La purificación y la agregación de la proteína precursora amiloide del dominio intracelular

Resumen

Un método para la purificación a gran escala del dominio intracelular de APP (AICD) se describe. También describe la metodología para inducir In vitro AICD agregación y visualización por microscopía de fuerza atómica. Los métodos descritos son útiles para la caracterización bioquímica / estructural de la AICD y los efectos de las chaperonas moleculares en su agregación.

Resumen

Proteína precursora de amiloide (APP) es una proteína transmembrana de tipo I asociado con la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer (AD). APP se caracteriza por un gran dominio extracelular y un dominio citosólico corto denominado el dominio intracelular de APP (AICD). Durante la maduración a través de la vía secretora, APP puede ser escindida por proteasas denominadas α, β, y γ-secretasas ^1. La escisión proteolítica de APP secuencial con β y γ-secretasas conduce a la producción de un péptido pequeño proteolítica, Aß denomina, que es amiloidogénica y el constituyente principal de las placas seniles. La AICD también es liberado de la membrana después de la elaboración secretasa, y a través de las interacciones con Fe65 y Tip60, puede trasladar al núcleo de participar en la regulación de la transcripción de genes diana múltiples ^2,3. Interacciones proteína-proteína que implican la AICD pueden afectar el tráfico, el procesamiento y las funciones celulares de holo-APP y su C-terminfragmentos col. Recientemente hemos demostrado que puede AICD agregado in vitro, y este proceso se inhibe por la ubiquitina-1 AD-implicado chaperona molecular ^4. Consistente con estos hallazgos, la AICD ha expuesto dominios hidrófobos y está intrínsecamente desordenados in vitro ^5,6, sin embargo se obtiene una estructura secundaria estable cuando está unido a Fe65 ^7. Hemos propuesto que la ubiquitina-1 previene apropiado interacciones inter-e intramolecular de la AICD, prevenir la agregación in vitro y en células intactas ^4. Mientras que la mayoría de los estudios se centran en el papel de APP en la patogénesis de la EA, el papel de la AICD en este proceso no está claro. Expresión de AICD se ha demostrado que induce la apoptosis ^8, para modular las vías de señalización ^9, y para regular la señalización de calcio ^10. La sobreexpresión de la AICD y Fe65 en un modelo de ratón transgénico induce patología de Alzheimer como ^11, y recientemente AICD se ha detectado en el sujetadoren lisados ​​por Western Blot utilizando las técnicas apropiadas de recuperación de antígeno ^12. Para facilitar estudios estructurales, bioquímicos y biofísicos de la AICD, se ha desarrollado un procedimiento para producir cantidades grandes de proteína recombinante AICD altamente puro. Nos describen además un método para inducir la agregación en vitro térmica de AICD y el análisis por microscopía de fuerza atómica. Los métodos descritos son útiles para la caracterización bioquímica, biofísica y estructural de la AICD y los efectos de las chaperonas moleculares sobre la agregación de AICD.

Protocolo

1. Expresión recombinante de dominio intracelular APP (AICD)

1. Transformar E. coli cepa BL21 con AICD humana (residuos 649-695 de APP, neuronal numeración isoforma) clonado en el vector pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Este vector se expresa por AICD como el resto C-terminal de una proteína de fusión de glutatión-S-transferasa (GST). Este vector también codifica una secuencia de escisión de trombina para facilitar la eliminación de la fracción GST. Los detalles de la clonación AICD en pGEX-4T-1 se encuentra en nuestra publicación anterior ^4.
2. A partir de una sola colonia, inocular 10 ml de caldo LB con ampicilina (100 mg / ml), y se incuba durante la noche a 37 ° C con agitación vigorosa.
3. A la mañana siguiente, inocular 400 ml de LB / ampicilina en un matraz de un litro con 5 ml del cultivo durante toda la noche.
4. Incubar a 37 ° C con agitación vigorosa hasta que la densidad óptica a 600 nm alcanzó 0,4 a 0,6. Para ello suele tardar de 2 a 2,5 horas.

contenido "> En este punto, puede ser deseable para sacar una pequeña muestra (~ 10 l) para seguir la purificación por SDS-PAGE (véase la Figura 1A, B). Cada etapa de purificación posterior también debe tener una pequeña alícuota para análisis por SDS-PAGE.

5. Inducir la expresión de GST-AICD mediante la adición de 0,4 mM de isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG). Incubar a 37 ° C con agitación vigorosa durante 5 horas.
6. Centrifugar las células a 6.000 xg durante 15 min a 4 ° C. El sedimento de células se pueden almacenar a -80 ° C durante varios meses en este punto del procedimiento.

2. Purificación de GST-AICD

1. Preparar 50 ml de tampón de lisis como sigue: 1 mM de ditiotreitol, 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 0,1% Triton-X100, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), cóctel completo de inhibidor de proteasa (Roche Applied Science), y solución salina tamponada con fosfato. Enfríe en hielo.
2. Descongele sedimento bacteriano (si previamente congelado) enhielo.

En este punto, es fundamental que todas las etapas se realizaron a 4 º C para limitar la proteólisis. Todos los tubos, tampones, y otros reactivos deben ser enfriados previamente. Si se utiliza una prensa francesa o emulsionante para la lisis, estos deben ser enfriados previamente también.

3. Resuspender completamente el sedimento bacteriano en 20 ml de tampón de lisis. Una combinación de agitación y trituración con 10 ml pipeta en hielo asegurará la completa resuspensión del pellet.
4. Pasar las células resuspendidas bacterianas a través de un emulsionante (por ejemplo, Avestin Emulsiflex-C3) o célula de presión francesa, pre-refrigerado a 4 ° C a 30.000 psi. Pasar el lisado a través del emulsionador una segunda vez. Recoger el lisado en un tubo ml pre-enfriado 50.

La principal ventaja de estos dos instrumentos es que minimizar el calentamiento de la muestra. La técnica comúnmente utilizada de la sonicación genera mucho calor a la punta de la sonda de sonicación ypueden resultar en una agregación de proteínas recombinantes.

5. Se centrifuga el lisado a 15.000 xg durante 30 min. Separar y mantener el sobrenadante a un tubo ml pre-refrigerada 50.
6. Añadir 500 l de una suspensión al 50% de la glutatión-agarosa (Sigma-Aldrich). Rotar durante 30 min a 4 ° C. Mientras que la muestra está girando, hacer tampón de elución fresco: 50 mM de Tris 7,8, 0,1% Triton-X100, ditiotreitol 0,5 mM, 10 mM de glutatión reducido.

El único paso del protocolo, que se lleva a cabo a temperatura ambiente es la etapa de elución. Así, el tampón de elución se mantiene a temperatura ambiente. Tampón de elución debe estar recién preparado.

7. Verter el lisado y la suspensión a un desechable 5 "columna de cromatografía de poliestireno con gruesas (90-130 micras) filtros (Evergreen Scientific). Lavar la columna 5 veces con 3 ml de solución salina tamponada con fosfato.
8. Se tapa el fondo de la columna y añadir 500 l de tampón de elución a temperatura ambiente. Cerrar la parte superior de lacolumna y girar durante 5 min a temperatura ambiente. Recoger el eluido en un tubo de microcentrífuga refrigerada 1,5 ml. Repetir la elución dos veces más (1,5 ml de eluido total).
9. Dializar el eluido en una membrana de diálisis de peso molecular 10.000 de corte (por ejemplo, Thermo Scientific Slide-A-Lyzer casetes de diálisis) en 4 litros de solución salina tamponada con fosfato durante la noche a 4 ° C. Dializar contra un adicional de 4 litros de solución salina tamponada con fosfato a 4 ° C durante 1 hora al día siguiente.
10. Eliminar la proteína de la casete de diálisis y realizar un ensayo de cuantificación de proteínas para determinar el rendimiento de GST-AICD. Una purificación típica de 400 ml de cultivo se traducirá en rendimientos de> 20 mg de proteína purificada a concentraciones de 10-20 mg / ml. Dividir en partes alícuotas de la proteína en 200 ml de alícuotas y se congelan a -80 ° C.

3. Escisión de trombina de GST-AICD y purificación de la AICD

1. Descongele 200 l de GST purificado-AICD y añadir 20 l de 1 U / l thromb¡El Incubar durante una noche a 37 ° C.

La calidad y la pureza de la trombina varía considerablemente entre los fabricantes, y puede ser una fuente importante de contaminación. Utilizamos la trombina de GE Healthcare (ver tabla de reactivos). Después de la incubación durante la noche,> 95% de la proteína de fusión debe ser escindido (Figura 1B).

2. Después de la escisión con trombina durante la noche, es probable que una fracción de la AICD liberado se sometieron a la agregación y la solución aparezca turbia. Borrar el material agregado por centrifugación a 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de pre-enfriada.
3. Añadir 50 l de glutatión-agarosa suspensión al 50% y 50 l 50% de lechada p-aminobenzamidina-agarosa para eliminar el GST y trombina, respectivamente. Incubar con rotación durante 5 min a temperatura ambiente.
4. Centrifugar brevemente para sedimentar las perlas de agarosa, y eliminar el sobrenadante a un nuevo tubo. Extracto tél GST cuatro veces más con glutatión-agarosa. Una sola extracción con p-aminobenzamidina-agarosa es suficiente para eliminar la U 20 de la trombina.
5. Realizar un ensayo de cuantificación de proteínas en 5 l de la AICD purificado. Los rendimientos típicos de un cultivo de 400 ml son 50-100 mg a una concentración de 0,2 a 0,5 mg / ml. Los rendimientos más altos son posibles mediante la escisión de un mayor volumen de GST-AICD.

Purificada AICD debe estar preparado fresco para la caracterización bioquímica / biofísica. El material no utilizado debe desecharse. También es posible concentrar la AICD de la liofilización de la muestra y resuspensión en un volumen más pequeño de tampón ^6. Si la detección de AICD requiere secante (por ejemplo, después de una trampa o filtro de ensayo de dot blot), la recuperación de antígenos en la membrana debe realizarse como se describe por Pimplikar y Suryanarayana ^12.

4. Agregación AICD de Microscopía de Fuerza Atómica (AFM)

1. Diluir recién preparado AICD en phosphate solución salina tamponada a una concentración de 0,1 mg / ml en un volumen final de 15 l. En este punto, diversos compuestos y / o las proteínas se pueden añadir para determinar si inhiben la agregación AICD. Por ejemplo, se ha demostrado que las concentraciones equimolares de ubiquitina-1 prevenir la agregación de AICD en este ensayo ^4.

También es posible agregar volúmenes de reacción más grandes para experimentos bioquímicos tales como ensayos de trampa de filtro y dispersión de la luz ^4. Hemos tenido éxito en la realización de ensayos de filtro trampa en mezclas de reacción tan grande como 400 ml con DAI diluye a concentraciones tan bajas como 1 micra.

2. Inducir la agregación térmica incubando las muestras a 43 ° C con agitación a 800 rpm en un Thermomixer Eppendorf durante 48 hr. Esta temperatura se eligió basándose en ensayos de chaperonas que examinan la agregación térmica de la sintasa de chaperona modelo de citrato ^4,13 sustrato.

térmica es un método comúnmente utilizado para inducir la transición estructural de una proteína a partir de una nativa a una estructura no nativa (que es generalmente rica en lámina beta) que da lugar a la formación de agregados intermoleculares. Agregación térmica también se utiliza para examinar la función de las chaperonas moleculares, que protegen la formación de segmentos hidrófobos no apropiado interacciones intermoleculares (y por lo tanto retrasar o prevenir la agregación térmica).

3. Diluir la muestra de 20-veces en agua desionizada y 2 l mancha sobre mica recién cortado. Secar la muestra en un desecador durante una noche. Será necesario determinar empíricamente la dilución óptima para formación de imágenes, y por lo tanto varias diluciones que van de 10 - a 100-veces sería prudente.
4. Visualice la AICD agregado mediante la operación AFM en modo de contacto intermitente ^14. Los voladizos utilizados son recubiertas de oro palancas micro nitruro afilados (MSNL, Bruker) con un radio de punta nominal de 2 nm. Típico tocando amplitudes duranteING imágenes son 10-20 nm en la frecuencia de resonancia de los voladizos (30-50 kHz).

Se encontró que la calidad de imagen y el contraste de agregados de proteínas diferentes dependía de la fuerza aplicada y la duración del experimento. Para reducir al mínimo la perturbación de la muestra por la punta, se mantiene la fuerza aplicada relativamente baja, manteniendo una relación de punto de ajuste por encima de 95% y la limitación de la exploración de cada muestra a 5-10 min. El procesamiento de imágenes se realizó con WSxM software (Nanotec). Procesamiento de imágenes estándar consistía en avión resta y aplanamiento. Nuestros laboratorios utilizan una "casa-construida" AFM ¹⁵ conectado a un sistema de escaneo comercial sonda de control del microscopio (Nanotec).

5. Los resultados representativos

La expresión y enriquecimiento relativo de GST-AICD se muestra en la Figura 1A. Después de la lisis, la mayoría de la proteína de fusión está presente en la fracción soluble, y por lo tanto la extracción de inclusien los órganos no se requiere. El material eluido de la columna de glutatión agarosa es> 95% pura. En la preparación mostrada en la Figura 1, la concentración de la proteína eluida de la columna fue de 14,5 mg / ml, y el rendimiento fue de 22 mg (de un cultivo de partida de 400 ml). La escisión de 200 l de esta preparación durante la noche con 20 U de trombina dado lugar a la escisión casi el 100% de la proteína de fusión (Figura 1B). La cantidad de trombina utilizada es suficientemente baja como para no ser detectable por tinción con azul Coomassie (véase "Cleaved" carril, Figura 1B). La eliminación de la trombina y la GST dio como resultado cierta pérdida de material, sin embargo, era> 90% de pureza con un rendimiento en esta preparación de 70 g de AICD a una concentración de 0,35 mg / ml. Figura 1C muestra el diagrama de flujo para la agregación de AICD y el análisis subsiguiente. Agregados AICD fotografiadas por AFM son típicamente esferoide / amorfo, y varían en tamaño de 50 a 100 nm (Figura 1 D, F). Agregadomaterial no es detectable cuando una cantidad equimolar de la chaperona ubiquitina-1 se añade a la reacción de agregación (Figura 1E) ^4.

Figura 1. La purificación y la agregación de AICD. A) tinción con azul Coomassie de las muestras recogidas en cada paso del proceso de purificación. Para las muestras no inducidas e inducidas, 20 l de bacterias totales se hicieron correr en el gel. Para la fracción de sobrenadante, 5 l de lisado (de un volumen total de 20 ml) se hicieron correr en el gel. Para la fracción de sedimento, el sedimento se resuspendió en 20 ml de tampón de lisis, y 5 l de este material se sonicaron en un sonicador de baño de agua durante 30 min a 4 ° C antes de la carga en el gel. Para la medición de flujo, 5 l se hicieron correr en el gel. Las cantidades de eluato cargados en el gel se indican. B) azul de Coomassie de gel teñido no escindido y troceados GST-AICD (2 l) y 1 y 5 y mu, l purificado AICD. C) Diagrama de flujo de purificación AICD, agregación y análisis. D, E) Representante de imagen AFM térmicamente agregados AICD en ausencia (D) y presencia (E) de la chaperona molecular ubiquitina-1. F) Histograma de la distribución del tamaño de los agregados AICD.

Discusión

En este protocolo hemos descrito un procedimiento para la obtención de DAI de alta pureza para análisis estructurales, biofísicos y bioquímicos. Este procedimiento no requiere un equipo sofisticado y cromatografía es por tanto accesible a la mayoría de los laboratorios. Otros grupos han purificado AICD ^5-7,16, incluyendo GST-AICD ^17-19, para los análisis bioquímicos / estructural. Las desventajas de los protocolos anteriores incluyen mala solubilidad de AICD ^16, menos de pureza i...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
pGEX-4T-1	GE Healthcare	28-9545-49
La trombina	GE Healthcare	27-0846-01
Ampicilina	Fisher Scientific	BP1760
Proteína Bradford ensayo de reactivos	Bio-Rad	500-0002
Azul de Coomassie	Bio-Rad	161-0786
IPTG (isopropil-beta-D tiogalactopiranósido)	Sigma-Aldrich	I6758
Glutatión-agarosa	Sigma-Aldrich	G4510
p-aminobenzamidina-agarosa	Sigma-Aldrich	A7155
Proteasa completo cóctel inhibidor	Roche	11836170001
Slide-A-Lyzer cassettes de diálisis	Thermo Scientific	66380
Columnas para cromatografía	Evergreen Scientific	208-3367-050
Emulsionante	Avestin, Inc	Emulsiflex-C3	Altamente recomendado
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670107
Mica discos	Ted Pella	50-12
AFM voladizos	Bruker	MSNL-10
WSxM software	Nanotec	N / A	P.ee descarga