La aplicación local de medicamentos para estudiar la función del receptor nicotínico de acetilcolina en rodajas de cerebro de ratón

Resumen

En este artículo, se describe un método útil para estudiar ligandos función del canal iónico en las neuronas de rodajas de cerebro agudamente aisladas. Este método implica el uso de una micropipeta de relleno de fármaco para aplicación local de medicamentos a las neuronas registradas utilizando técnicas estándar de patch clamp.

Resumen

El consumo de tabaco provoca numerosos problemas de salud, incluyendo cáncer, enfermedades del corazón, enfisema y derrame cerebral. La adicción a fumar cigarrillos es un trastorno neuropsiquiátrico frecuente que se deriva de las acciones biofísicos y celulares de la nicotina sobre los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) en todo el sistema nervioso central. La comprensión de los diversos subtipos de nAChR que existen en las áreas cerebrales relacionadas con la adicción a la nicotina es una de las principales prioridades.

Los experimentos que emplean técnicas tales como electrofisiología de pinzamiento zonal de célula completa o de dos electrodos grabaciones de tensión de la abrazadera son útiles para la caracterización farmacológica de nAChR de interés. NAChRs expresan las células, tales como células de cultivo de tejidos de mamífero u oocitos de Xenopus laevis, están físicamente aisladas y por lo tanto fácil de estudiar usando las herramientas de la farmacología moderna. Mucho se ha hecho uso de estas técnicas, en particular cuando el receptor diana ya se conocía unnd expresión ectópica se logró fácilmente. A menudo, sin embargo, es necesario estudiar nAChRs en su ambiente nativo: en neuronas dentro de las secciones de cerebro agudamente recogidas de ratones o ratas de laboratorio. Por ejemplo, ratones que expresan "hipersensibles" subunidades de nAChR tales como ratones α4 L9'A ¹ y ratones α6 L9 ^2, permiten la identificación inequívoca de las neuronas en base a su expresión funcional de una subunidad de nAChR específico. Aunque conjunto de células grabaciones patch clamp de neuronas en rodajas de cerebro se realiza rutinariamente por el electrofisiólogo experto, es difícil de aplicar localmente fármacos tales como la acetilcolina o la nicotina a la célula grabada dentro de un corte de cerebro. La dilución de la droga en el superfusato (baño de aplicación) no es rápidamente reversible, y tubo en U sistemas no se adaptan fácilmente para trabajar con secciones de cerebro.

En este trabajo se describe un método para la rápida aplicación de activación de nAChR medicamentos a las neuronas registradas en adultos mOuse rodajas de cerebro. Estándar conjunto de células grabaciones están hechos de neuronas en rodajas, y una micropipeta segunda llena de un fármaco de interés es maniobrado en posición cerca de la célula registrada. Una inyección de aire a presión o nitrógeno inerte en la pipeta relleno de fármaco provoca una pequeña cantidad de solución de fármaco para ser expulsado de la pipeta sobre la celda de grabado. Usando este método, nAChR mediada por las corrientes son capaces de resolver con precisión de milisegundos. Tiempos de solicitud de medicamentos puede variarse fácilmente, y la pipeta de relleno de fármaco puede ser retraído y se reemplaza con una nueva pipeta, permitiendo curvas concentración-respuesta a crear para una sola neurona. Aunque se ha descrito en el contexto de nAChR neurobiología, esta técnica debe ser útil para el estudio de muchos tipos de canales iónicos activados por ligando o los receptores en las neuronas de rodajas de cerebro.

Protocolo

1. Preparación de las soluciones para la preparación de cortes de cerebro y electrofisiología

1. Soluciones para la preparación de secciones de cerebro se han descrito anteriormente ^{3, 4.} Preparar N-metil-D-glucamina (NMDG)-basado de corte y solución de recuperación de la siguiente composición (en mM): 93 N-metil-D-glucamina, 2,5 KCl, 1,2 NaH ₂ PO _4, 30 NaHCO _3, 20 HEPES, 25 glucosa, 5 ascorbato de Na ^+, 2 tiourea, 3 Na ⁺ piruvato, 10 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 0,5 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Ajuste a 300-310 mOsm con NMDG. Ajustar el pH a 7.3-7.4 con 10 N HCl.
   1. Disolver MgSO ₄ • 7H ₂ O y CaCl ₂ • 2H ₂ O en agua Millipore para hacer 2 M soluciones madre de cada uno.
   2. Pesar otros componentes en el orden indicado y añade a un matraz volumétrico de llenado parcialmente con agua Millipore mientras se agita para disolver. Una vez que todo se añade, llenarmatraz aforado con agua Millipore.
   3. Medir el pH y ajustar con 10 N HCl.
   4. Medir la osmolaridad y ajustar con NMDG si es necesario.
2. Preparar HEPES holding líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) de la siguiente composición (en mM): 92 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH ₂ PO _4, 30 NaHCO _3, 20 HEPES, 25 glucosa, 5 ascorbato Na ^+, 2 tiourea, 3 Na piruvato ^+, 2 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 2 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Ajuste a 300-310 mOsm con sacarosa. Ajustar el pH a 7.3-7.4 con 1 N HCl o NaOH.
   1. Pesar los componentes en el orden indicado y añade a un matraz volumétrico de llenado parcialmente con agua Millipore mientras se agita para disolver. Una vez que todo se añade, llenar matraz aforado con agua Millipore.
   2. Medir el pH y ajustar con NaOH o HCl si es necesario.
   3. Medir la osmolaridad y ajustar con sacarosa, si es necesario.
3. Preparar solución estándar de grabación LCRa de la siguiente composición (en mM): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH ₂ PO _4, 24 NaHCO _3, 12,5 glucosa, 2 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 2 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Ajuste a 300-310 mOsm con sacarosa. Ajustar el pH a 7.3-7.4 con 1 N HCl o NaOH.

2. Preparación de las rebanadas cerebral agudo

1. Corte de cortes de cerebro y recuperación se realizan como se ha descrito anteriormente ^{3, 4.} Burbuja de dos platos de cristal lleno de NMDG solución de recuperación con 95% de oxígeno / 5% de gas CO ₂ (carbógeno), un plato sobre el hielo, y la otra a 33 º C.
2. Burbuja de un plato de cristal lleno con HEPES que sostienen LCRa con carbógeno a temperatura ambiente.
3. Se anestesia el ratón adulto (de 2 a 12 meses) con Na ⁺ pentobarbital (200 mg / kg, ip). Continúe con el procedimiento cuando el animal no responde a un dedo del pie-pinch.
4. Si es necesario, corte una muestra de tejido de la cola para su posterior genotypING del animal.
5. Abrir la cavidad torácica, exponer el corazón, y la abrazadera de la aorta descendente. Lacerar la aurícula derecha.
6. Transcardially perfundir los animales con 5-10 ml de 0-4 ° C NMDG solución de recuperación.
7. Decapitar a los animales, retire el cerebro y lo coloca en 4 ° C NMDG solución de recuperación de 1 min.
8. En una placa metálica enfriada con hielo, recorte el cerebro en la orientación deseada (coronal, parasagital, horizontal, etc) para incluir el área de interés.
9. Coloque el bloque de cerebro con pegamento a la superficie etapa seca de una máquina de cortar vibrante (DSK-Zero 1; Dosaka), sumergir el bloque cerebro en 4 ° C NMDG solución de recuperación y continuamente burbujas de la solución con carbógeno.
10. Cortar las rebanadas de la zona del cerebro de interés. Espesor de la rebanada es de 200-400 micras, dependiendo del área del cerebro específica de interés, la edad del animal, y experimento a realizar.
11. Inmediatamente después del corte, incube las rebanadas deseadas en carbogenated, 33 ° C NMDG de recuperación solutidurante exactamente 12 minutos, luego se transfieren a HEPES carbogenated, sala de temperatura de mantenimiento solución por un período inicial de 60 min. Después de esta incubación de 60 min, las rodajas se puede utilizar para la grabación. Las láminas se mantuvieron en solución de HEPES que sostienen todo el día hasta que se utilizan para la grabación.

3. Patch Clamp grabación de neuronas en rodajas de cerebro

1. Tire una micropipeta estándar con un parche programable Flaming-Brown extractor (Sutter P-97 o extractor verticales equivalente). Pipetas que son óptimas para la formación de sello giga-ohmios típicamente tienen una resistencia de 4-6 mW
2. Transferir una rebanada a la cámara de grabación (RC-27L; Instrumentos Warner) en la etapa de un microscopio vertical (Nikon FN-1). Continuamente superfuse (1,5 - 2,0 ml / min) en el sector con carbogenated, grabación estándar LCRa calentado y mantenido a 32 ° C. Alternativamente, las rebanadas se puede mantener a temperatura ambiente.
3. Y centre el área cerebral de interés utilizandouno de los objetivos del aire 10 veces (Nikon Plan Fluor 10X; NA 0,3; WD: 16 mm).
4. Visualizar las neuronas individuales utilizando un 40X en el infrarrojo cercano (IR) objetivo de inmersión en agua (Nikon APO 40XW; NA: 0,80; WD: 3,5 mm) conectado a contraste de interferencia IR-diferencial (DIC) óptica y una velocidad alta de infrarrojo cercano dispositivo acoplado cargado (CCD) video cámara (Hamamatsu C-7500). Bajo IR-DIC observación, las neuronas sanas presentan una superficie lisa, de color gris claro membrana plasmática.
5. Llenar una micropipeta con una solución de registro intracelular adecuado. Para la mayoría de aplicaciones, se utiliza la siguiente solución (en mM): 135 gluconato de potasio, 5 EGTA, 0,5 CaCl _2, 2 MgCl _2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, GTP y 0,1 (pH se ajustó a 7,25 con Tris base, osmolaridad ajustado a 290 mOsm con sacarosa). Establecer una grabación de célula entera de una neurona visualizado.

4. La aplicación local de medicamentos a las neuronas en rodajas

1. Tire una micropipeta de patch clamp estándar como se describe anteriormente. Usoun extractor de pipeta como una Sutter P-97 que produce dos hermanas "idénticas" consejos de la misma pieza de vidrio es ventajoso cuando las soluciones de fármacos múltiples se van a utilizar en la misma célula. Tamaños de la punta que tienen una resistencia de ~ 5 mW si se llenaron con la solución intracelular se ha descrito anteriormente es la óptima.
2. Relleno de la micropipeta con una solución de fármaco se diluyó en aCSF carbogenated, grabación estándar. Dirija la punta hacia abajo, y la película de la micropipeta relleno de fármaco para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la columna de solución.
3. Montar la micropipeta relleno de fármaco en un soporte de pipetas conectado con un tubo a un sistema de presión de expulsión adecuado, tal como un Picospritzer III (General Valve Co.). El titular de la pipeta debe ser montado en un micromanipulador con la misma resolución que manipuladores comúnmente utilizado para la grabación de patch clamp (por ejemplo, Sutter MP-285). Adicionalmente, el manipulador debe permitir el movimiento diagonal dentro y fuera de la rebanada. Hombreexpulsar manualmente presión 3 a 4 veces en la micropipeta con el fin de acumular la presión adecuada detrás de la columna de fluido.
4. Uso de los controles micromanipulador, baje la pipeta fármaco en la porción mientras se visualiza la punta bajo IR-DIC óptica. Idealmente, se debe identificar visualmente y el centro de una neurona a grabarse, seguido por la colocación de la pipeta de drogas cerca de la célula antes de la reducción de la micropipeta grabación dentro de la rebanada. Colocación de la pipeta de drogas puede provocar el movimiento del tejido en la vecindad de la célula grabada que podría interrumpir la grabación si el fármaco pipeta se coloca en posición después de establecer un sello gigaohmio.
5. Utilización de vídeo de IR, la posición de la micropipeta fármaco en la superficie superior de la lámina de tejido. Ejecutar una presión de eyección y el monitor 1) la proximidad de la punta para el movimiento de los desechos en relación con la expulsión, y 2) la punta de la micropipeta para detectar cualquier signo de que la punta está tapada o bloqueada. Si la punta está obstruido / tapado, retraiga el pipeteee y reemplazarla con una nueva.
6. Enfoque de la célula grabada en diagonal desde la parte superior de la rebanada de tal manera que cuando está en posición final, la punta de la pipeta de relleno de fármaco es 1) en el mismo plano focal (o ligeramente por debajo) como la celda grabada y la punta del electrodo de registro , y 2) 10 a 40 micras de la célula registrada. Si la punta de pipeta relleno de fármaco está por encima de la celda grabada, la fuerza de la presión de eyección podría interrumpir el sello gigaohmio.
7. Registrar la respuesta celular deseada mientras mantiene la celda en modo de tensión de la abrazadera o el modo de abrazadera de corriente. En forma rutinaria grabar acetilcolina y / o la nicotina-suscitó corrientes celulares mientras mantiene las neuronas en el modo de fijación de voltaje. Aunque la presión de eyección puede ser activado manualmente cuando se utiliza un Picospritzer III, para obtener resultados más reproducibles se recomienda para activar la eyección de presión utilizando el sistema de adquisición (Axon Digidata 1440 y pClamp 10,3) con un pulso digital TTL.

5. ControladorLa micropipeta lleno de drogas con un traductor piezoeléctrico

1. Si es posible, montar el soporte de pipetas relleno de fármaco a un traductor de una sola dimensión piezoeléctrico (por ejemplo Piezojena PA-100 o Burleigh PZM-150) que es capaz de aceptar una entrada de voltaje analógico (de nuevo, desde el sistema de adquisición), que es luego montado en el micromanipulador de alta precisión (Sutter MP-285). Un traductor piezoeléctrico es útil debido a que el movimiento de la pipeta relleno de fármaco dentro y fuera de la rodaja, incluyendo el tiempo y la velocidad de entrada / salida, puede ser más fácilmente controlados y reproducidos de experimento a experimento. Al estudiar los nAChR, los efectos desensibilizantes de fuga de la nicotina de la pipeta relleno de fármaco, si llegaran a ocurrir, se minimizan cuando la pipeta se mueve sólo cerca de la celda con un traductor piezoeléctrico para el momento de la presión de eyección.
2. A través del potenciómetro controlado manualmente en el amplificador de control de tensión piezoeléctrico, marque el voltajea su valor máximo.
3. Uso del micromanipulador, la posición de la pipeta relleno de fármaco en el segmento en el que la pipeta se expulsa su contenido sobre la celda grabada, y retraer manualmente la pipeta por la reducción de la tensión a cero del amplificador de tensión de control piezoeléctrica.
4. Uso de una señal de salida analógica desde el sistema de adquisición de grabación, mueva la pipeta relleno de fármaco en la rebanada durante un período de 250 mseg a partir de 300 mseg antes de la presión de eyección TTL pulso se produce. Retraer la pipeta durante un período de 250 ms, a partir de 50 mseg después del pulso TTL termina.

Resultados

En nuestros experimentos, de manera rutinaria grabar de dopamina (DA)-producción de neuronas del área tegmental ventral (VTA) y la sustancia negra pars compacta (SNc). En el modo de fijación de voltaje, presión de aplicación de la acetilcolina o la nicotina a estas células normalmente se traducirá en una corriente rápida, catión hacia dentro que alcanza pico dentro de 100-200 ms (Figura 1A-B). Decaimiento de la corriente es dictada en gran medida por la difusión del fármaco desde el sitio de ...

Discusión

El método presentado en este documento es en general útil para el estudio de ligando función del canal iónico en preparaciones de cortes de cerebro. Sin embargo, hay un número de factores que afecten significativamente a la calidad y reproducibilidad de los datos experimentales que resultan de la utilización de este método. Por ejemplo, las corrientes evocadas son muy sensibles al diámetro de la punta de la pipeta de relleno de fármaco. Pequeñas sugerencias causará dificultades con expulsar la solución de f?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-metil-D-glucamina	Sigma	M2004
KCl	Sigma	P3911
NaH 2 PO 4	Sigma	S9638
NaHCO 3	Sigma	S6014
HEPES	Sigma	H3375
Glucosa	Sigma	G5767
Na + Ascorbato	Sigma	A4034
Tiourea	Sigma	T8656
Na + Piruvato	Sigma	P2256
MgSO 4 • 7H 2 O	Sigma	230391
De CaCl 2 • 2H 2 0	Sigma	223506
NaCl	Sigma	S9625
Na + Pentobarbital	Vortech Farmacia	76351315
Gluconato de potasio	Sigma	G4500
EGTA	Sigma	E3889
Mg-ATP	Sigma	A9187
GTP	Sigma	G8877
DSK-Zero 1 vibrante slicer	Ted Pella, Inc.
P-97 Flaming / Brown micropipeta extractor	Sutter
Cámara RC-27 Grabación	Warner
TC-344B perfusión controlador calentador	Warner	640101
SH-27B Solución calentador	Warner	640102
Nikon FN-1	Nikon
C-7500 CCD cámara de vídeo	Hamamatsu
Picospritzer III	General Valve Co.
MP-285 Micromanipulador	Sutter
PA-100 traductor piezoeléctrico	Piezosystem jena, Inc.
12V40 piezo amplificador	Piezosystem jena, Inc.
Axopatch 200B	Molecular Devices Corp.
Digidata 1440A	Molecular Devices Corp.