Blastomere Explantate für das Schicksal der Zelle Engagement während der embryonalen Entwicklung Testen

Zusammenfassung

Das Schicksal einer einzelnen embryonalen Zelle kann durch vererbte Moleküle und / oder durch Signale von benachbarten Zellen beeinflusst werden. Mit Hilfe Schicksal Karten der Spaltung der Bühne Xenopus Embryos können einzelne Blastomeren für Kultur isoliert identifiziert werden, um die Beiträge der ererbten Moleküle gegenüber Zell-Zell-Interaktionen zu beurteilen.

Zusammenfassung

Schicksal Karten, von Abstammungslinie Tracing alle Zellen eines Embryos konstruiert, offenbaren die Gewebe von jeder Zelle des Embryos abstammen. Obwohl das Schicksal Karten sehr nützlich sind für die Identifizierung der Vorläufer eines Organs und zur Erläuterung der Entwicklungsweg, mit denen die Nachkommen Zellen bevölkern dieses Organs im normalen Embryo, sie nicht zeigen, das volle Entwicklungspotenzial einer Vorläuferzelle oder Identifizierung der Mechanismen, mit denen sein Schicksal bestimmt. Um das Schicksal der Zelle Engagement testen, vergleicht man einer Zelle normalen Repertoire von Nachkommen im intakten Embryo (das Schicksal Karte) mit denen nach einer experimentellen Manipulation ausgedrückt. Wird die Zelle Schicksal fixiert (gebunden), unabhängig von der umgebenden zellulären Umgebung, oder ist es durch externe Faktoren von seinen Nachbarn zur Verfügung gestellt beeinflusst? Mit den umfassenden Schicksal Karten des Xenopus Embryo, beschreiben wir, wie zu identifizieren, zu isolieren und Kultur einzigen Furchungsstadium Vorläufer namens Blastomeres. Dieser Ansatz erlaubt es, festzustellen, ob diese frühen Zellen mit dem Schicksal sie in ihrer normalen Umgebung erwerben im intakten Embryo, erfordern Interaktionen mit ihren Nachbarzellen begangen werden, oder kann auf alternative beeinflusst Schicksale auszudrücken, wenn auf andere Arten von Signalen ausgesetzt werden.

Einleitung

Xenopus laevis Embryonen wurden ausführlich die Mechanismen, durch die embryonalen Zellen erhalten ihre spezifische Schicksal, weil ihre Eier groß genug, um mikrochirurgische Ansätze erlauben identifizieren genutzt. Zusätzlich entwickeln sie extern ohne Nahrungsergänzung des Kulturmediums weil jede Zelle enthält einen reichen intrazellulären Zufuhr von Eigelb Blutplättchen, die eine intrinsische Energiespeicher bereitzustellen. Ein wichtiges Asset für die Untersuchung der Mechanismen, mit denen das Schicksal der Zelle bestimmt wird, ist die umfassende Reihe von Schicksal Karten der Spaltung der Bühne Blastomeren (von 2 - bis 32-Zell-Stadium) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Diese Karten wurden durch Mikroinjektion ein detektierbares Molekül in eine einzige, identifizierbare Blastomere und Überwachen später in der Entwicklung, welches Gewebe durch das markierte Nachkommen bestückt sind konstruiert. Konsequente Schicksal Karten sind möglich, da die Hauptachsen der Embryonen zuverlässig in vielen embry identifiziert werdenos. Erstens, in allen Wildtyp Embryonen das Tier Hemisphäre ist pigmentiert, während die pflanzlichen Hemisphäre ist es nicht. Zweitens verursacht der Eintrag der Spermien bei der Befruchtung einer Kontraktion des Tieres Halbkugel Pigmentierung Richtung Zukunft Bauchseite, in vielen Embryonen eine Pigmentierung Unterschied daher kann zwischen dorsalen und ventralen Seiten diskriminieren. Dritte, nähert sich die erste Teilungsfurche Mitte der Sagittalebene in den meisten Embryonen und somit verwendet werden können, um die rechte und linke Seite des Embryos zu identifizieren. Das Schicksal Karten stützen sich auch auf die Tatsache, dass natürlich befruchtete Eier häufig spalten in regelmäßigen Mustern, die jeweils Blastomeren identifizierbaren über eine große Population von Embryonen zu machen. Während es Variabilität innerhalb und zwischen Gelege bezüglich Pigmentierung und Spaltmuster mit Auswahlverfahren hierin beschriebenen Zellen ermöglicht vorgeschriebener Schicksalen um mit etwa 90% Genauigkeit identifiziert werden.

Zellschicksale kann abzuschreckenabgebaut während der Embryogenese durch verschiedene Mechanismen. Intrinsische Faktoren wie differentiell geerbt cytoplasmatischen mRNAs oder Proteine, um verschiedene Aspekte der frühen Strukturieren beitragen. Beispielsweise bestimmen spezifischen mütterlichen mRNAs, welche Zellen der Keimbahn beitragen, sich das Entoderm, oder dazu beitragen, den dorsalen Körperachse (bewertet in ^7). Extrinsische Faktoren lokal von benachbarten Zellen oder entfernter aus einer embryonalen Meldezentrale vorgesehen, sind verantwortlich für die Bildung spezifischer Gewebetypen und Strukturieren fast jedes Organsystem. Beispiele der Signalisierung Zentren gehören die Veranstalter / Knoten in der Gastrula, die neuronalen Ektoderm und Muster das Mesoderm induziert, und die Zone polarisierender Aktivität, dass die Muster der anterior-posterioren Achse des Gliedmaßenknospe. Obwohl das Schicksal Karten identifizieren die Vorläufer der verschiedenen Organe und zeigen die Entwicklungsweg von ihren Nachkommen im normalen Embryo entnommen, können sie nicht zwischen intrinsischen unterscheidenund extrinsische Einflüsse auf den Zellen. Sie haben auch nicht offenbaren die volle Entwicklungspotential einer Zelle, deren Nachkommen zu differenzieren in der komplexen Signalisierung Umfeld des Embryos. Zwei Versuchsansätze kann getestet werden, ob einer Zelle Schicksal durch intrinsische Faktoren bestimmt wird oder anschließend durch äußere Faktoren beeinflusst: 1) Transplantation der Zelle auf eine neuartige Lage im Embryo, oder 2) Entfernen der Zelle aus dem Embryo durch Kultur in gefolgt die Abwesenheit von exogener Signale.

Sowohl experimentelle Ansätze wurden in Xenopus machbar, weil die Zellen groß genug, um manuell getrennt werden sollen. Zum Beispiel haben zahlreiche Studien einzelner Zellen aus Embryonen (um Zell-Zell-Wechselwirkungen zu ändern) oder transplantierten Zellen, neue Stellen in Host Embryonen für Schicksal Änderungen (in ^{7 bewertet, 8, 9)} zu testen gelöscht. Darüber hinaus ist die zweite Ansatz von Explantieren kleine Zahl von Zellen, die aus unterschiedlichen Bereichen des Embryos into Kultur zur induktiven Gewebeinteraktionen in Abwesenheit von exogenen Faktoren aufzuklären ist möglich, weil die Zellen des Embryos Xenopus mit einem intrazellulären Nährstoffdepot die Dotter Blutplättchen gefüllt sind. Daher können sie für einige Tage in einem definierten Medium ohne Nährwert Salz oder Wachstumsfaktor Ergänzung des Kulturmediums kultiviert werden. Wir haben diesen Ansatz verwendet zu zeigen, dass dorsalen Tier Blastomeren haben eine autonome Fähigkeit, neuronale und dorsalen mesodermalen Gewebe aufgrund mütterlich vererbten mRNAs ^{10, 11} zu produzieren, und andere haben gezeigt, dass Mesoderm Spezifikation 32-Zell-Blastomeren beruht sowohl auf intrinsische und extrinsische Informationen ¹² . Ein Vorteil der Kultivierung von Zellen als Explantate ist, dass das Medium auch mit definierten Signalisieren Faktoren zu bestimmen, welche Zelle zu Zelle Kommunikationspfad könnte das Schicksal des explantierten Zelle ^{12, 13, 14} beeinflussen ergänzt werden. Darüber hinaus kann ein injizieren Blastomere prior die Kultur mit mRNA über-express eines Gens, oder mit anti-sense-Oligonukleotide, die Übersetzung von endogenen mRNAs zu verhindern. Diese, Verstärkungs-und Verlust-of-function-Analysen können Moleküle identifizieren, welche für eine autonom ausgedrückt Schicksal erforderlich. Um das Schicksal des Explantats zu analysieren, kann die Identifikation von spezifischen Zelltypen nach Standard Genexpression (zB In-situ-Hybridisierung, RT-PCR) und immuncytochemische Assays durchgeführt werden. Dieses Protokoll bietet eine einfache, aber leistungsstarke Möglichkeit, zwischen innerer und äußerer Mechanismen, wie eine embryonale Zelle in bestimmten Geweben entwickelt Regulierung unterscheiden.

Protokoll

Ein. Vorbereitung des Instruments, Kultur, Medien und Gerichte

1. Schärfen vier Zangenelemente mit Alumina Schleiffolie. Tun Sie dies unter einem Binokular, um die Größe der Spitze zu überwachen. Eine Zange dient als ein Back-up für den Fall einer Spitze wird während des Verfahrens geschädigt. Autoklavieren alle vier Zangen und lagern in einem sterilen Behälter.
2. Stellen Sie 500 ml jeweils 0,1 X und 1,0 X Kulturmedium (entweder Marcs Modified Ringers [MMR] oder Modified Barths Saline [MBS]; Rezepten in ¹⁵⁾ und Filter zu sterilisieren. Wir verwenden routinemäßig MBS (1X = 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl _2, 1 mM MgSO _4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCO _3). Lagerung bei 14-18 ° C für Monate.
3. Einen 2% Agaroselösung in Kulturmedium (2 g Agarose-Elektrophorese Grade in 100 ml 1X Kulturmedium in einer Schraubkappe Glasflasche). Autoklavieren eine Agarose aufzulösen. Dies kann bei 4 ° C über Monate gelagert werden, und der Mikrowelle, um die Agarose zu verflüssigen, wenn es weiter erforderlich ist.
4. Während die Agarose flüssig ist, gießen etwa 0,5 ml auf den Boden jeder Vertiefung einer sterilen 24-Well-Kulturplatte. Dadurch werden die Explantate vom Kleben an der Kunststoff verhindern.
5. Während die Agarose flüssig ist, gießen Sie etwa 2-3 ml auf den Boden von zwei bis drei 60 mm Petrischalen und behutsam schwenken, um sicherzustellen, dass der Boden bedeckt ist. Diese werden als Dissektion Gerichte servieren und die Agarose verhindert Embryonen aus Festhalten an der Kunststoff einmal ihre Membranen entfernt werden.
6. Wenn die Agarose wurde abgekühlt und ausgehärtet, Flamme die Spitze eines 6 "Pasteurpipette bis es schmilzt zu einer Kugel, leicht berühren und ihn auf der Oberfläche der Agarose in jede Vertiefung der Kulturplatte. Dadurch wird eine flache Vertiefung schaffen, in die das Explantat platziert wird.
7. Füllen Sie jedes Well der Kulturschale mit 1X sterile Kulturmedium.
8. Wenn die Agarose abgekühlt und ausgehärtet ist, füllen die Dissektion Schale mit verdünnter Kulturmedium (0,1 x MMR oder 0,1 x MBS) an Blastomeren Trennung zu erleichtern.

2. Selektion von Embryonen

1. Erhalten befruchteten Eier und entfernen Sie das Gelee Mäntel nach Standardprotokollen ^15. Übertragen auf 0,5 X Kulturmedium in einer 100 mm Petrischale.
2. Wenn die Embryonen 2-Zellen-Stadium erreichen, zu sortieren, in denen der erste Teilungsfurche halbiert den leicht pigmentiert Bereich in dem Tier Halbkugel (Abbildung 1) in einem separaten Teller. Diese werden die Geber für die Explantate sein. Halten Sie die verbleibenden 2-Zell-Embryonen in einem separaten Teller neben den Spenderembryonen während des gesamten Verfahrens als Geschwister Kontrollen dienen dazu, die Explantate zu inszenieren.

3. Herstellung Explantate

1. Zeigen 5-10 Embryonen in einer Dissektion Gericht, aber nur auf einer Embryos gleichzeitig arbeiten.
2. Positionieren des ersten Embryo, so dass die transparente Dotterhaut ersichtlich, es ist durch einen freien Bereich (perivitellinen Raum) über der Oberfläche des Tieres Pol des Embryos getrennt. Mit einem geschärften Kraftps in einem der Subdominante Hand (linke Hand, wenn man rechts übergeben), fassen Sie die Dotterhaut über dem perivitellinen Raum. Verwendung einer geschärften Pinzette in der anderen Hand die Membran dicht an dem ersten Zange Spitze, und sanft in entgegengesetzten Richtungen ziehen, um die Membran Schale entfernt. Machen den anfänglichen Griff in einem Abstand von der Zelle, die zu seziert werden, so dass die Zielzelle nicht während der Entfernung der Membran beschädigt wird. Man kann sagen, dass die Membran entfernt wurde, weil der Embryo zu glätten.
3. Schnappen Sie eine Nachbarzelle mit der Zange in der Subdominante Hand und diese Zelle als "Griff", so die Zelle zerlegt werden nicht direkt berührt. Mit der Zange in der anderen Hand, ziehen die verbleibenden benachbarten Zellen weg von der gewünschten Blastomere. Wenn Mittellinie Zellen, die das gleiche Schicksal teilen, ausgerichtet sind, können sie als Paar zusammen entfernt werden. Schließlich sezieren entfernt den "Griff" Zelle.
4. Nehmen Sie den Blastomeren (oder Blastomeren Paar), mit einem sterilen, Glas Pasteurpipette luftblasenfrei und übermäßige Absaugung. Die Pipette kann feuerpolierte um scharfe Kanten, die die Zelle schädigen können zu entfernen, aber wir wissen nicht routinemäßig tun. Setzen Sie die Spitze des Pasteurpipette unter der Oberfläche des Kulturmediums in einer Vertiefung der Explantat Kulturschale und sanft vertreiben die Blastomeren. Es sollte in der flachen Mulde durch die Schwerkraft gleiten. Dasselbe Blastomere aus mehr als einem Embryo kann in einem einzigen Explantat kombiniert werden.
5. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den restlichen Embryonen bei der Dissektion Gericht, one-by-one. Nach etwa 10 Embryonen, wird die Dissektion Gericht mit Zelltrümmern gefüllt werden. Wenn dies auftritt, in ein frisches Dissektion Schale zu verändern.
6. Nachdem alle Sektionen fertig sind, überprüfen, ob die Explantate in den flachen Vertiefungen sind. Wenn nicht, können sie leicht in die Vertiefung werden mit einem Haar-Schleife, die in 70% Ethanol und luftgetrocknet wurde sterilisiert geschoben.
7. Etwa eine Stunde nach der letzten Dissektion, entfernen Sie Schmutz surrounden die geheilt Explantate mit einer sterilen, Glas Pasteur Pipette.
8. Kultur die Platte von Explantaten bei 14-20 ° C neben dem Petrischale mit den Geschwistern, Kontrolle Embryonen. Sibling Embryonen zeigt den Stand der Entwicklung der Blastomeren Explantate.

4. Harvesting Explantate für die Analyse

1. Ernten Sie die Explantate, wenn die Geschwister die gewünschte Entwicklungsstadium erreichen. Diese Explantate überleben recht gut, selbst wenn einige der Zellen zerfallen. Deshalb, wenn es eine trübe Masse auch in der Kultur, erkunden es mit einem Haar-Schleife oder einer Zange, um zu bestimmen, wenn ein gesunder Explantat innerhalb begraben ist.
2. Abzuholen Explantate in einem kleinen Volumen von Kultur-Lösung mit einer Pasteurpipette aus Glas, und sanft auszustoßen sie in einem Fixiermittel oder Lysepuffer entsprechenden für den Assay durchgeführt werden.

Ergebnisse

Die Fähigkeit dieses Tests, genau zu beurteilen das Entwicklungspotenzial der Zelle beruht auf sezieren die korrekte Blastomeren über das Schicksal der Basis Karten ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Daher ist es entscheidend, Embryonen mit der korrekten Pigmentierung Muster an der 2-Zellen-Stadium zu wählen, wie in Abbildung 1, die anschließend entsprechen regelmäßigen Spaltmuster, wie in 2 veranschaulicht dargestellt. Wenn man die sortierten Embryonen beobachtet, wie sie die erforderl...

Diskussion

Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Kultivierung der einzelnen Blastomeren sind: 1) korrekt identifiziert die Blastomeren von Interesse; 2) die Aufrechterhaltung einer sterilen, gesunde Kultur, 3) Sezieren Zellen an der richtigen Teil des Zellzyklus und 4) die Entwicklung der notwendigen manuellen Fingerfertigkeit, um Schäden während der Präparation zu verhindern und Transfer zum Kultur gut.

Um bestimmte Blastomeren zu manipulieren, ist es wichtig, in der Lage sein, um die Hau...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Aluminiumoxid Schleiffolie	Thomas Scientific	# 6775E-38	Course (12 Mikrometer), für größere Reparaturen von Pinzettenspitzen
Aluminiumoxid Schleiffolie	Thomas Scientific	# 6775E-46	Medium (3 Mikrometer), für feine Schärfung Pinzettenspitzen
Aluminiumoxid Schleiffolie	Thomas Scientific	# 6775E-54	Fein (0,3 Mikrometer), zum Polieren von Pinzettenspitzen
Pinzetten: Dumont, Dumoxel Biologie Nr. 5	Fine Science Tools	# 11252-30	Diese haben die feinen Spitzen, die nicht brauchen Schärfen beim ersten gekauft. Korrosionsbeständig, so können sieautoklaviert werden.
Gentamicin-Lösung	Sigma	G1397	In den mittleren am selben Tag die Nutzung