Reinigung und Aggregation des Amyloid Precursor Protein intrazelluläre Domäne

Zusammenfassung

Ein Verfahren für die großtechnische Reinigung des APP intrazelluläre Domäne (AICD) beschrieben. Wir beschreiben auch Methoden zu induzieren In vitro AICD Aggregation und Visualisierung mittels Rasterkraftmikroskopie. Die beschriebenen Methoden sind nützlich für biochemische / strukturelle Charakterisierung der AICD und die Auswirkungen der molekularen Chaperone auf die Aggregation.

Zusammenfassung

Amyloid-Vorläuferprotein (APP) ist ein Typ I Transmembran-Proteins mit der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit (AD) zugeordnet ist. APP wird durch einen großen extrazellulären Domäne und einer kurzen zytosolische Domäne bezeichnet das APP intrazelluläre Domäne (AICD) aufweist. Während der Reifung durch den sekretorischen Weg, kann APP durch Proteasen genannt α, β und γ-Sekretase ¹ gespalten werden. Sequentielle proteolytische Spaltung von APP mit β und γ-Sekretasen führt zu der Produktion eines kleinen Peptids proteolytische, genannt Aß, das amyloidogene ist und der Kernbestandteil von senilen Plaques. Die AICD ist auch befreit von der Membran nach Sekretase Verarbeitung und durch Interaktionen mit Fe65 und Tip60 kann in den Kern in Transkriptionsregulation mehrerer Zielgene ^2,3 teilzunehmen translozieren. Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen den AICD beeinträchtigen Menschenhandel, Verarbeitung und zelluläre Funktionen von Holo-APP und seine C-terminal Fragmente. Wir haben kürzlich gezeigt, dass AICD wird Aggregat kann in vitro, und dieser Prozess durch den AD-verwickelt molekularen Chaperon Ubiquilin-1 ⁴ inhibiert. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen, die AICD hat hydrophoben Domänen ausgesetzt und ist untrennbar in vitro ^5,6 ungeordnet, aber es erhält stabile sekundäre Struktur, wenn sie Fe65 ⁷ gebunden. Wir haben vorgeschlagen, dass Ubiquilin-1 unangemessen inter-und intramolekulare Wechselwirkungen von AICD verhindert die Aggregation in vitro und in intakten Zellen ^4. Während die meisten Studien über die Rolle von APP in der Pathogenese von AD zu konzentrieren, ist die Rolle in diesem Prozess AICD nicht klar. Expression AICD hat sich gezeigt, Apoptose zu induzieren ^8, zu modulieren Signalwege ⁹ und zum Calcium regulieren Signalisierung ^10. Überexpression von AICD und Fe65 in einer transgenen Mausmodell induziert wie Alzheimer Pathologie ^11, und vor kurzem hat AICD in BH nachgewiesenin Lysaten mittels Western Blot, wenn mit geeigneten Antigen-Retrieval-Techniken ^12. Um strukturelle, biochemische und biophysikalische Untersuchungen des AICD erleichtern, haben wir ein Verfahren zur rekombinanten große Mengen an hochreinem AICD Protein produzieren. Wir beschreiben außerdem ein Verfahren zur Induktion der in vitro thermische Aggregation AICD und Analyse mittels Rasterkraftmikroskopie. Die beschriebenen Methoden sind für biochemische, biophysikalische und strukturelle Charakterisierung des AICD und die Auswirkungen der molekularen Chaperone auf AICD Aggregation nützlich.

Protokoll

Ein. Expression von rekombinantem APP intrazelluläre Domäne (AICD)

1. Transform E. coli-Stamm BL21 mit menschlichen AICD (Reste 649-695 von APP, neuronale Isoform Nummerierung) in den Vektor pGEX-4T-1 (GE Healthcare) kloniert. Dieser Vektor wird als C-terminalen Teil eines Fusionsprotein von Glutathion-S-Transferase (GST) AICD exprimieren. Dieser Vektor kodiert für ein Thrombin auch Spaltsequenz um das Entfernen des GST-Einheit zu erleichtern. Details Klonierung in pGEX-4T-1 AICD finden Sie in unserem früheren Veröffentlichung ⁴ gefunden werden.
2. Aus einer einzigen Kolonie, Animpfen von 10 ml LB-Medium mit Ampicillin (100 ug / ml) und bei 37 ° C über Nacht unter starkem Schütteln.
3. Am nächsten Morgen impfen 400 ml LB / Ampicillin in einem Ein-Liter-Kolben mit 5 ml der Übernacht-Kultur.
4. Bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm erreicht hat 0,4 bis 0,6. Dies dauert in der Regel 2 bis 2,5 Stunden.

content "> An diesem Punkt kann es wünschenswert sein, um den Abschluss einer kleinen Probe (~ 10 ul), um die Reinigung durch SDS-PAGE (siehe 1A, B) zu folgen. Jede nachfolgende Reinigungsstufe sollte auch eine kleine Aliquots zur Analyse entnommen durch SDS-PAGE.

5. Induzieren die Expression von GST-AICD durch Zugabe von 0,4 mM Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG). Bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln für 5 Stunden.
6. Zentrifugation der Zellen bei 6000 × g für 15 min bei 4 ° C. Das Zellpellet kann bei -80 ° C für mehrere Monate werden an diesem Punkt des Verfahrens abgelegt.

2. Reinigung von GST-AICD

1. Planen 50 ml Lysepuffer wie folgt: 1 mM Dithiothreitol, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,1% Triton-X100, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Complete Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche Applied Science) und phosphatgepufferter Salzlösung. Chillen auf Eis.
2. Auftauen Bakterienpellet (wenn vorher eingefroren) aufEis.

An diesem Punkt ist es wichtig, dass alle Schritte bei 4 ° C durchgeführt, um die Proteolyse zu begrenzen. Alle Rohre, Puffer und andere Reagenzien sollten vorgekühlt. Wenn Sie einen Französisch drücken oder Emulgator für die Lyse, sollten diese vorgekühlten als gut.

3. Gründlich resuspendieren das Bakterienpellet in 20 ml Lyse-Puffer. Eine Kombination von Verwirbelung und Verreiben mit 10 ml Pipette auf Eis wird eine vollständige Resuspension des Pellets.
4. Passieren die resuspendierten Bakterienzellen durch einen Emulgator (z. B. Avestin EmulsiFlex-C3) oder Französisch Druckzelle, vorgekühlt auf 4 ° C bei 30.000 psi. Führen Sie das Lysat durch die Emulgator ein zweites Mal. Sammeln Sie das Lysat in ein vorgekühltes 50 ml Tube.

Der Hauptvorteil dieser beiden Instrumente ist, dass sie Erwärmung der Probe zu minimieren. Die am häufigsten verwendete Technik der Ultraschallbehandlung erzeugt erhebliche Hitze an der Spitze der Sonde und der Ultraschallbehandlungkann Aggregation von rekombinanten Proteinen führen.

5. Zentrifuge das Lysat bei 15000 × g für 30 min. Trennen Sie und halten Sie den Überstand in ein vorgekühltes 50 ml Tube.
6. Add 500 pl einer 50% igen Aufschlämmung von Glutathion-Agarose (Sigma-Aldrich). Drehen für 30 min bei 4 ° C. Während die Probe rotiert, machen frische Elutionspuffer: 50 mM Tris 7,8, 0,1% Triton-X100, 0,5 mM Dithiothreitol, 10 mM reduziertes Glutathion.

Der einzige Schritt des Protokolls, das bei Raumtemperatur durchgeführt wird, ist der Elutionsschritt. Somit wird der Elutionspuffer bei Raumtemperatur gehalten. Elutionspuffer sollte frisch zubereitet werden.

7. Gießen des Lysats und Schlamm in eine Einweg-5 "Polystyrol Chromatographiesäule mit grobem (90-130 um) Filtern (Evergreen Scientific). Die Säule wird 5 mal mit 3 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung.
8. Verschließen Sie die unteren Ende der Säule und 500 ul der Raumtemperatur Elutionspuffer. Verschließen Sie die Spitze derSäule und rotieren für 5 min bei Raumtemperatur. Sammeln des Eluats in ein gekühltes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie die Elution zwei weitere Male (1,5 ml insgesamt Eluat).
9. Dialysieren das Eluat in einem 10.000 Molekulargewichtsschnitt Dialysemembran (zB Thermo Scientific Slide-A-Lyzer Dialyse Kassetten) in 4 Liter phosphatgepufferter Kochsalzlösung über Nacht bei 4 ° C. Dialysieren gegen weitere 4 Liter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung bei 4 ° C für 1 Stunde am folgenden Tag.
10. Entfernen des Proteins aus der Kassette und Dialyse durchführen Proteinquantifizierung Assay zur Ausbeute von GST-AICD bestimmen. Ein typisches Reinigungsverfahren aus 400 ml Kultur werden in Ausbeuten von> 20 mg gereinigtem Protein bei Konzentrationen von 10-20 mg / ml ergeben. Aliquot das Protein in 200 ul Aliquots und einfrieren bei -80 ° C.

3. Thrombin Spaltung von GST-AICD und Reinigung von AICD

1. Thaw 200 ul des gereinigten GST-AICD und fügen Sie 20 ul 1 U / ul Thrombin. über Nacht bei 37 ° C.

Die Qualität und Reinheit von Thrombin variiert beträchtlich zwischen den Herstellern und können eine bedeutende Quelle von Verunreinigungen sein. Wir verwenden Thrombin von GE Healthcare (siehe Tabelle von Reagenzien). Nach Inkubation über Nacht, sollte> 95% des Fusionsproteins abgespalten (1B) ist.

2. Nachdem über Nacht Spaltung mit Thrombin, ist es wahrscheinlich, dass eine Fraktion des freigesetzten AICD Aggregation unterzogen und die Lösung trüb erscheinen. Löschen des aggregiertes Material durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand in ein vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Fügen Sie 50 ul 50% Glutathion-Agarose-Suspension und 50 ul 50% p-Aminobenzamidin-Agarose Aufschlämmung zu GST und Thrombin zu entfernen sind. Inkubieren mit einer Drehung 5 min bei Raumtemperatur.
4. Zentrifuge kurz Sediment die Agarosekügelchen, und entfernen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen. Auszug ter GST vier weitere Male mit Glutathion-Agarose. Eine einzelne Extraktion mit p-Aminobenzamidin-Agarose ist ausreichend, um die 20 U Thrombin zu entfernen.
5. Führen Sie ein Protein Quantifizierung Assay auf 5 ul des gereinigten AICD. Typische Ausbeuten aus einer 400 ml Kultur sind 50-100 ug bei einer Konzentration von 0,2 bis 0,5 mg / ml. Höhere Renditen sind möglich durch Spaltung größere Mengen an GST-AICD.

Gereinigtes AICD sollte vorbereitet biochemischen / biophysikalischen Charakterisierung frisch. Nicht verwendetes Material muss verworfen werden. Es ist auch möglich, die durch Lyophilisieren der AICD Probe und Resuspendieren in einem kleineren Volumen an Puffer ⁶ konzentrieren. Wenn Erfassen AICD erfordert Blotting (wie nach einer Filtereinheit oder Dot-Blot-Assay), Antigen Retrieval auf der Membran durchgeführt werden sollte, wie durch Pimplikar und Suryanarayana ¹² beschrieben.

4. AICD Aggregation für Atomic Force Microscopy (AFM)

1. Frisch p hergestellten verdünnen AICDhosphate Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 0,1 mg / ml in einem Gesamtvolumen von 15 ul. An diesem Punkt können verschiedene Verbindungen und / oder Proteine ​​hinzugefügt zu bestimmen, ob sie AICD Aggregation hemmen. Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass äquimolare Konzentrationen von Ubiquilin-1 Aggregation AICD verhindern in diesem Assay ^4.

Es ist auch möglich, größere Aggregat Reaktionsvolumina für biochemische Experimente wie Abfangfilter Assays und Lichtstreuung ^4. Wir haben erfolgreich war Durchführen Abfangfilter Assays auf Reaktionsgemische so groß wie 400 ul mit AICD auf Konzentrationen so niedrig wie 1 uM verdünnt.

2. Induzieren thermische Aggregation durch Inkubation der Proben bei 43 ° C unter Schütteln bei 800 rpm in einer Eppendorf-Thermomixer für 48 Stunden. Diese Temperatur wurde auf der Grundlage Chaperon Assays, die die thermische Aggregation des Modells Chaperon Substrat Citratsynthase ^4,13 untersuchen gewählt.

Thermische Aggregation ist eine häufig verwendete Methode, um den strukturellen Übergang eines Proteins aus einem nativen veranlassen, eine nicht-native Struktur (was gewöhnlich Beta-Faltblatt-reich), was zur Bildung von intermolekularen Aggregate führt. Thermische Aggregation wird auch verwendet, um die Funktion von Chaperonen, die hydrophoben Segmente aus Bilden unangemessen intermolekulare Wechselwirkungen (und damit zu verzögern oder zu verhindern thermische Aggregation) abzuschirmen untersuchen.

3. Verdünnen Sie die Probe 20-fach in deionisiertem Wasser und Spot 2 ul auf frisch gespaltenem Glimmer. Trocknen Sie die Probe in einem Exsikkator über Nacht. Es wird notwendig sein, um empirisch die optimale Verdünnung für die Bildgebung und somit mehrere Verdünnungen im Bereich von 10 - bis 100-fach wäre klug.
4. Visualisieren Sie die aggregierten AICD mit dem AFM Betriebssystem im Tapping-Modus ^14. Die Ausleger verwendet werden, sind Gold-Mikrotabletten scharfe Nitrid Hebel (MSNL, Bruker) mit einem nominalen Spitzenradius von 2 nm. Typische Klopfen Amplituden währendten Imaging sind 10-20 nm bei der Resonanzfrequenz der Ausleger (30-50 kHz).

Wir fanden, dass die Bildqualität und Kontrast verschiedener Proteinaggregate auf die aufgebrachte Kraft und die Dauer des Experiments abhing. Perturbation zu Probe durch die Spitze zu minimieren, behielten wir die angelegte Kraft relativ gering, indem sie einen Sollwert-Verhältnis oberhalb von 95% und die Begrenzung der Abtastung einer jeden Probe auf 5-10 min. Bildverarbeitung wurde mit WSxM Software (Nanotec) durchgeführt. Standard-Bildverarbeitungsfunktionen bestand aus dem Flugzeug Subtraktion und Abflachung. Unsere Laboratorien ein "Home-built" AFM ¹⁵ eine Schnittstelle zu einem kommerziellen Rastersondenmikroskop Steuerung (Nanotec).

5. Repräsentative Ergebnisse

Die Expression und relative Anreicherung von GST-AICD ist in 1A gezeigt. Nach Lyse ist die Mehrheit von dem Fusionsprotein in der löslichen Fraktion und damit Extraktion aus Inclusiauf Körper ist nicht erforderlich. Das Material, aus dem Glutathion-Agarose-Säule eluiert ist> 95% rein. Bei der Herstellung in 1 gezeigt, war die Konzentration des Proteins aus der Säule eluiert 14,5 mg / ml, und die Ausbeute betrug 22 mg (aus einer Startkultur von 400 ml). Spaltung von 200 ul dieses Präparats über Nacht mit 20 U Thrombin in Folge nahezu 100% Spaltung des Fusionsproteins (1B). Die Menge an Thrombin verwendet wird, ist niedrig genug, wie es nicht sein, nachweisbar durch Coomassie-Blau-Färbung (siehe "Cleaved" lane, Abbildung 1B). Entfernen des Thrombins und GST führte zu einem gewissen Verlust an Material, jedoch> 90% rein mit einer Ausbeute in dieser prep von 70 ug AICD in einer Konzentration von 0,35 mg / ml betrug. 1C zeigt das Flußdiagramm für die Aggregation von AICD und nachfolgende Analyse. AICD Aggregate durch AFM abgebildet sind typischerweise Sphäroids / amorph und in der Größe von 50 bis 100 nm (Abb. 1D, F). AggregierteMaterial ist nicht nachweisbar, wenn eine äquimolare Menge des Chaperon Ubiquilin-1 an die Aggregations-Reaktionsvorrichtung (1E) ⁴ zugesetzt.

Abbildung 1. Aufreinigung und Aggregation von AICD. A) Coomassie-Blau-Färbung der Proben in jedem Schritt des Reinigungsverfahrens gesammelt. Für den nicht induzierten und induzierten Proben wurden 20 ul gesamten Bakterien auf der Gel laufen. Für die Überstandsfraktion wurden 5 ul Lysat (aus einem Gesamtvolumen von 20 ml) auf dem Gel laufen. Für die Pelletfraktion wurde das Pellet in 20 ml Lyse-Puffer resuspendiert und 5 ul dieses Materials wurden in einem Wasserbad Sonicator während 30 min bei 4 ° C beschallt vor dem Laden auf das Gel. Für die Durchströmung wurden 5 pl auf dem Gel laufen. Die Mengen des Eluats auf das Gel geladen sind angegeben. B) Coomassie-Blau gefärbten Gel ungespaltenen und gespaltenen GST-AICD (2 ul) und 1 und 5 & mu; l gereinigte AICD. C) Flussdiagramm der AICD Reinigung, Aggregation und Analyse. D, E) Repräsentative AFM-Bild von thermisch aggregiert AICD in Abwesenheit (D) und in Gegenwart (E) des molekularen Chaperons Ubiquilin-1. F) Histogramm der Größenverteilung der AICD Aggregate.

Diskussion

In diesem Protokoll haben wir ein Verfahren zur Gewinnung von hochreinem AICD für strukturelle, biophysikalischen und biochemischen Analysen skizziert. Dieses Verfahren erfordert keine ausgeklügelte Chromatographie Geräte und ist damit zugänglich für die meisten Laboratorien. Andere Gruppen haben AICD ^5-7,16 gereinigt, einschließlich GST-AICD ^17-19, für biochemische / Strukturanalysen. Nachteile zu früheren Protokollen gehören schlechte Löslichkeit von AICD ^16, weniger als idea...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
pGEX-4T-1	GE Healthcare	28-9545-49
Thrombin	GE Healthcare	27-0846-01
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760
Bradford-Protein-Assay-Reagenz	Bio-Rad	500-0002
Coomassie-Blau	Bio-Rad	161-0786
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid)	Sigma-Aldrich	I6758
Glutathion-Agarose	Sigma-Aldrich	G4510
p-Aminobenzamidin-Agarose	Sigma-Aldrich	A7155
Komplette Proteaseinhibitor-Cocktail	Roche	11836170001
Slide-A-Lyzer Dialyse Kassetten	Thermo Scientific	66380
Chromatographiesäulen	Evergreen Scientific	208-3367-050
Emulgator	Avestin, Inc.	EmulsiFlex-C3	Highly recommended
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670107
Mica Disks	Ted Pella	50-12
AFM Cantilever	Bruker	MSNL-10
WSxM Software	Nanotec	N / A	Free Download