados de difracção. Alguns exemplos de crio-arrefecidos amostras onde o cristal podem e não podem ser vistas são mostrados na Figura 6. Sempre que o cristal não pode ser visto a olho nu, é geralmente necessário recorrer a rastering difracção, a fim de encontrar o cristal e para centrá-la no feixe de recolha de dados ^27.

Figura 1. Representação esquemática de uma membrana biológica que mostra a bicamada lipídica e em que are situado a uma variedade de proteínas.

Figura 2. Uma totalmente carregado e selado de 96 poços da placa de vidro de cristalização sanduíche. Cada poço contém 50 nl fase cúbica e uma solução precipitante ul. Para maior clareza, a fase cúbica foi corado com Sudan Red e a solução precipitante compreende azul de metileno. A partir de Referência 5.

Figura 3. Cristais de proteínas de membrana que crescem na mesofase lipídica. A. A fase cúbica com um cristal de bacteriorodopsina de H. halobium. B. fase A esponja contendo um cristal do receptor de vitamina B12 BtuB / transportador, a partir de E. coli. Da referência 25. As fases cúbicas e esponja têm contrastantes appeaRances como é óbvio, comparando os painéis A e B. A fase cúbica em que A é extremamente viscosa e retém a sua forma original. Ele não flui. Isto é particularmente evidente nas bordas dos bolus mesofase que têm uma aparência rugosa. Por contrato, a fase de esponja é consideravelmente menos viscoso e flui. Assim, a fase esponja não reter a sua forma original e as suas bordas são caracteristicamente lisa. Precipitantes que incluem Jeffamine, PEG 400, 2-metil-2 ,4-pentandiol, pentaeritritol propoxilato, butanodiol e hexanodiol, pode resultar em uma transição da fase cúbica para a esponja de ^4,26.

Figura 4. O fluxograma resume os passos envolvidos na produção de colheita, e crio-de arrefecimento em meso-crescidos cristais de proteína de membrana (A). Apenas os passos cercados pelo vermelho tracejadolinha, e descritos em detalhe em (B), são cobertos neste artigo JoVE. Um painel é de Referência 3. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 5. Um vazio crio-loop montado em um pino que é realizada no local em uma varinha magnética. Vistas expandidas do pino (A) e micro-montagem (B) desta ferramenta importante para a colheita e crio-arrefecimento são mostrados. O loop vazio no final da micro-montagem em B é de 30 um de diâmetro. Apesar de não ter testado outros tipos de loop extensivamente, nós achamos que o MiTeGen laços trabalho mostrado bem com ambas as fases cúbicas e esponja.

Figura 6. Colhido e crio-arrefecido cristais de proteínas de membrana em crio-loop quando vistos com um microscópio in-line em uma linha de luz síncrotron. A, B. Exemplos de cristais colhidas (Caa3 citocromo oxidase ³⁴ (A), quinase de diacilglicerol, DgkA (B)) em que os cristais (seta azul), são visíveis através da mesofase crio-arrefecido num C. Exemplo crio-loop. de onde o cristal colhido não é visível na mesofase crio-arrefecido num crio-loop. A ponta do laço é identificado com uma seta vermelha. A adesão mesofase crio-refrigerado é identificado com uma seta azul.

Discussão

Neste artigo de vídeo, demonstramos como cristais crescidos numa mesofase lipídica são colhidas e crio-arrefecido em preparação para utilização na recolha de dados de difracção e, finalmente, para a determinação da estrutura. A mesofase hospedagem pode ser a fase viscosa e pegajosa cúbico ou a fase esponja mais fluido ^4. Como as placas de sanduíche de vidro são abertas e como os cristais são colhidas depende muito do tipo de mesofase. É importante, portanto, saber qual dos dois é um lidar com antecedência. A identidade do lípido e do precipitante de hospedagem utilizado são importantes, a este respeito, e a aparência física dos bolus mesofase na cristalização bem podem ser usados ​​para distingui-los (Figura 3). A colheita de ambos os tipos de mesofase foi ilustrado neste artigo.

Colheita de pequenos cristais de uma mesofase lipídico em placas de sanduíche de vidro é um processo trabalhoso que requer tempo, habilidade exper,IENCE paciência, e uma mão firme. É importante reservar uma quantidade de tempo adequado para a colheita e para configurar o laboratório para que todos os suprimentos e equipamentos estão à mão com antecedência. Uma segunda pessoa para facilitar a colheita não é essencial, mas é recomendado. Essa pessoa pode ajudar com o fornecimento de placas pré-marcadas para o indivíduo fazer a colheita, bem como a colocação de crio-refrigerados laços montados com cristais colhidas para o disco de armazenamento. O assistente também pode desempenhar um papel importante apoio na documentação de observações sobre os cristais feitos durante a colheita, que pode revelar-se crucial durante a coleta de dados de difração. Na ausência de um assistente, um dispositivo ativado por voz de gravação de áudio pode ser usado com vantagem para a documentação.

Seguindo o protocolo descrito neste artigo irá ajudar a obter o Visualizador instalado e funcionando com a colheita de cristal. No entanto, é importante ter em conta que o processo não é linear e que practice é necessária antes de se lançar na colheita de cristais de proteínas de membrana valiosos. Recomenda-se, portanto, que as placas de teste com cristais de proteínas que não são particularmente valiosas ser experimentado em primeiro lugar. Isto irá fornecer a neophyte com experiência valiosa no corte de vidro, a remoção de fragmentos de vidro, erguendo-se a lamela de cima da mesofase, utilizando a funcionalidade de polarização no microscópio para observar cristais e localizá-los durante a colheita, e, finalmente, tratamento dos diferentes tipos de mesofases e colher a partir deles. A textura da mesofase, e, por extensão, a facilidade com que os cristais podem ser colhidos, que muda com o tempo, durante a cristalização. É importante, por conseguinte, para a prática de colheita de cristais de menor valor, mas com as que cresceram sob as mesmas condições como as mais importantes. É possível crescer cristais de lisozima e taumatina pelo meso ou no método de fase lipídica cúbica ²⁸ e estes devem ser consideradosrado pelo modo de obter a familiaridade com os materiais e os métodos. Deve-se considerar também a trabalhar com a proteína livre de mesofase primeiro a saber de seus caprichos.

Os procedimentos demonstrados aqui foram todas feitas em um confortável 20 ° C ou menos. É possível cultivar os cristais pelo método de meso a temperaturas mais baixas. Assim, como a mono-oleína lipídico hospedagem em um estado metaestável de fase podem ser utilizados, a 4 ° C ^1,2,29,30. Uma alternativa é usar a racionalmente concebidos 7,9 MAG para a cristalização a baixa temperatura ^31. Fazemos crysallogenesis baixa temperatura rotineiramente com metas determinadas proteínas de membrana. Neste caso, o crescimento dos cristais e a colheita é feita de uma cabina de refrigerador C 4 °. Trabalhando sob tais condições tem seus próprios desafios não menos do que é a necessidade de roupas quentes e confortáveis.

O passo seguinte no processo global de determinação da estrutura cristalina através macromolecularestallography é coletar dados de difração em cristais colhidos e snap-resfriado, como demonstrado neste artigo. No meso-grown cristais são geralmente pequenas. No entanto, a recolha de dados úteis de difracção tem sido possível com os cristais possuindo uma dimensão máxima de 20 um ^9. Para este efeito, micro-feixe síncrotron radiação X é usado e é o foco de um artigo separado JoVE nesta série ^32,33.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Componentes
Pinças curvas	Sigma	F4142	Ferramenta
Ponteiras descartáveis	Gilson	Vário	Descartável
Espuma dewar	Spearlab	FD-500	Ferramenta
Resíduos recipientes de vidro e metal	Daniels Saúde	DD479OL	Ferramenta
Ciclos de colheita	MiTeGen	Vário	Ferramenta
Colheita microscópio	Nikon	SMZ1500	Ferramenta
Caderno de anotações	Vário	NA	Ferramenta
Repulsão magnéticabotão varinha de carregamento de amostra	Hampton Research / dimensões moleculares	HR4-729/MD7-411	Ferramenta
Puck Original (para uso com ALS-estilo apenas robôs)	Posicionamento Sistemas de cristal	CP-111-035	Ferramenta
Dispositivos de pipetagem	Gilson	Vário	Ferramenta
Soluções precipitantes	Vário	Vário	Reagente
Puck Bent Cryo-Tong	Posicionamento Sistemas de cristal	CP-111-030	Ferramenta
Puck Cane envio Guardadas (originais ALS-style) com cabo em forma de gancho e haste de travamento	Posicionamento Sistemas de cristal	CP-111-029	Ferramenta
Água purificada	Millipore		Reagente
Óculos de segurança	Vários	NA	Ferramenta
Bases Pin amostra - magnética (cobre ou não)	Posicionamento Sistemas de cristal	CP-111-015	Ferramenta
Envio dewar	Taylor-Wharton	CX100	Ferramenta
Tecidos	NA	NA	Descartável
Carboneto de tungstênio cortador de vidro (Scriber TCT)	Ferramentas Silverline (Yeovil, no Reino Unido)	633657	Ferramenta