Purificação e Agregação do Domínio proteína precursora de amilóide intracelular

Resumo

Um método para a purificação em larga escala do domínio intracelular de APP (AICD) é descrita. Nós também descrevem metodologia de indução In vitro Agregação AICD e visualização por microscopia de força atômica. Os métodos descritos são úteis para a caracterização bioquímica / estrutural da AICD e os efeitos das chaperones moleculares sobre a sua agregação.

Resumo

Proteína precursora amilóide (APP) é uma proteína transmembranar de tipo I associado à patogénese da doença de Alzheimer (AD). APP é caracterizada por um grande domínio extracelular e um domínio citosólico curto denominado o domínio intracelular de APP (AICD). Durante a maturação através da via secretora, APP pode ser clivada por proteases denominadas α, β e γ-secretases ^1. A clivagem proteolítica da APP sequencial com β e γ-secretases conduz à produção de um péptido pequeno proteolítico, denominado de Ap, que é amiloidogénica e o constituinte principal das placas senis. A AICD também é libertada a partir da membrana, após o processamento secretase, e por meio de interacções com Fe65 e Tip60, pode translocar para o núcleo para participar na regulação da transcrição de genes alvo múltiplas ^2,3. Interacções proteína-proteína envolvendo a AICD podem afectar o tráfico, o processamento e as funções celulares de holo-APP e seus C-terminfragmentos al. Mostrámos recentemente que AICD pode agregar in vitro, e este processo é inibido pelo ubiquilin-1-AD implicado chaperone molecular ^4. Consistente com estes resultados, a AICD expôs domínios hidrofóbicos e está intrinsecamente desordenados in vitro ^5,6, no entanto, obtém estrutura secundária estável quando ligado ao Fe65 ^7. Propusemos que ubiquilin-1 impede inadequado interacções inter-e intramolecular da AICD, prevenindo a agregação in vitro e em células intactas ^4. Enquanto a maioria dos estudos focado o papel de APP na patogénese de AD, o papel da AICD neste processo não são claras. Expressão da AICD foi mostrado para induzir a apoptose ^8, para modular as vias de sinalização ^9, e para regular a sinalização de cálcio ^10. A sobre-expressão da AICD e Fe65 num modelo de ratinho transgénico induz patologia de Alzheimer, como ^11, e recentemente AICD foi detectado no braem lisados ​​por western blotting quando usando técnicas de recuperação de antigénios apropriados ^12. Para facilitar os estudos estruturais, bioquímicas e biofísicas da AICD, desenvolvemos um procedimento para a produção de quantidades grandes de forma recombinante altamente pura proteína AICD. Iremos descrever um método para a indução in vitro da agregação térmica da AICD e análise por microscopia de força atómica. Os métodos descritos são úteis para a caracterização bioquímica, biofísica e estrutural da AICD e os efeitos das chaperones moleculares na agregação AICD.

Protocolo

1. Expressão de domínio recombinante APP intracelular (AICD)

1. E. Transformação coli BL21 com AICD humana (resíduos 649-695 de APP, isoforma neuronal de numeração) clonado no vector pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Este vector expressará AICD como a porção C-terminal de uma proteína de fusão de glutationa-S-transferase (GST). Este vector também codifica uma sequência de clivagem pela trombina para facilitar a remoção da porção GST. Detalhes da clonagem AICD em pGEX-4T-1 pode ser encontrada na nossa publicação anterior ^4.
2. A partir de uma colónia isolada, inocular 10 ml de caldo de LB com ampicilina (100 jig / ml) e incubar durante a noite a 37 ° C com agitação vigorosa.
3. Na manhã seguinte, inocular 400 ml de LB / ampicilina, num balão de um litro com 5 ml da cultura durante a noite.
4. Incubar a 37 ° C com agitação vigorosa até a densidade óptica a 600 nm ter atingido 0,4 e 0,6. Isto normalmente levar de 2 a 2,5 horas.

> content "Neste ponto, pode ser desejável para remover uma pequena amostra (~ pi 10) para seguir a purificação por SDS-PAGE (ver Figura 1A, B). Cada passo de purificação subsequente deve ter também uma pequena alíquota removida para análise por SDS-PAGE.

5. Induzem a expressão de GST-AICD pela adição de 0,4 mM de isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG). Incubar a 37 ° C com agitação vigorosa durante 5 horas.
6. Centrifugar as células a 6.000 xg durante 15 min a 4 ° C. O pelete de células pode ser armazenada a -80 ° C durante vários meses, neste ponto do procedimento.

2. Purificação de GST-AICD

1. Preparar 50 ml de tampão de lise como se segue: 1 mM de ditiotreitol, 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 0,1% de Triton-X100, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF), cocktail inibidor de protease completo (Roche Applied Science), e solução salina tamponada com fosfato. Relaxar no gelo.
2. Descongelar pelete bacteriana (se previamente congelado) emgelo.

Neste ponto, é importante que todos os passos são realizados a 4 ° C para limitar a proteólise. Todos os tubos, tampões, e outros reagentes devem ser pré-arrefecida. Se usar uma imprensa francesa ou emulsificante para lise, estes devem ser pré-refrigerados também.

3. Completamente ressuspender o sedimento bacteriano em 20 ml de tampão de lise. Uma combinação de centrifugação e a trituração com 10 ml de pipeta em gelo assegurará completa ressuspensão do sedimento.
4. Passar as células ressuspensas bacterianas através de um emulsionante (por exemplo, Avestin EmulsiFlex-C3) ou célula de pressão Francesa, pré-refrigerada a 4 ° C a 30000 psi. Passar o lisado por o emulsionante uma segunda vez. Recolher o lisado para um tubo de ml pré-refrigerada 50.

A principal vantagem destes dois instrumentos é que eles minimizar o aquecimento da amostra. A técnica normalmente usada de sonicação produz calor significativo na ponta da sonda de ultra-sons epode resultar em agregação de proteínas recombinantes.

5. Centrifuga-se o lisado a 15.000 xg durante 30 min. Separa-se e manter-se o sobrenadante para um tubo de ml pré-refrigerada 50.
6. Adicionar 500 ul de uma suspensão a 50% de esférulas de glutationa-agarose (Sigma-Aldrich). Rodar durante 30 min a 4 ° C. Enquanto a amostra está a rodar, fazer de tampão de eluição fresco: 50 mM de Tris 7,8, 0,1% de Triton X100, 0,5 mM de ditiotreitol, 10 mM de glutationa reduzida.

O único passo do protocolo, que é realizado à temperatura ambiente é o passo de eluição. Assim, o tampão de eluição é mantida à temperatura ambiente. Tampão de eluição deve ser preparada.

7. Verter o lisado e lama numa coluna de cromatografia de 5 descartável "poliestireno com grosseiras (90-130 mm) (filtros Evergreen Scientific). Lava-se a coluna 5 vezes com 3 ml de solução salina tamponada com fosfato.
8. Tapar a parte inferior da coluna e adicionar 500 ul de tampão de eluição de temperatura ambiente. Tapar o topo dacoluna e girar durante 5 min à temperatura ambiente. Recolher o eluato num refrigerados tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita a eluição mais duas vezes (1,5 ml eluato total).
9. Dialisar o eluato num molecular da membrana de diálise de corte de peso 10000 (por exemplo, Thermo Scientific Slide-A-Lyzer de diálise cassetes) em 4 litros de solução salina tamponada com fosfato durante a noite a 4 ° C. Dializar contra um adicional de 4 litros de tampão fosfato salino a 4 ° C durante 1 hora no dia seguinte.
10. Remover a proteína a partir da cassete de diálise e realizar um ensaio de quantificação de proteína para determinar o rendimento de GST-AICD. Uma purificação típica de 400 ml de cultura irá resultar em rendimentos de> 20 mg de proteína purificada em concentrações de 10-20 mg / ml. Alíquota da proteína em alíquotas de 200 ul e congelar a -80 ° C.

3. A clivagem de trombina de GST-AICD e Purificação de AICD

1. Ul descongelamento 200 das purificada GST-AICD e adicionar 20 ul de uma Thromb U / ulpol Incubar durante a noite a 37 ° C.

A qualidade e pureza da trombina varia consideravelmente entre os fabricantes, e pode ser uma importante fonte de contaminação. Usamos trombina da GE Healthcare (ver tabela de reagentes). Após incubação durante a noite,> 95% da proteína de fusão deve ser clivado (Figura 1B).

2. Após a clivagem com trombina durante a noite, é provável que uma fracção da AICD libertada foi submetido a agregação e a solução pode parecer turva. Limpar o material agregado por centrifugação a 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de pré-arrefecida.
3. Adicionar 50 ul de 50% de esférulas de glutationa-agarose a suspensão aquosa e 50 ul de 50% de p-aminobenzamidina-agarose suspensão para remover GST e da trombina, respectivamente. Incubar com rotação durante 5 minutos à temperatura ambiente.
4. Centrifugar brevemente para sedimentar as esferas de agarose, e remover o sobrenadante para um novo tubo. Extrair tele GST mais quatro vezes com glutationa-agarose. A única extracção com p-aminobenzamidina-agarose é suficiente para remover o U 20 da trombina.
5. Executar um ensaio de quantificação de proteínas em 5 ul da AICD purificada. Os rendimentos típicos a partir de uma cultura de 400 ml são 50-100 ug, a uma concentração de 0,2 a 0,5 mg / ml. Rendimentos mais altos são possíveis por meio de clivagem de volumes maiores de GST-AICD.

Purificada AICD deve ser preparado para a caracterização bioquímica / biofísica. Material não utilizado deve ser descartado. Também é possível concentrar a AICD por liofilização da amostra e ressuspensão em um pequeno volume de tampão ^6. Se detectar AICD requer blotting (tal como após uma armadilha de filtro ou de ensaio dot blot), a recuperação do antigénio da membrana deve ser realizada como descrito por Pimplikar Suryanarayana e ^12.

4. Agregação AICD de Microscopia de Força Atômica (AFM)

1. Diluir preparado de fresco AICD em phosphate solução salina tamponada a uma concentração de 0,1 mg / ml num volume final de 15 ul. Neste ponto, vários compostos e / ou proteínas podem ser adicionados, para determinar se eles inibem a agregação AICD. Por exemplo, demonstramos que as concentrações equimolares de ubiquilin-1 prevenir a agregação de AICD neste ensaio ^4.

Também é possível acrescentar um maior volume de reacção para experiências bioquímicas, tais como ensaios de armadilha de filtragem e de espalhamento de luz ^4. Tivemos sucesso realizando ensaios de armadilha de filtro em misturas reaccionais tão grande como 400 ul com AICD diluído para concentrações tão baixas como 1 uM.

2. Induzir a agregação térmica por incubação das amostras a 43 ° C com agitação a 800 rpm num Thermomixer de Eppendorf durante 48 horas. Esta temperatura foi escolhida com base em ensaios que examinam a chaperones agregação térmica do modelo da citrato sintase chaperone substrato ^4,13.

Agregação térmica é um método vulgarmente utilizado para induzir a transição estrutural da proteína nativa a partir de uma estrutura para um não-nativo (que é geralmente folha beta rico), que resulta na formação de agregados intermoleculares. Agregação térmica também é utilizado para examinar a função de chaperonas moleculares, os quais protegem os segmentos hidrofóbicos de formar inadequado interacções intermoleculares (e, assim, retardar ou evitar a agregação térmica).

3. Dilui-se a amostra 20 vezes em água desionizada e ul ponto 2 sobre mica clivada de fresco. Seca-se a amostra num exsicador durante a noite. Será necessário determinar empiricamente a diluição óptima para a imagiologia, e, portanto, várias diluições que variam de 10 - e 100 vezes seria prudente.
4. Visualize a AICD agregado utilizando a operação AFM em modo de tocar ^14. As vigas são utilizados ouro revestidas com nitreto de micro alavancas afiados (MSNL, Bruker), com um raio da ponta nominal de 2 nm. Típico tocando durante amplitudesção de imagem são 10-20 nm, a frequência de ressonância das consolas (30-50 kHz).

Nós descobrimos que a qualidade da imagem e do contraste de agregados de proteínas diferentes dependia da força aplicada e da duração da experiência. Para minimizar a perturbação da amostra pela ponta, é mantida a força aplicada relativamente baixo, mantendo uma relação de set-point acima de 95% e limitando o varrimento de cada uma das amostras de 5-10 min. Processamento de imagem foi realizada com WSxM software (Nanotec). Processamento de imagem padrão consiste em avião subtração e achatamento. Nossos laboratórios utilizam uma "casa-construída" AFM ^15, interligados a um sistema de digitalização sonda comercial controle microscópio (Nanotec).

5. Resultados representativos

A expressão e um enriquecimento relativo de GST-AICD é mostrado na Figura 1A. Após a lise, a maior parte da proteína de fusão está presente na fracção solúvel e, portanto, a extracção a partir de inclusiem órgãos não é necessária. O material eluído da coluna de agarose de glutationa é> 95% puro. Na preparação mostrado na Figura 1, a concentração de proteína eluída da coluna foi de 14,5 mg / ml, e o rendimento foi de 22 mg (a partir de uma cultura inicial de 400 ml). A clivagem de 200 ul da preparação, durante a noite, com 20 U de trombina resultou em quase 100% de clivagem da proteína de fusão (Figura 1B). A quantidade de trombina utilizada é suficientemente baixo para não ser detectáveis ​​por coloração com azul de Coomassie (ver "Clivadas" pista Figura 1B). A remoção da trombina e GST resultou em alguma perda de material, no entanto, foi> 90% puro com um rendimento nesta preparação de 70 ug de AICD, a uma concentração de 0,35 mg / ml. Figura 1C mostra o diagrama de fluxo para a agregação de AICD e subsequente análise. Agregados AICD fotografada por AFM são tipicamente esferoidais / amorfa, e variam em tamanho de 50 a 100 nm (Figura 1D, F). Agregadomaterial não é detectável, quando uma quantidade equimolar da chaperona ubiquilin-1 é adicionado à reacção de agregação (Figura 1E) ^4.

Figura 1. Purificação e agregação de AICD. A) Coloração com azul de Coomassie de amostras recolhidas em cada passo do processo de purificação. Para as amostras não induzidas e induzidas, 20 uL de bactérias totais foram corridas no gel. Para a fracção sobrenadante, 5 ul de lisado (a partir de um volume total de 20 ml), foram executados no gel. Para a fracção de sedimento, o sedimento foi ressuspenso em 20 ml de tampão de lise, e 5 ul deste material foram sonicadas num sonicador de banho de água durante 30 min a 4 ° C antes do carregamento para o gel. Para o fluxo contínuo, 5 pi foram corridos no gel. As quantidades de líquido eluído carregadas no gel são indicadas. B) de Coomassie azul do gel corado não clivada e clivada GST-AICD (2 ul) e 1 e 5 m &u; l purificada AICD. C) Fluxograma de purificação AICD, agregação e análise. D, E) representativas de imagem AFM termicamente agregada AICD na ausência (D) e na presença (E) da chaperona molecular ubiquilin-1. F) Histograma da distribuição de tamanho de agregados AICD.

Discussão

Neste protocolo temos delineado um procedimento para obter AICD altamente puro para análises estruturais, biofísicos e bioquímicos. Este procedimento não requer equipamento sofisticado cromatografia e é, portanto, acessível para a maioria dos laboratórios. Outros grupos têm purificada AICD ^5-7,16, incluindo GST-AICD ^17-19, para as análises bioquímicas / estrutural. Desvantagens aos protocolos anteriores incluem fraca solubilidade do AICD ^16, menos do que ideal pureza ^17,

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
pGEX-4T-1	GE Healthcare	28-9545-49
Trombina	GE Healthcare	27-0846-01
Ampicilina	Fisher Scientific	BP1760
Bradford reagente de ensaio de proteínas	Bio-Rad	500-0002
Coomassie azul	Bio-Rad	161-0786
IPTG (isopropil-beta-D tiogalactopiranósido)	Sigma-Aldrich	I6758
Glutationa-agarose	Sigma-Aldrich	G4510
p-aminobenzamidina-agarose	Sigma-Aldrich	A7155
Cocktail inibidor de protease completo	Roche	11836170001
Slide-A-Lyzer cassetes de diálise	Thermo Scientific	66380
Colunas de cromatografia	Scientific Evergreen	208-3367-050
Emulsificante	Avestin, Inc	EmulsiFlex-C3	Altamente recomendado
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670107
Discos de mica	Ted Pella	50-12
Cantilevers de AFM	Bruker	MSNL-10
WSxM software	Nanotec	N / A	Free Download