胚発生時に細胞運命のコミットメントをテストするために割球植

要約

個々の胚細胞の運命は継承分子および/または隣接するセルからの信号により影響を受ける可能性がある。卵割期アフリカツメガエル胚の運命マップを利用して、単一割球は、細胞間相互作用と継承された分子の寄与を評価するために分離して培養のために識別することができます。

要約

胚の細胞のすべてをトレース系統から構築運命マップは、組織は、胚の各セルから派生しているが明らかになった。運命マップは臓器の前駆体を識別するための、子孫細胞は正常な胚に、その臓器を移植それによって発達経路を解明するために非常に有用であるが、それらは、前駆細胞の完全な発達の可能性を説明したりするメカニズムを特定することはありませんその運命が決定される。細胞運命のコミットメントをテストするためには、実験的操作後に発現したものと無傷の胚（運命マップ）に子孫の細胞の正常なレパートリーを比較します。細胞の運命は、周囲の細胞環境にかかわらず、（コミット）が固定され、またはそのネイバーが提供する外部要因によって、それに影響を与えていますか？ アフリカツメガエル胚の包括的な運命マップを使用して、我々が識別する方法について説明し、隔離し、文化の単一卵割期の前駆体、blasto呼ばミアズ。このアプローチは、1つは、これらの初期の細胞は、彼らがそれらの隣接細胞との相互作用を必要とし、無傷の胚内でそれらの通常の環境で取得運命にコミットしている、または他のタイプの信号にさらされた場合、代替の運命を表現するために影響を受ける可能性があるかどうかを評価することができます。

概要

アフリカツメガエルの胚は、その卵が顕微鏡のアプローチを可能にするのに十分な大きさであるため、胚細胞がその特定の運命を獲得するメカニズムを識別するために広く利用されてきた。各セルには固有エネルギーストアを提供卵黄血小板の豊富な細胞内の供給が含まれているため、さらに、彼らは、培地の栄養補給を必要とすることなく、外部から開発しています。 ^{1、2、3、4、5、6} -細胞の運命が決定されるメカニズムを研究するための重要な資産は、（32セルステージ2〜から）卵割期の割球の運命マップの包括的なセットです。これらのマップは、組織が標識された子孫が移入され、開発の後半にある単一の識別可能な割球および監視に検出可能な分子をマイクロインジェクションすることにより構築した。胚の枢機卿軸は確実に多くのエンブリーで同定することができるため、一貫性のある運命のマップが可能ですOS。植物半球ではないのに対し、第一に、すべての野生型胚において動物半球は、色素沈着です。第二に、受精時の精子のエントリは、将来の腹側に向かって動物半球の色素沈着の収縮を引き起こし、多くの胚では色素沈着の差が故に背側と腹側の側面を区別するために使用することができます。第三に、第一分裂溝は、ほとんどの胚における半ば矢状面を近似し、その結果胚の左右を識別するために使用することができます。運命マップも胚の大規模な人口全体の各割球が識別できるように規則的なパターンで自然に受精卵が頻繁に開裂するという事実に依存しています。内および色素沈着および切断パターンに関する卵のクラッチの間にばらつきがあるが、本明細書に記載の選択手順を使用すると、所定の運命を有する細胞が約90％の精度で識別することができます。

細胞の運命が決定することができますいくつかのメカニズムで胚発生時の採掘。そのような差別的継承細胞質mRNAまたはタンパク質などの本質的な要因は、早期のパターニングのいくつかの側面に貢献しています。たとえば、特定の母性mRNAは細胞は、生殖系列に寄与する内胚葉になったり、背側体軸^（7日）に寄与するかを決定します。胚の情報伝達の中心から隣接セル以上の遠縁でローカルに提供外因性の要因は、ほぼすべての臓器系の特定の組織の種類とパターン形成を誘導するための責任を負うものとします。シグナリングセンターの例には、神経外胚葉と中胚葉のパターンを誘発原腸胚におけるオーガナイザー/ノード、および肢芽のパターンは前後軸という活動を偏光の帯があります。運命マップが異なる器官の前駆体を識別し、正常な胚でその子孫によって取ら発達経路を明らかにするが、それらは本質的な区別はできませんそして、それらの細胞に外因性の影響。彼らはまた、子孫胚の複雑な信号環境において分化細胞の完全な発達の可能性を明らかにしない。で培養した胚に由来する細胞の除去または2）;小説胚の場所に）1細胞の移植：2つの実験的なアプローチは、細胞の運命は、内因性の要因によって決定されたか、後に外部の要因によって影響されているかどうかをテストすることができます外因性シグナルの不在。

細胞が手動で分離するのに十分な大きさであるため、両方の実験的なアプローチは、 アフリカツメガエルで実現可能となっている。たとえば、多くの研究は、運命の変更^（7日^、8、9）をテストするために宿主胚における新規の場所に胚（細胞間相互作用を変更する場合）または移植された細胞からの単一細胞を削除しました。さらに、胚の異なる領域から細胞の数が少ないexplantingの第二のアプローチIアフリカツメガエル胚の細胞は、細胞内の栄養素ストア、卵黄血小板で埋められるため、外因性因子の非存在下で誘導組織の相互作用を解明するNTOの培養が可能です。したがって、彼らは、培地の栄養や成長因子の補充なしで定義された塩培地で数日間培養することができる。私たちは、その背の動物の球が母性遺伝mRNAが^10、11に起因する神経と背側中胚葉組織を生成するために自律的能力を持っており、他は32細胞割球と中胚葉の仕様では、内因性及び外因性情報^12の両方に依存して認められた表示するには、このアプローチを使用していた。外植体として、細胞を培養することの利点は、媒体は、外植セル^12、13、14の運命に影響を及ぼす可能性のある細胞間の通信経路を決定するために定義されたシグナル伝達因子を補充することができることである。また、1割球はPRを注入することができます内因性mRNAの翻訳を防止するために過剰発現するmRNAの遺伝子を持つ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを​​用いた文化にIOR。これらは、ゲインとロス·オブ·機能解析は、自律的に発現して運命のために必要とされる分子を識別することができます。外植片の運命を分析するには、特定の細胞種の同定は標準の遺伝子発現（ 例えば、in situハイブリダイゼーション 、RT-PCR）と免疫細胞化学的ア ​​ッセイにより行うことができる。このプロトコルは、胚細胞が特定の組織に発展する方法を制御内因性および外因性のメカニズムを区別するための簡単​​かつ強力な方法を提供します。

プロトコル

1。器具、培地や料理の準備

1. アルミナ研磨フィルムを使用して4鉗子を強めています。チップサイズを監視するために解剖顕微鏡下でこれを行います。先端が処置中に損傷している場合には鉗子1組のバックアップとして機能します。すべての4つの鉗子をオートクレーブ滅菌した容器に保管してください。
2. （; ¹⁵のレシピどちらMarcの修正リンガー[MMR]または改変バルトの生理食塩水[MBS]）とフィルター滅菌500ミリリットル0.1Xと1.0X培地のそれぞれを確認します。我々は日常的にMBSを（; 1のKCl、0.7 mMのCaCl _2、1mMののMgSO _4、5mMのHEPES [pHが7.8]、2.5 mMのNaHCO _3を 1X = 88 mMのNaCl）を使用します。ヶ月間の14から18℃で保存する。
3. 培養液中の2％アガロース溶液（スクリューキャップのガラスボトルで100ミリリットル1X培地で2グラム電気泳動グレードアガロース）を作る。アガロースを溶解するためにオートクレーブ。これは、月間4℃で保存し、それが次の必要なときにアガロースを液化するために電子レンジにすることができます。
4. アガロースは液体ですが、滅菌24穴培養プレートの各ウェルの底に約0.5ミリリットルを注ぐ。これはプラスチックに付着する外植片を防ぐことができます。
5. アガロースは液体ですが、二から三60ミリメートルペトリ皿の底に約2-3ミリリットルを注ぎ、そして渦巻きは優しく底が覆われていることを確認する。これらは、解剖皿となるとその膜が除去された後、アガロースは、プラスチックに付着胚を防ぎます。
6. アガロースを冷却し、硬化、火炎6 "パスツールピペットの先端を、それがボールに溶けるまで、軽く培養プレートの各ウェルにおけるアガロースの表面に接触させてください。これは、先の浅いうつ病が作成されたとき植が配置されます。
7. 1X無菌培養培地で培養プレートの各ウェルを埋める。
8. アガロースが冷却し、硬化したときに、割球分離を容易にするために希釈された培養液（0.1X MMRまたは0.1X MBS）と解剖皿を埋める。

2。胚の選択

1. 受精卵を取得し、標準的なプロトコル¹⁵に従ってゼリーコートを除去する。 100ミリメートルペトリ皿に0.5X培地に移す。
2. 胚は2細胞期に達すると、最初の分裂溝が別の皿に動物半球（ 図1）で軽く色素沈着面積を二等分したものをソートする。これらは、外植片のドナーになります。外植片を上演する兄弟コントロールとして機能するための手順を通してドナー胚の隣に別の皿に残りの2細胞期胚を保管してください。

3。外植片の作製

1. 解剖皿に5月10日胚を置くのではなく、一度に1つの胚に取り組んでいます。
2. 透明卵黄膜が見られるように、最初の胚を置き、それは、胚の動物極の表面上に透明な空間（腔）で区切られています。尖った力を利用して1のサブドミナントの手（1が右利きされている場合は左手）のps、腔上記の卵黄膜を把握する。一方で削った鉗子を使用して、最初の鉗子先端に近い膜を持ち、静か膜剥がれ反対方向に引っ張る。標的細胞は、膜の除去の際に破損していないので、解剖するセルからの距離で初期把握を行います。一つは、胚が平らになるため、膜が除去されたことを伝えることができます。
3. サブドミナント手にピンセットで1隣接セルをつかんで、解剖すべきセルが直接触れないように "ハンドル"としてこのセルを使用しています。一方で鉗子で、優しく希望の割球から離れて残りの隣接セルを引っ張る。同じ運命を共有して正中線細胞は、標的にされている場合は、それらがペアとして一緒に削除することができます。最後に、 "ハンドル"のセルを離れて解剖する。
4. 滅菌済みの割球（または割球ペア）、拾う、ガラスパスツールピペット、気泡や過度の吸引を避ける。ピペットは、細胞に損傷を与えることができますが、我々が日常的にこれをしないシャープなエッジを除去するために火を研磨することができる。外植片培養皿のウェル中の培地の表面の下にパスツールピペットの先端を置き、静かに割球を追放。それは、重力によって浅いくぼみにスライドしなければなりません。複数の胚から割球は、同じ単植に結合することができます。
5. 一つずつ、解剖皿の残りの胚では、この手順を繰り返します。約10胚の後、解剖皿細胞の残骸で満たされるでしょう。この現象が発生した場合、新鮮な解剖皿に変更します。
6. すべての解剖が行われた後、外植片が浅いくぼみにあるかどうかを確認。しない場合、それらは静かに乾燥させ、70％エタノールと空気中で滅菌された毛のループを使ってうつ病に押し込むことができます。
7. 最後の郭清後の約一時間、デブリsurrouを削除滅菌、ガラスパスツールピペットで癒さ植片をnding。
8. 兄弟、制御の胚を含むペトリ皿に14から20°Cの隣での培養外植片の板を。兄弟の胚は、割球の外植片の発展段階を示すでしょう。

4。分析のための収穫植

1. 兄弟姉妹が希望発達段階に到達したときに外植片を回収します。細胞の一部が崩壊した場合でも、これらの外植片はかなりうまく生き残る。文化の中で曇りの質量が十分に存在する場合、したがって、健康な植が内に埋設されているかどうかを判断するために毛のループまたは鉗子でそれを探る。
2. ガラスパスツールピペットを用いて培養液を少量の外植片を拾うと、優しく行われるアッセイのための適切な固定剤または溶解バッファにそれらを追放する。

結果

正確に細胞の発生能を評価するために、このアッセイの能力は運命マップ^{1、2、3、4、5、6}に基づいて、適切な割球を解離に依存している。したがって、それは続いて、 図2に示すように、定期的な切断パターンに準拠し、 図1に示すように、2細胞期に正しい色素沈着パターンを持つ胚を選択することが重要です。一つは、彼らが必要な切断段階に達するよう?...

ディスカッション

ほとんどの個々の割球の培養に成功するための重要なステップは次のとおりである：1）正常に関心の割球を識別する、2）滅菌した、健全な文化を維持すること、3）細胞周期の正しい部分の解剖細胞、​​4）必要なマニュアルを開発解剖や文化への転送だけでなく時の損傷を防止するための器用さ。

特定の割球を操作するには、カーディナルの軸を識別できることが不?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
アルミナ研磨フィルム	トーマス·サイエンティフィック	＃6775E-38	鉗子先端部の大規模修繕のためのコース（12μm）であり、
アルミナ研磨フィルム	トーマス·サイエンティフィック	＃6775E-46	鉗子先端のシャープ罰金のための媒体（3μm）を、
アルミナ研磨フィルム	トーマス·サイエンティフィック	＃6775E-54	鉗子先端の研磨のためのファイン（0.3μm）を、
鉗子：デュモン、Dumoxel Biologie＃5	ファイン科学ツール	＃11252から30	これらは、最初の購入時に鮮鋭化を必要としない微細なヒントがあります。耐腐食性、彼らがそうすることができるので、オートクレーブする。
ゲンタマイシンソリューション	シグマ	G1397	使用と同じ日に培地に入れる