Los explantes blastómeras para la Prueba de Compromiso destino celular durante el desarrollo embrionario

Resumen

El destino de una célula embrionaria individual puede ser influenciada por las moléculas hereditarias y / o por las señales de las células vecinas. Utilizando los mapas de destino de la etapa de escisión de embriones de Xenopus, blastómeras individuales pueden ser identificados por la cultura de forma aislada para evaluar las contribuciones de moléculas hereditarias frente a las interacciones célula-célula.

Resumen

Mapas de Destino, construidas a partir de linaje rastreo de todas las células de un embrión, revelan que los tejidos descienden de cada célula del embrión. Aunque los mapas destino son muy útiles para la identificación de los precursores de un órgano y para elucidar la vía de desarrollo por el que las células descendientes rellenar ese órgano en el embrión normal, no ilustran el potencial de desarrollo de una célula precursora o identificar los mecanismos por los cuales su destino está determinado. Para poner a prueba el compromiso del destino celular, se compara repertorio normal de una célula de descendientes en el embrión intacto (el mapa de destino) con los que se expresan después de una manipulación experimental. Es el destino de la célula fija (comprometido), independientemente del entorno celular, o es influenciado por factores externos facilitados por sus vecinos? Usando los mapas completos destino del embrión de Xenopus, se describe cómo identificar, aislar y única cultura precursores estadio de división, llamado blastomeres. Este enfoque permite evaluar si estas células tempranas están comprometidos con el destino que adquieren en su entorno normal en el embrión intacto, requieren interacciones con sus células vecinas, o puede ser influenciada para expresar destinos alternativos, si expuesto a otros tipos de señales.

Introducción

Xenopus laevis embriones se han utilizado ampliamente para identificar los mecanismos por los cuales las células embrionarias adquieren sus destinos específicos debido a que sus huevos son lo suficientemente grandes para permitir que los enfoques de microcirugía. Además, se desarrollan de forma externa sin la necesidad de suplementación nutricional del medio de cultivo debido a que cada célula contiene un rico suministro intracelular de las plaquetas de yema de que proporcionan una reserva de energía intrínseca. Un activo importante para el estudio de los mecanismos por los cuales se determina el destino celular es el conjunto completo de mapas de destino de los blastómeros estadio de división (de 2 - a través de las etapas de 32 células) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Estos mapas fueron construidos por microinyección de una molécula detectable en un blastómeras, identificables y seguimiento posterior en el desarrollo de los tejidos que están pobladas por los descendientes etiquetados. Mapas consistentes destino son posibles porque los ejes cardinales de los embriones pueden ser identificadas con toda fiabilidad en muchos embryos. En primer lugar, en todos los embriones de tipo salvaje del hemisferio animal es pigmentada, mientras que el hemisferio vegetal no lo es. En segundo lugar, la entrada del esperma en la fertilización produce una contracción de la pigmentación hemisferio animal hacia el lado ventral futuro; en muchos embriones una diferencia pigmentación por lo tanto se puede utilizar para discriminar entre los lados dorsal y ventral. En tercer lugar, el surco de división primera aproxima el plano sagital medio en la mayoría de los embriones, y por lo tanto se puede utilizar para identificar los lados derecho e izquierdo del embrión. Los mapas de destino también se basan en el hecho de que, naturalmente, los huevos fertilizados con frecuencia se unirá en patrones regulares que hacen que cada blastómero identificable a través de una gran población de embriones. Si bien existe variabilidad dentro y entre las puestas de huevos respecto a los patrones de pigmentación y de escisión, utilizando procedimientos de selección descritos en este documento permite que las células con destino prescritos a ser identificado con una precisión del 90% aproximadamente.

Destinos celulares pueden disuadirextraído durante la embriogénesis por varios mecanismos. Los factores intrínsecos, tales como diferencialmente heredados mRNAs citoplasmáticas o proteínas, contribuyen a varios aspectos del patrón temprano. Por ejemplo, específicos de mRNAs materna determinar qué células contribuirán a la línea germinal, se convierten en el endodermo, o contribuir al eje del cuerpo dorsal (revisado en ^7). Los factores extrínsecos proporcionados localmente por células vecinas o más alejadas de un centro embrionario de señalización, son responsables de la inducción de tipos específicos de tejidos y patrones casi todos los sistemas de órganos. Ejemplos de centros de señalización incluyen la organizador / nodo en la gástrula que induce el ectodermo neural y los patrones del mesodermo, y la zona de actividad polarizante que los patrones del eje anterior-posterior del primordio de la extremidad. Aunque los mapas destino identificar los precursores de los diferentes órganos y revelar la vía de desarrollo adoptadas por sus descendientes en el embrión normal, que no pueden distinguir entre intrínsecay influencias extrínsecas en esas células. También no revelan el potencial de desarrollo de una célula, cuyos descendientes diferenciar en el complejo entorno de señalización del embrión. Dos enfoques experimentales pueden probar si el destino de una célula está determinada por factores intrínsecos o sea posteriormente influida por factores externos: 1) el trasplante de la célula a una ubicación nueva en el embrión, o 2) la eliminación de la célula del embrión seguido por cultivo en la ausencia de señales exógenas.

Ambos enfoques experimentales han sido factible en Xenopus porque las células son suficientemente grandes para separar manualmente. Por ejemplo, numerosos estudios han eliminado las células individuales a partir de embriones (para cambiar interacciones célula-célula) o células trasplantadas a lugares nuevos en los embriones de acogida para probar los cambios de destino (revisado en ^{7, 8, 9).} Además, el segundo enfoque de la explantación pequeño número de células de diferentes regiones del embrión icultura ONT para dilucidar las interacciones inductivas de tejido en ausencia de factores exógenos es posible debido a que las células del embrión de Xenopus se llenan con un almacén intracelular de nutrientes, las plaquetas de yema. Por lo tanto, se pueden cultivar durante unos días en un medio definido sin sal suplementación nutricional o factor de crecimiento del medio de cultivo. Hemos usado este enfoque para demostrar que los blastómeros animales dorsales tienen una capacidad autónoma para producir tejidos mesodérmicos neuronales y dorsal debido a la herencia materna mRNAs ^{10, 11,} y otros mostraron que mesodermo especificación de 32-celulares blastómeros se basa tanto en la información intrínseca y extrínseca ¹² . Una ventaja de cultivar células como explantes es que el medio también se puede complementar con factores de señalización definidos para determinar que la célula-a-célula vía de comunicación podrían influir en el destino de la célula explantado ^{12, 13, 14.} Además, se puede inyectar el pr blastómeroior a la cultura con ARNm para sobre-expresar un gen, o con oligonucleótidos anti-sentido para evitar la traducción de los ARNm endógenos. Estos, ganancia y pérdida de función de análisis puede identificar moléculas que se requieren para un destino autónoma expresado. Para analizar el destino del explante, la identificación de tipos específicos de células puede llevarse a cabo por la expresión de genes estándar (por ejemplo, hibridación in situ, RT-PCR) y ensayos inmunocitoquímicos. Este protocolo proporciona un simple, pero poderoso, forma de distinguir entre los mecanismos intrínsecos y extrínsecos que regulan el funcionamiento de una célula embrionaria se desarrolla en tejidos específicos.

Protocolo

1. Preparación de los medios de comunicación, Cultura Instrumentos y platos

1. Enfocar cuatro pinzas con película abrasivo de alúmina. Haga esto bajo un microscopio de disección para controlar el tamaño de la punta. Un par de pinzas sirve como una copia de seguridad en caso de que una punta se daña durante el procedimiento. Autoclave las cuatro pinzas y almacenar en un recipiente estéril.
2. Hacer cada 500 ml de medio de cultivo 0,1 X 1,0 X y (ya sea modificado de Marc Ringers [MMR] o salinos Modificado Barth [MBS]; recetas en ¹⁵⁾ y el filtro de esterilización. Habitualmente usamos MBS (1X = 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl _2, 1 mM MgSO _4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCO _3). Almacenar a 14-18 ° C durante meses.
3. Haga una solución de agarosa al 2% en medio de cultivo (2 g electroforesis en agarosa al grado en 100 ml de medio de cultivo 1X en una botella de vidrio tornillo de la tapa). Esterilizar en autoclave para disolver la agarosa. Esto se puede almacenar a 4 ° C durante meses, y calentados para licuar la agarosa cuando se necesitaba siguiente.
4. Mientras que la agarosa es líquido, se vierte sobre 0,5 ml en el fondo de cada pocillo de una placa de cultivo estéril 24-así. Esto evitará que los explantes se pegue al plástico.
5. Mientras que la agarosa es líquido, se vierte sobre 2-3 ml en el fondo de dos a tres 60 mm placas de Petri, y agitar suavemente para asegurarse de que el fondo está cubierto. Estos servirán como platos de disección y la agarosa impide embriones se pegue al plástico una vez que sus membranas se retiran.
6. Cuando la agarosa se ha enfriado y endurecido, la llama de la punta de una pipeta 6 "Pasteur hasta que se funde en una bola, y ligeramente toque en la superficie de la agarosa en cada pocillo de la placa de cultivo. Esto creará una depresión poco profunda en la que el explante se coloca.
7. Llenar cada pocillo de la placa de cultivo con medio de cultivo estéril 1X.
8. Cuando la agarosa se haya enfriado y endurecido, llenar el plato de disección con medio de cultivo diluido (0,1 X MMR o MBS 0.1x) para facilitar la separación de blastómeros.

2. Selección de embriones

1. Obtención de huevos fertilizados y eliminar capas de la jalea de acuerdo con protocolos estándar de ^15. Transferirlos a un medio de cultivo en una placa de 0,5 X 100 mm Petri.
2. Cuando los embriones llegar a la etapa 2-células, ordenar aquellos en los que el surco de división divide la primera área ligeramente pigmentado en el hemisferio animal (Figura 1) en un plato separado. Estos serán los donantes de los explantes. Mantenga las restantes celdas de 2 embriones en un plato aparte junto a los embriones de donantes de todo el procedimiento para servir como controles de hermanos para organizar los explantes.

3. Preparación de explantes

1. Coloque 5-10 embriones en un plato de disección, pero sólo funcionan en un embrión en un momento.
2. Coloque el embrión por lo que la primera transparente membrana vitelina se puede ver, que está separada por un espacio libre (espacio perivitelino) por encima de la superficie del polo animal del embrión. Uso de una fuerza de afiladops en la mano subdominante (mano izquierda si es diestro), sujete la membrana vitelina por encima del espacio perivitelino. Usando unas pinzas afiladas en la otra mano, sujete la membrana cerca de la punta de unas pinzas en primer lugar, y tire suavemente en dirección opuesta a la cáscara de la membrana de distancia. Hacer el alcance inicial a una distancia desde la célula que va a ser disecado, de modo que la célula diana no está dañado durante la extracción de la membrana. Uno puede decir que la membrana se ha eliminado debido a que el embrión se aplanan.
3. Agarre una célula vecina con las pinzas en la mano subdominante y utilizar esta celda como un "mango" así que la célula a ser disecado no se toca directamente. Con las pinzas en la otra mano, tire suavemente las células vecinas restantes lejos de la blastómero deseado. Si las células de la línea media, que comparten el mismo destino, se contemplan, se pueden eliminar juntos como una pareja. Por último, diseccionar la "manija" célula.
4. Levante el blastómeros (o par de blastómeros), con una estéril, Pipeta Pasteur de vidrio, evitando burbujas de aire y de aspiración excesiva. La pipeta puede ser pulida al fuego para eliminar los bordes afilados que pueden dañar las células, pero no suelen hacerlo. Colocar la punta de la pipeta Pasteur bajo la superficie del medio de cultivo en un pocillo de la placa de cultivo de explante, y expulsar suavemente el blastómero. Debe caer en la depresión baja por gravedad. El blastómero mismo de más de un embrión se pueden combinar en un solo explante.
5. Repita este procedimiento con los embriones restantes en el plato de disección, uno por uno. Después de aproximadamente 10 embriones, el plato de disección se llena de restos celulares. Cuando esto ocurre, cambiar a un plato fresco disección.
6. Después de todas las disecciones terminado, comprobar si los explantes se encuentran en las depresiones poco profundas. Si no, pueden colocarse suavemente en la depresión con un bucle de pelo que ha sido esterilizado en 70% de etanol y se secó al aire.
7. Alrededor de una hora después de la disección último, retirar escombros surrouhallando los explantes curadas con una pipeta estéril, vidrio Pasteur.
8. Cultura de la placa de los explantes a 14-20 ° C al lado de la placa de Petri que contiene el hermano, los embriones de control. Embriones de hermanos indicará la etapa de desarrollo de los explantes blastómero.

4. Los explantes de cosecha para el Análisis de

1. Cosechar los explantes cuando los hermanos llegan a la etapa de desarrollo deseado. Estos explantes sobreviven muy bien, incluso si algunas de las células se desintegran. Por lo tanto, si hay una masa nublado en el pocillo de cultivo, que explorar con un bucle de pelo o fórceps para determinar si un explante sano está enterrado dentro.
2. Recoger explantes en un pequeño volumen de solución de cultivo con una pipeta Pasteur de vidrio, y suavemente expulsarlos en un tampón de lisis adecuado o fijador para que el ensayo se llevó a cabo.

Resultados

La capacidad de este ensayo para evaluar con precisión el potencial de desarrollo de la célula se basa en la disección de la blastómero correcto basado en el destino mapas ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Por lo tanto, es fundamental para elegir embriones con el patrón de pigmentación correcta en la etapa 2-células, como se ilustra en la Figura 1, que posteriormente se ajustan a los patrones de escisión regulares, como se ilustra en la Figura 2. Si se observa según los embriones a ...

Discusión

Los pasos más críticos para el cultivo con éxito de blastómeros individuales son: 1) identificar correctamente el blastómero de interés, 2) el mantenimiento de un cultivo estéril, saludable y 3) células de disección en la parte correcta del ciclo celular, y 4) la elaboración del manual necesario destreza para evitar daños durante la disección y transferir a la cultura también.

Para manipular blastómeras específicas, es esencial para ser capaz de identificar los ejes cardinales...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Película abrasivo de alúmina	Thomas Scientific	# 6775E-38	Campo (12 micras), para grandes reparaciones de puntas de las pinzas
Película abrasivo de alúmina	Thomas Scientific	# 6775E-46	Medio (3 m), para bien afilado de puntas de las pinzas
Película abrasivo de alúmina	Thomas Scientific	# 6775E-54	Fine (0,3 m), para el pulido de puntas de las pinzas
Pinzas: Dumont, Dumoxel Biologie # 5	Herramientas Artes Ciencias	# 11252-30	Estos tienen las puntas finas que no necesitan ser afilados cuando se adquirió. Resistente a la corrosión, para que puedanse esteriliza en autoclave.
La gentamicina solución	Sigma	G1397	Añadir al medio en el mismo día de uso