Blastomer Eksplantlarından Embriyonik gelişim sırasında Hücre Kader Taahhüt Test Etmek için

Özet

Tek bir embriyonik hücre kaderi, kalıtsal molekülleri ve / ya da hücrede gelen sinyalleri tarafından etkilenebilir. Klivaj dönemi Xenopus embriyosunun kaderi haritaları kullanarak, tek blastomer hücre-hücre etkileşimleri karşı kalıtsal molekül katkıları değerlendirmek için izole kültür için tespit edilebilir.

Özet

Embriyonun hücrelerinin tüm takip soyundan inşa Kader haritalar, dokuların embriyonun her hücre soyundan olduğunu ortaya. Kader haritaları bir organın öncüleri belirlenmesi için ve alt hücrelerinin, normal olarak embriyo bu organ doldurmak hangi gelişim yol ortaya çıkması için çok faydalı olmasına rağmen, bir öncü hücre tüm gelişim potansiyelinin veya göstermektedir mekanizmaları tespit olmayan hangi onun kaderi belirlenir. Hücre kaderinin bağlılığı test etmek için, tek bir deneysel manipülasyon sonrasında ifade olanlarla sağlam embriyonun (kaderi harita) in soyundan bir hücrenin normal repertuarı karşılaştırır. Hücrenin kaderini çevreleyen hücresel ortamı ne olursa olsun (kararlı) sabittir, ya da komşuları tarafından sağlanan dış faktörler tarafından etkilenir? Xenopus embriyosunun kapsamlı kaderi haritaları kullanarak, biz nasıl belirleneceği açıklanmaktadır, izole ve kültür tek klivaj dönemi öncüllerinin blasto denirMeres. Bu yaklaşım bir bu erken hücreler onların komşu hücreleri ile etkileşim gerektiren, sağlam embriyonun normal ortamda elde kaderi kararlıyız, veya sinyaller diğer türlerine maruz kalırsa alternatif kaderi ifade etkilemiş olup olmadığını değerlendirmenizi sağlar.

Giriş

Xenopus laevis embriyoların yumurta mikrocerrahi yaklaşımları izin verecek kadar büyük olduğundan embriyonik hücreler kendilerine özgü kaderi elde hangi mekanizma tanımlamak için yaygın faydalanılmıştır. Her bir hücre, bir iç enerji deposu sağlayan sarısı trombosit açısından zengin hücre içi kaynağı ihtiva eder çünkü Ek olarak, kültür ortamı besin takviyesi için gerek kalmadan dıştan gelişir. ^{1, 2, 3, 4, 5, 6} - kaderin hücre belirlenir hangi mekanizma ile çalışılması için önemli bir varlık (32-hücre aşamaları den 2) bölünme aşama blastomerlerin kader haritaları kapsamlı bir kümesidir. Bu haritalar, tek bir tanımlanabilir blastomer içine saptanabilir molekülü microinjecting ve dokuların etiketli soyu tarafından doldurulur hangi sonraki gelişimi izlenerek inşa edilmiştir. Embriyoların kardinal eksenleri güvenilir birçok Embry tespit edilebilir, çünkü tutarlı kaderi haritalar mümkündüros. Bitkisel yarımkürede değil iken Öncelikle, tüm yabani tip embriyolar hayvan yarımkürede, pigmentli olduğunu. İkincisi, döllenme de sperm girişini geleceğe ventral tarafta doğru hayvan yarımkürede pigmentasyon bir kasılma neden olur; birçok embriyo bir pigmentasyon farklılığı dolayısıyla dorsal ve ventral taraf arasında ayırımcılık kullanılabilir. Üçüncüsü, ilk bölünme karık böylece orta sagital en embriyolarında düzlem ve embriyonun sağ ve sol taraf tanımlamak için kullanılabilir yaklaşır. Kaderi haritaları da doğal embriyo büyük bir nüfus üzerinde her blastomer tanımlanabilir yapmak düzenli desenler yumurtaları sık çatlatma döllenmiş gerçeğine dayanmaktadır. Içinde tarif ve seçim yöntemleri kullanarak, pigmentasyon ve yarılma desen ile ilgili olarak yumurta kavramalar arasında değişkenlik olsa da, burada belirtilen akibetlerini hücrelerin yaklaşık% 90 doğruluk ile tespit edilmesini sağlar.

Hücre kaderi caydırmak olabilirçeşitli mekanizmalarla embriyogenez sırasında mayınlı. Böyle ayirt kalıtsal sitoplazmik mRNA veya protein gibi içsel faktörler, erken desenlendirme çeşitli yönleri katkıda bulunur. Örneğin, belli mRNA'ların anne hücreleri, mikrop hattı katkı endoderm olmak, ya da vücut dorsal eksen ⁽⁷ te gözden geçirilmiştir) katkı olduğu. Embriyonik bir sinyalizasyon merkezine daha uzak komşu hücreler veya yerel olarak sağlanan dış faktörler, spesifik doku tipleri ve desenlendirme hemen her organ sistemini indükleyen sorumludur. Sinyalizasyon merkezleri örnekleri nöral ektoderm ve desenler mezoderm indükler gastrula içinde organizatör / düğüm ve aktivite kutuplaştırıcı bölgesini içeren ekstremite tomurcuğu modellerini ön-arka eksen. Kader haritalar farklı organların öncüleri belirlemek ve normal embriyo onların torunları tarafından alınan gelişimsel yolu açığa karşın, intrinsik ayırt edemezve bu hücreler üzerinde dışsal etkiler. Onlar da soyundan embriyonun karmaşık sinyal ortamında farklılaştırmak bir hücre, tam gelişim potansiyelini açığa vurmam. Kültür ardından embriyodan hücre alınması ya da 2), yeni bir embriyo konuma) 1 hücre transplantasyonu: İki deneysel yaklaşımlar, hücrenin kaderini intrensek faktörler tarafından belirlenir veya sonradan dış faktörden etkilenen olup olmadığını test edebilirsiniz eksojen sinyallerin yokluğunda.

Hücreler elle ayrılması için yeterince büyük olduğundan hem deneysel yaklaşımlar Xenopus uygulanabilir olmuştur. Örneğin, çok sayıda çalışmalar ^{(7 yorumlanan 8, 9)} kader değişiklikleri test etmek için ana embriyolarda romanı yerlere embriyolar (hücre-hücre etkileşimleri değiştirmek için) veya nakledilen hücrelerin tek hücre sildiniz. Buna ek olarak, embriyonun farklı bölgelerinde hücreleri az sayıda eksplante yılının ikinci yaklaşımı iXenopus embriyo hücrelerinin hücre içi bir besin deposu, yumurta sarısı trombosit ile doldurulmaktadır çünkü dış faktörler yokluğunda indüktif doku etkileşimlerinin aydınlatmak için nto kültür mümkündür. Bu nedenle, kültür ortamının veya besin takviyesi büyüme faktörü olmadan belirli bir tuz ortam içinde bir kaç gün kültive edilebilir. Biz dorsal hayvan blastomer maternal kalıtım mRNA'ların ^{10, 11} bağlı sinir ve dorsal mezodermal dokular üretmek için özerk bir yeteneği var, ve diğerleri 32-hücreli blastomer bu mezoderm özellikleri içsel ve dışsal bilgiler ¹² hem dayanmaktadır gösterdi göstermek için bu yaklaşımı kullanmış . Eksplant olarak kültür hücrelerinin bir avantajı da orta eksplante hücre ^{12, 13, 14} kaderi etkileyebilecek olan hücre-hücre iletişim yolu belirlemek için tanımlanmış sinyal faktörleri ile takviye edilebilir olmasıdır. Buna ek olarak, bir tane blastomerli pr enjekteendojen mRNA'ların çevirisi önlemek için aşırı ekspres bir gen veya anti-sense oligonükleotidlerle için mRNA ile kültür IOR. Bunlar, kazanç ve kayıp fonksiyon-analizler molekülleri özerk ifade kaderi için gerekli olan belirleyebilirsiniz. Eksplant kaderini analiz etmek için, spesifik hücre tipleri kimlik standart gen ifadesi (örneğin, in situ hibridizasyon, RT-PCR) ve immünohistokimyasal analizleri ile gerçekleştirilebilir. Bu protokol bir embriyonik hücre spesifik dokularda gelişir nasıl düzenleyen içsel ve dışsal mekanizmalar arasındaki ayrım basit ama güçlü bir yol sağlar.

Protokol

1. Aletler, Kültür, Medya ve Yemekleri hazırlanması

1. Alümina aşındırıcı film kullanarak dört forseps Sharpen. Ucu boyutunu izlemek için bir diseksiyon mikroskobu altında yapın. Forseps Bir çift bir back-up durumda bir ipucu işlem sırasında hasarlı olarak hizmet vermektedir. Dört forseps otoklav ve steril bir kap içinde saklayın.
2. Ve filtre sterilize; 500 ml 0,1 X ve 1.0X kültür ortamı her ⁽¹⁵ tarifler ya Marc Modifiye Zil [MMR] veya Modifiye Barth'ın Salin [MBS]) olun. Biz rutin MBS (; 1 mM KCl, 0.7 _mM CaCl2, 1 mM _MgSO4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCO ₃ 1X = 88 mM NaCI) kullanın. Ay boyunca 14-18 ° C'de depolayın.
3. Kültür ortamı (bir vidalı kapak cam şişede 100 ml 1X besiyerine 2 g elektroforez dereceli agaroz)% 2'lik agaroz çözüm olun. Agaroz çözmek için otoklav. Bu ay için 4 ° C sıcaklıkta saklanır ve sonraki gerektiğinde agaroz sıvılaştırmak için mikro dalgada edilebilir.
4. Agaroz sıvı iken, bir steril 24 oyuklu kültür plakanın her alt üzerine yaklaşık 0.5 ml dökün. Bu plastik yapışmasını eksplantlar engeller.
5. Agaroz sıvı iken, 02:58 60 mm Petri kapları alt üzerine yaklaşık 2-3 ml dökün ve girdap yavaşça alt kapalı olduğundan emin olun. Bu diseksiyon yemekleri olarak hizmet verecek ve onların membranlar kaldırıldıktan sonra agaroz plastik yapışmasını embriyolar önler.
6. Agaroz soğutuldu ve sertleştikten sonra, alev 6 "Pasteur pipet ucu bir top haline erir ve hafifçe kültür plakasının her bir kuyu içinde agaroz bir yüzey üzerine temas edene dek. Bu sığ bir oyuk oluşturur içine eksplant alınacaktır.
7. 1X steril besiyeri ile kültür plakanın her doldurun.
8. Agaroz soğutulur ve sertleşmiş olduğunda, blastomer ayrılmasını kolaylaştırmak için seyreltilmiş kültür ortamı (0,1 X 0,1 X MMR veya MBS) ile diseksiyon çanak doldurun.

2. Embriyolar Seçimi

1. Döllenmiş yumurta elde edilir ve standart protokoller ^15'e göre jöle kat çıkarın. 100 mm Petri kabındaki 0.5x kültür ortamına aktarabilirsiniz.
2. Embriyoların 2-hücreli aşamaya ulaşmak zaman, ilk bölünme karık ayrı bir çanak içine hayvan yarımkürede hafifçe pigmentli alanı (Şekil 1) bisects o hangi sıralayabilirsiniz. Bu eksplantlar için donör olacaktır. Eksplantlar sahnelemeye kardeş denetimleri olarak hizmet prosedür boyunca donör embriyolar yanında ayrı bir çanak içinde kalan 2 hücreli embriyolar tutun.

3. Eksplant Hazırlanması

1. Bir diseksiyon çanak 5-10 embriyolar yerleştirin, ancak bir kerede yalnızca tek bir embriyo üzerinde çalışmak.
2. Şeffaf zar vitellin görülebilir, böylece ilk embriyo yerleştirin; o embriyonun hayvan kutup yüzeyi üzerinde bir açıklık (boşluk perivitelline) ile ayrılır. Bilenmiş bir kuvvet kullanmaKişinin subdominant taraftan (biri sağ elini ise sol) ps, perivitelline alanın üstünde vitellin membran kavramak. Öte yandan bir bilenmiş forseps kullanarak, ilk forseps ucu yakın membran tutup, yavaşça uzakta membran soyma ters yönde çekin. Hedef hücre zarı çıkarılması sırasında hasar görmesini şekilde kesilerek edilecek olan hücre belli bir mesafede ilk kavrama edin. Bir embriyo dümdüz olacak, çünkü membran kaldırıldı söyleyebilirim.
3. Subdominant el forseps ile bir komşu hücre tut ve disseke edilecek hücrenin doğrudan temas etmeyecek şekilde bir "kol" olarak bu hücre kullanın. Diğer yandan da forseps ile hafifçe istenen blastomerli uzak kalan komşu hücreler çekin. Aynı kaderi paylaşıyoruz midline hücreleri, hedef varsa, onlar bir çift olarak birlikte çıkartılabilir. Son olarak, "sap" hücreyi teşrih.
4. Steril olan blastomer (veya blastomer çifti), Pick up, Cam Pasteur pipeti, hava kabarcıkları ve aşırı emme kaçınarak. Pipet hücrenin zarar verebilir keskin kenarları kaldırmak için yangın cilalanmış olabilir, ama rutin olarak bunu yapmayın. Eksplant kültürünü çanak bir çukurda kültür ortamı yüzeyinin altında Pasteur pipet ucu yerleştirin, yavaşça blastomerli çıkarmak. Bu yerçekimi tarafından sığ bir depresyon içine girmelidir. Birden fazla embriyo aynı blastomerli tek bir eksplant olarak kombine edilebilir.
5. Diseksiyon çanak, tek-tek kalan embriyolar ile bu işlemi tekrarlayın. 10 embriyolar hakkında sonra, diseksiyon çanak hücresel enkaz dolu olacak. Bu durumda, yeni bir diseksiyon çanak değiştirin.
6. Tüm diseksiyonlar yapıldıktan sonra eksplantlar sığ çöküntü olup olmadığını kontrol edin. Aksi takdirde, yavaşça% 70 etanol ile kurutuldu ve hava içinde sterilize edilmiş bir saç döngü ile depresyon içine itilebilir.
7. Son diseksiyonu yaklaşık bir saat sonra, enkaz kaldırma surrousteril, cam Pasteur pipeti ile iyileşti eksplantlar nding.
8. 14-20, Kültür eksplant plaka ° C kardeş, kontrol embriyoları içeren Petri kabı yanında. Kardeş embriyoların blastomer eksplant gelişme aşamasında gösterecektir.

4. Analiz için Hasat eksplantlar

1. Kardeşler istenilen gelişim aşaması ulaştığınızda eksplantlar Hasat. Bazı hücreler parçalanır bile bu eksplantlar oldukça iyi hayatta. Kültür bulutlu bir kitle de var ise, bu nedenle, sağlıklı bir eksplant içinde gömülü olup olmadığını belirlemek için bir saç döngüsü veya forseps ile keşfedebilirsiniz.
2. Bir cam Pasteur pipeti ile kültür çözeltisi küçük bir hacimde eksplantlar Pick up ve hafifçe yapılacak test için uygun bir sabitleştirici veya lizis tamponu içine atmak.

Sonuçlar

Doğru bir hücre gelişme potansiyelinin değerlendirmek için bu tahlil yeteneği kaderi haritalar ^{1, 2, 3, 4, 5, 6} göre dışarı doğru blastomerli kesme dayanır. Bu nedenle, daha sonra, Şekil 2'de gösterildiği gibi, normal bölünme desen ile uyumlu Şekil 1 'de gösterildiği gibi, 2 hücreli aşamada doğru pigmentasyon deseni ile embriyolar seçmek çok önemlidir. Kimse onlar gerekli bölünme aşamasına ulaşıncaya kadar kriteri embriyolar gözlemler ...

Tartışmalar

Bireysel blastomer başarılı yetiştiricilik için en kritik adımlar şunlardır: 1) doğru ilgi blastomer belirlemek; gerekli manuel geliştirilmesi ve 4), steril, sağlıklı kültürü koruyarak 2), 3) hücre döngüsünün doğru kısmında diseksiyon hücreleri Diseksiyon sırasında zarar görmesini önlemek ve iyi kültürünü aktarmak becerisi.

Belirli blastomer işlemek için, kardinal eksenler tespit edebilmek için gereklidir. Xenopus embriyolarda, sırt tarafında ü...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Alümina aşındırıcı filmi	Thomas Bilimsel	# 6775E-38	Forseps ipuçları büyük tamiratlar Kursu (12 mikron),
Alümina aşındırıcı filmi	Thomas Bilimsel	# 6775E-46	Forseps ipuçları keskinleşmesi ince için Orta (3 mikron),
Alümina aşındırıcı filmi	Thomas Bilimsel	# 6775E-54	Forseps ipuçları parlatma için Güzel (0.3 mikron),
Forseps: Dumont, Dumoxel Biologie # 5	Güzel Bilim Araçları	# 11252-30	Bu ilk satın aldığınız bilenen gerekmez ince ipuçları var. Korozif dayanıklı onlar öylesineotoklavlanabilir.
Gentamisin çözümü	Sigma	G1397	Kullanımı gibi aynı gün orta ekle