Explants Blastomere לבדיקת מחויבות גורל תא במהלך התפתחות עוברית

Summary

גורלו של תא עוברי אדם יכול להיות מושפע על ידי מולקולות ירושה ו / או על ידי אותות מתאים שכנים. ניצול מפות גורלו של עובר Xenopus שלב המחשוף, לסטומרים בודדים ניתן לזהות לתרבות בבידוד כדי להעריך את התרומה של מולקולות ירושה לעומת אינטראקציות תא סלולרי.

Abstract

מפות גורל, שנבנו משושלת התחקות כל התאים של עובר, לחשוף אילו רקמות לרדת מכל תא של העובר. למרות שמפות גורל הן מאוד שימושיות לזיהוי המקדים של איבר והבהרת נתיב התפתחות שבאמצעותו את תאי הצאצא לאכלס איבר שבעובר הנורמלי, הם לא להמחיש את הפוטנציאל ההתפתחותי המלא של תא מבשר או לזהות את המנגנונים שבאמצעותם גורלו נקבע. כדי לבדוק את מחויבות גורל תא, אחד משווה רפרטואר הרגיל של תא של צאצאים בעובר ללא פגע (מפת הגורל) עם אלה הביעו אחרי מניפולציה ניסויית. האם גורלו של התא קבוע (מחויב) ללא תלות בסביבה התאית שמסביב, או שהוא השפיע עליו על ידי גורמים חיצוניים הניתנים על ידי שכנותיה? שימוש במפות הגורל המקיפות של עובר Xenopus, אנו מתארים כיצד לזהות, לבודד ומבשרי שלב ביקוע בודד תרבות, הנקרא blastoשכירי חרב. גישה זו מאפשרת לאדם להעריך אם התאים האלה מוקדם מחויבים לגורל שהם רוכשים בסביבת הרגילה שלהם בעובר ללא פגע, דורשים אינטראקציות עם תאי שכניהם, או יכולים להיות מושפע להביע גורלות חלופיים אם נחשפו לסוגים אחרים של אותות.

Introduction

עוברי Xenopus laevis כבר נוצל בהרחבה כדי לזהות את המנגנונים שבאמצעותם תאים עובריים לרכוש הגורלות הספציפיים שלהם, כי הביצים שלהם הן ​​גדולות מספיק כדי לאפשר גישות מייקרו. בנוסף, הם מפתחים חיצוניים ללא צורך בתוספים תזונתיים של מדיום התרבות, מכיוון שכל תא מכיל תאי היצע עשיר של טסיות חלמון המספקות חנות אנרגיה פנימית. נכס חשוב ללימוד המנגנונים שבאמצעותם גורל תא נקבע הוא הסדרה המקיפה של מפות גורל לסטומרים שלב הביקוע (מגיל 2 - באמצעות שלבים 32-תא) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} מפות אלה נבנו על ידי microinjecting מולקולת זיהוי לblastomere אחד מזוהה וניטור בהמשך פיתוח רקמות אשר מאוכלסות על ידי הצאצאים שהכותרת. מפות גורל עקביות הן אפשריות, כי צירי היסוד של העוברים ניתן לזהות באופן אמין באמברי רבמערכת הפעלה. ראשית, בכל עוברי סוג בר אונת החיה היא פיגמנט, ואילו בחצי הכדור הצמחי הוא לא. שנית, כניסתו של הזרע בהפריה גורמת להתכווצות של פיגמנטציה אונת הבהמה לצד הגחוני העתיד; בעוברים רבים הבדל פיגמנטציה ולכן ניתן להשתמש בו כדי להיפלות בין צדדי גב וגחון. שלישית, מחשוף התלם הראשון הקרוב למטוס באמצע sagittal ברוב העוברים, ולכן ניתן להשתמש בו כדי לזהות את הצדדים הימניים ושמאליים של העובר. מפות הגורל מסתמכות גם על העובדה שלעתים קרובות ביצים מופרות באופן טבעי לדבוק בדפוסים קבועים שהופכים כל blastomere זיהוי פני אוכלוסייה גדולה של עוברים. אמנם יש שונות בתוך ובין ציפורניה של ביצים לגבי דפוסי פיגמנטציה ומחשוף, תוך שימוש בהליכי בחירה מתוארת כאן מאפשר לתאים עם גורל שנקבע להיות מזוהים עם כ 90% דיוק.

גורל תא ניתן להרתיעממוקש במהלך התפתחות עוברת במספר מנגנונים שונים. גורמים פנימיים, כגון mRNAs או חלבוני cytoplasmic ירושה באופן דיפרנציאלי, לתרום למספר היבטים של דפוסים מוקדמים. לדוגמה, mRNAs האימהי הספציפי לקבוע אילו תאים יתרמו לשורת הניבט, הפכו האנדודרם, או לתרום לציר הגוף הגבה (סקר ^ב7). גורמים חיצוניים הניתנים באופן מקומי על ידי תאים סמוכים או יותר מרחק ממרכז איתות עוברית, אחראים לגרימת סוגים ספציפיים של רקמות ודפוסים כמעט בכל מערכת איברים. דוגמאות למרכזי איתות כוללות מארגן / הצומת בgastrula שגורם לאקטודרם ודפוסים העצביים מזודרם, והאזור של קיטוב פעילות שדפוסי הציר קדמי-האחורי של ניצן הגפה. למרות שמפות גורל לזהות את הסימנים המקדימים של איברים השונים ולחשוף את נתיב התפתחות נלקח על ידי צאצאיהם בעובר הנורמלי, הם לא יכולים להבחין בין מהותייםוהשפעות חיצוניות על תאים אלה. הם גם לא לחשוף את הפוטנציאל ההתפתחותי המלא של תא, שצאצאיו להבחין בסביבה המורכבת האיתות של העובר. שתי גישות ניסיוניות יכולות לבדוק אם גורלו של תא נקבע על ידי גורמים פנימיים או בהמשך מושפע מגורמים חיצוניים: 1) השתלה של התאים למיקום רומן בעובר, או 2) הסרת התא מהעובר ואחרי התרבות ב היעדר אותות חיצוניים.

שתי הגישות הניסיוניות שהיו אפשריות בXenopus כי התאים הם גדולים מספיק כדי להיות מופרד באופן ידני. לדוגמה, מחקרים רבים שמחקו תאים בודדים מעוברים (לשנות אינטראקציות תא סלולרי) או תאים מושתלים למיקומים חדשים בעוברים מארחים לבדיקת שינויי גורל (שנסקרו ^{ב7, 8, 9).} בנוסף, הגישה השנייה של explanting מספר קטן של תאים מאזורים שונים של העובר אניתרבות n כדי להבהיר אינטראקציות רקמות אינדוקטיביים בהיעדר גורמים אקסוגניים אפשרית, כי תאיו של עובר Xenopus מלאות בחנות תזונתית תאית, טסיות החלמון. לכן, הם יכולים להיות מתורבתים לכמה ימים במלח בינוני מוגדר ללא תוספת גורם תזונתית או צמיחה של מדיום התרבות. יש לנו להשתמש בגישה זו כדי להראות כי בעלי חי לסטומרים גב יש יכולת אוטונומית לייצר רקמות עצביות והגבו mesodermal בשל mRNAs ירש אימהי ^{10, 11,} ואחרים הראו שהמפרט של מזודרם לסטומרים 32-סלולריים מסתמך על שניהם מידע פנימי וחיצוני ¹² . יתרון של תאי culturing כexplants הוא שהמדיום יכול גם להשלימו עם גורמים המוגדרים איתות כדי לקבוע אילו תא לתא מסלול תקשורת עלולה להשפיע על גורלו של תא explanted ^{12, 13, 14.} בנוסף, ניתן להזריק blastomere יחסי הציבורIOR לתרבות עם mRNA ליותר מ-Express גן, או עם oligonucleotides אנטי תחושה למנוע התרגום של mRNAs אנדוגניים. ניתוחים אלה, רווח והפסד, של הפונקציה יכולים לזהות אילו מולקולות נדרשות לגורל מתבטא בצורה אוטונומית. כדי לנתח את גורל explant, זיהוי של סוגי תאים מסוימים יכול להתבצע על ידי ביטוי גנטי סטנדרטי (למשל, כלאה באתר, RT-PCR) ומבחני immunocytochemical. פרוטוקול זה מספק, בדרך פשוטה, אך רבת עצמה כדי להבחין בין מנגנונים פנימיים וחיצוניים שקובעים איך תא עוברי מתפתח לרקמות ספציפיות.

Protocol

1. הכנת מכשירים, מדיה תרבות ומנות

1. חידוד 4 מלקחיים באמצעות סרט שוחק אלומינה. האם זה תחת מיקרוסקופ לנתח לפקח גודל הטיפ. זוג אחד של מלקחיים משמש כגיבוי במקרה קצה הניזוק במהלך ההליך. חיטוי כל ארבעת המלקחיים ולאחסן במכל סטרילי.
2. הפוך 500 מ"ל כל אחד מתרבות בינונית ו0.1x 1.0x (בין אצבעות השינוי של מארק [MMR] או המלוח [MBS] של השינוי Barth; מתכונים ^ב15) והמסנן לעקר. אנו משתמשים באופן שגרתי MBS (1X = 88 המ"מ NaCl, 1 mM KCl, 0.7 המ"מ CaCl _2, 1 ₄ המ"מ MgSO, 5 HEPES מ"מ [pH 7.8], 2.5 המ"מ ₃ NaHCO). חנות ב 14-18 מעלות צלזיוס במשך חודשים.
3. הפוך 2% פתרון agarose במדיום התרבות (2 גרם אלקטרופורזה agarose בכיתה בינונית 100 מ"ל 1X תרבות בבקבוק זכוכית פקק הברגה). חיטוי לפזר agarose. זה יכול להיות מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים, וחמם במיקרוגל לנזל agarose כאשר הוא נחוץ הבא.
4. בעוד agarose הוא נוזלי, יוצק על 0.5 מ"ל אל תחתיתו של כל אחד גם מצלחת התרבות 24 גם סטרילי. זה ימנע את explants יידבק לפלסטיק.
5. בעוד agarose הוא נוזלי, יוצק על 2-3 מ"ל על תחתית 2-3 צלחות פטרי 60 מ"מ, ומערבולת בעדינות כדי לוודא התחתון מכוסה. אלה ישמשו ככלי נתיחה וagarose מונע עוברים יידבקו לפלסטיק פעם הקרומים שלהם יוסרו.
6. כאשר agarose מתקרר ומתקשה, להבת קצה 6 "פסטר פיפטה עד שהוא נמס לכדור, ולגעת בו בקלילות על פני השטח של agarose בכל באר של צלחת התרבות. זו תיצור שקע רדוד שלתוכו explant יוצב.
7. ממלא כל היטב של צלחת התרבות עם התרבות בינונית 1X סטרילי.
8. כאשר agarose מתקרר ומתקשה, למלא את צלחת הנתיחה עם מדיום התרבות מדולל (0.1x MMR או 0.1x MBS) כדי להקל על הפרדת blastomere.

2. בחירה עוברת

1. השג ביצים מופרות ולהסיר ריבת המעיילים פי ¹⁵ פרוטוקולים סטנדרטיים. להעבירם למדיום 0.5X התרבות בצלחת פטרי 100 מ"מימ.
2. כאשר עוברים מגיעים לשלב 2-התא, למיין את אלה שבתלם המחשוף 1 חוצה את האזור קל פיגמנט בחצי כדור החיה (איור 1) לצלחת נפרדת. אלה יהיו התורמים לexplants. שמור את העוברים שנותרו 2-הסלולריים בצלחת נפרדת ליד העוברים התורמים ברחבי ההליך לשרת כפקדי אחים לביים את explants.

3. הכנת explants

1. הנח עוברים 5-10 בצלחת לנתיחה, אלא רק לעבוד על עובר אחד בכל פעם.
2. מקם את העובר הראשון, כך ניתן לראות את קרום vitelline השקוף; הוא מופרד ברווח ברור (מרחב perivitelline) מעל פני השטח של קוטב החיים של העובר. שימוש בכוח חדדנ.ב. ביד subdominant של אחד (יד שמאל אם נמסר מימין), לתפוס את קרום vitelline מעל שטח perivitelline. באמצעותו מלקחיים מושחזים מצד השני, לתפוס את הממברנה הקרובה לקצה המלקחיים הראשון, ומשוך בעדינות בכיוונים מנוגדים כדי לקלף את הקרום משם. הפוך אחיזה הראשונית במרחק מהתא שהוא להיות גזור, כך שתא המטרה אינו פגום במהלך ההסרה של הקרום. אחד לא יכול להגיד שהקרום הוסר בגלל העובר יהיה לשטח.
3. תפוס תא שכן אחד עם מלקחיים ביד subdominant ולהשתמש כתא זה "ידית" ולכן התא שנתח לא נגע באופן ישיר. עם מלקחיים ביד השנייה, משוך בעדינות את תאי השכנים שנותרו מן blastomere הרצוי. אם תאי קו אמצע, שחולקים את אותו גורל, ממוקדים, ניתן להסירם יחד כזוג. לבסוף, תנתח את התא "הידית".
4. הרם את blastomere (או זוג blastomere), עם סטרילי, זכוכית פיפטה פסטר, הימנעות בועות אוויר ויניקה מוגזמת. פיפטה יכולה להיות אש מלוטשת כדי להסיר קצוות חדים שיכול לגרום ניזק לתא, אבל לא באופן שגרתי שאנחנו עושים את זה. הנח את קצה פיפטה פסטר מתחת לפני השטח של מדיום התרבות בבאר של מנת תרבות explant, ועדינות לגרש blastomere. זה צריך להחליק לתוך השקע הרדוד על ידי כוח הכביד. אותו blastomere מעובר אחד או יותר ניתן לשלב explant אחת.
5. חזור על תהליך זה עם העוברים שנותרו בצלחת לנתיחה, אחד על האחד. לאחר כ 10 עוברים, מנת הנתיחה תהיה מלאה בפסולת תאית. כאשר זה קורה, לשנות לצלחת נתיחה טריה.
6. אחרי כל הניתוחים נעשים, לבדוק אם explants הם בשקעים הרדודים. אם לא, הם יכולים להיות דחף בעדינות לתוך הדיכאון עם לולאת שיער שעבר עיקור באתנול ואוויר היבש 70%.
7. כשעה לאחר הנתיחה האחרונה, להסיר surrou פסולתnding את explants הגליד עם סטרילי, זכוכית פסטר פיפטה.
8. תרבות צלחת explants ב14-20 מעלות צלזיוס בסמוך לצלחת פטרי המכיל אח, עוברי בקרה. עוברי אחים יציינו את שלב ההתפתחות של explants blastomere.

4. Explants קצירה לניתוח

1. לקצור את explants כאשר האחים מגיעים לשלב ההתפתחותי הרצוי. explants אלה ישרוד היטב גם אם חלק מהתאים מתפורר. לכן, אם יש מסה חלקית בתרבות היטב, לחקור אותו בלולאת שיער או מלקחיים כדי לקבוע אם explant בריא הוא קבור בתוכו.
2. להרים explants בנפח קטן של תמיסת התרבות עם כוס פסטר פיפטה, ולגרש אותם בעדינות לחוצץ מתאים לבדיקה שתבוצע מקבע או תמוגה.

תוצאות

היכולת של assay זה במדויק על מנת להעריך את הפוטנציאל ההתפתחותי של התא מסתמכת על לחתוך רקמות blastomere הנכון מבוססות על הגורל ^{1 מפות, 2, 3, 4, 5, 6.} לכן, חשוב לבחור עוברים עם דפוס פיגמנטציה הנכונה בשלב 2-התא, כפי שמודגם באיור 1, שלאחר מכן להתאים לדפוסי ביקוע רגילים, כפי...

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר עבור culturing המוצלח של לסטומרים בודדים הם: 1) כשזיהו את blastomere עניין: 2) שמירה על תרבות סטרילי, בריאה, 3) תאים המפרקים בחלק הנכון של מחזור התא; ו4) פיתוח המדריך לצורך זריזות כדי למנוע הניזק במהלך נתיחה ולהעביר לתרבות טובה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
סרט שוחק אלומינה	תומאס מדעי	# 6775E-38	כמובן (12 מיקרומטר), לתיקונים גדולים מלקחיים של טיפים
סרט שוחק אלומינה	תומאס מדעי	# 6775E-46	בינוני (3 מיקרומטר), לחידוד עדין של קצות מלקחיים
סרט שוחק אלומינה	תומאס מדעי	# 6775E-54	פיין (0.3 מיקרומטר), לליטוש של טיפי מלקחיים
מלקחיים: דומון, Dumoxel Biologie # 5	כלי מדע פיין	# 11252-30	לאלה יש את העצות העדינות שלא זקוק לחידוד בעת הרכישה הראשונה. עמיד לקורוזיה ולכן הם יכוליםלהיות autoclaved.
פתרון גנטמיצין	סיגמא	G1397	הוסף לבינוני באותו יום כמו שימוש