Application locale de médicaments pour l'étude des fonctions récepteur de l'acétylcholine nicotinique dans des tranches de cerveau de souris

Résumé

Dans cet article, nous décrivons une méthode utile pour étudier ligand-gated fonction des canaux ioniques dans les neurones du cerveau tranches isolés de manière aiguë. Ce procédé implique l'utilisation d'une micropipette remplie de médicament pour application locale de médicaments à des neurones enregistrés à l'aide des techniques classiques de patch-clamp.

Résumé

L'usage du tabac entraîne de nombreux problèmes de santé, dont le cancer, les maladies cardiaques, l'emphysème, et d'AVC. La dépendance à la cigarette est un trouble neuropsychiatrique répandue qui découle des actions biophysiques et cellulaires de la nicotine sur les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (nAChR) dans le système nerveux central. Comprendre les sous-types de nAChR différentes qui existent dans les zones cérébrales concernées dépendance à la nicotine est une priorité majeure.

Les expériences qui recourent à des techniques d'électrophysiologie comme patch clamp de cellules entières ou de deux électrodes de potentiel imposé enregistrements sont utiles pour la caractérisation pharmacologique de nAChR d'intérêt. NAChR cellules exprimant mammifères, tels que les cellules de culture tissulaire ou ovocytes de Xenopus laevis, sont physiquement isolés et sont donc faciles à étudier en utilisant les outils de la pharmacologie moderne. Beaucoup de progrès ont été réalisés en utilisant ces techniques, en particulier lorsque le récepteur cible était déjà connu unee ectopique expression a été facilement atteint. Souvent, cependant, il est nécessaire d'étudier nAChR dans leur environnement naturel: dans les neurones dans des tranches de cerveau aiguë récoltés à partir des souris de laboratoire ou des rats. Par exemple, des souris exprimant "hypersensible" sous-unités nAChR tels que les souris L9'A α4 α6 ¹ et les souris L9 ^2'S, permettre une identification sans ambiguïté de neurones sur la base de leur expression fonctionnelle de la sous-unité de nAChR spécifique. Bien que la cellule entière enregistrements de patch-clamp de neurones dans des tranches de cerveau est fait de façon routinière par l'électrophysiologiste qualifiée, il est difficile d'appliquer localement des médicaments tels que l'acétylcholine ou la nicotine à la cellule enregistrée dans une tranche de cerveau. La dilution de la drogue dans l'superfusat (demande de bain) n'est pas rapidement réversible et tube en U systèmes ne sont pas facilement adapté pour fonctionner avec des tranches de cerveau.

Dans cet article, nous décrivons une méthode pour appliquer rapidement nAChR activant les médicaments pour les neurones enregistrés chez les adultes mOuse tranches de cerveau. Standard de cellules entières enregistrements sont faits à partir de neurones en tranches, et une seconde micropipette remplie d'un médicament d'intérêt est manoeuvré en position près de la cellule enregistrée. Une injection d'air sous pression ou de l'azote inerte à l'intérieur de la pipette remplie de médicament entraîne une petite quantité de solution de médicament devant être éjectée à partir de la pipette sur la cellule enregistrée. En utilisant cette méthode, nAChR médiées par les courants peuvent être résolus avec une précision milliseconde. Temps d'application de drogue peut facilement être modifiée, et la pipette remplie de médicament peut être retiré et remplacé par une nouvelle pipette, permettant courbes concentration-réponse doit être créé pour un seul neurone. Bien que décrite dans le contexte de nAChR neurobiologie, cette technique devrait être utile pour étudier de nombreux types de canaux ioniques ligand-dépendants ou des récepteurs de neurones à partir de tranches de cerveau.

Protocole

1. Préparation des solutions pour la préparation de tranches de cerveau et d'électrophysiologie

1. Solutions pour la préparation de coupes de cerveau ont été décrites précédemment ^{3, 4.} Préparer la N-méthyl D-glucamine (NMDG)-en fonction de coupe et de récupération de la composition suivante (en mM): 93 N-méthyl D-glucamine, 2,5 KCl, 1,2 NaH ₂ PO _4, 30 NaHCO _3, HEPES 20, 25 glucose, 5 Na ⁺ ascorbate, 2 thiourée, 3 Na ⁺ pyruvate, 10 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 0,5 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Ajuster à 300-310 mOsm avec NMDG. Ajuster le pH à 7.3 à 7.4 avec HCl 10 N.
   1. Dissoudre MgSO ₄ • 7H ₂ O et CaCl ₂ • 2H ₂ O dans de l'eau millipore pour faire 2 solutions mères de chaque M.
   2. Peser d'autres composants dans l'ordre indiqué et ajouter une fiole jaugée partiellement rempli d'eau Millipore en remuant pour dissoudre. Une fois que tout est ajouté, remplissezfiole jaugée avec de l'eau Millipore.
   3. Mesurer le pH et l'ajuster avec 10 HCl.
   4. Mesurer l'osmolarité et ajuster avec NMDG si nécessaire.
2. Préparer HEPES maintien du liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) ayant la composition suivante (en mM): NaCl 92, KCl 2,5, 1,2 NaH ₂ PO _4, 30 NaHCO _3, 20, 25 HEPES, 5 glucose Na ⁺ ascorbate, 2, 3 Na thiourée pyruvate ^+, 2 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 2 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Ajuster à 300-310 mOsm avec du saccharose. Ajuster le pH à 7.3 à 7.4 avec HCl 1 N ou NaOH.
   1. Peser les composants dans l'ordre indiqué et ajouter une fiole jaugée partiellement rempli d'eau Millipore en remuant pour dissoudre. Une fois que tout est ajoutée, remplir fiole jaugée avec de l'eau Millipore.
   2. Mesurer le pH et ajuster avec NaOH ou HCl, si nécessaire.
   3. Mesurer et ajuster l'osmolarité de saccharose, si nécessaire.
3. Préparer la solution étalon de aCSF enregistrement de la composition suivante (en mM): 124 NaCl, KCl 2,5, 1,2 NaH ₂ PO _4, 24 NaHCO _3, 12,5 glucose, 2 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 2 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Ajuster à 300-310 mOsm avec du saccharose. Ajuster le pH à 7.3 à 7.4 avec HCl 1 N ou NaOH.

2. Préparation des tranches de cerveau aiguë

1. Coupe de tranches de cerveau et de récupération sont effectuées comme décrit précédemment ^{3, 4.} Plats bulle de cristal rempli de deux NMDG solution de récupération de l'oxygène à 95% / 5% de CO ₂ de gaz (carbogène), un plat sur ​​la glace, l'autre à 33 ° C.
2. Une bulle de cristal plat rempli d'HEPES maintien aCSF avec carbogène à température ambiante.
3. Anesthésier la souris adulte (âgée de 2 à 12 mois) avec du pentobarbital Na ⁺ (200 mg / kg, ip). Passez à la procédure lorsque l'animal n'a pas de réponse à un orteil-pincement.
4. Si nécessaire, couper la queue d'un échantillon de tissu pour plus tard génotypagetion de l'animal.
5. Ouvrez la cage thoracique, exposer le cœur, et serrer l'aorte descendante. Lacérer l'oreillette droite.
6. Transcardiaque perfuser animal avec 5-10 ml de 0-4 ° C NMDG-récupération de la solution.
7. Décapiter, détacher le cerveau et le placer dans 4 ° C NMDG-récupération de la solution pendant 1 min.
8. Sur une plaque de métal refroidi à la glace, couper le cerveau dans l'orientation désirée (coronale, parasagittale, horizontal, etc) pour y inclure la zone d'intérêt.
9. Fixez le bloc de cerveau avec de la colle à la surface de la platine à sec d'une trancheuse vibrant (DSK-Zero 1; Dosaka), immerger le bloc du cerveau chez 4 ° C NMDG-récupération de la solution, et en continu la solution à bulles avec carbogène.
10. Couper les tranches de la zone du cerveau d'intérêt. L'épaisseur des tranches est de 200-400 um, en fonction de la zone du cerveau spécifique d'intérêt, âge de l'animal, et expérience à réaliser.
11. Immédiatement après la coupe, incuber les tranches souhaitées dans carbogenated, 33 ° C NMDG recouvrement des solutipendant exactement 12 min, puis transfert à carbogenated, HEPES température ambiante détenant solution pour une période initiale de 60 min. Après cette incubation 60 min, les tranches peuvent être utilisées pour l'enregistrement. Tranches sont maintenus en solution HEPES maintien tout au long de la journée jusqu'à ce qu'ils soient utilisés pour l'enregistrement.

3. Enregistrement de patch-clamp de neurones dans des tranches de cerveau

1. Tirez une micropipette de raccordement standard avec un programmable Flaming-Brown extracteur (Sutter P-97 ou équivalent extracteur vertical). Pipettes qui sont optimales pour la formation de joint giga-ohms ont généralement une résistance de 4-6 MQ
2. Transfert d'une tranche de la chambre d'enregistrement (RC-27L, Instruments Warner) sur la platine d'un microscope droit (Nikon PN-1). Continue superfuse (1,5 - 2,0 ml / min), la tranche avec carbogenated, enregistrement standard aCSF chauffée et maintenue à 32 ° C. En variante, des tranches peut être maintenu à la température ambiante.
3. Localisez et centre de la zone du cerveau d'intérêt en utilisantun objectif 10X air (Nikon Plan Fluor 10X; NA 0,3; WD: 16 mm).
4. Visualisez les neurones individuels en utilisant un 40X proche infrarouge (IR) Objectif immersion dans l'eau (APO Nikon 40XW; NA: 0,80; Roues motrices: 3,5 mm) relié à contraste d'interférence différentiel IR (DIC) et un système optique à haute vitesse proche infrarouge dispositif couplé chargé caméra vidéo (CCD) (Hamamatsu C-7500). Sous IR-DIC observation, les neurones sains présentent une surface lisse, la membrane plasmique gris clair.
5. Remplir une micropipette avec une solution d'enregistrement intracellulaire approprié. Pour la plupart des applications, nous utilisons la solution suivante (en mM): 135 gluconate de potassium, 5 EGTA, 0,5 _CaCl2, MgCl2 _2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, GTP et 0,1 (pH ajusté à 7,25 avec du Tris base, l'osmolarité ajustée à 290 mOsm avec du saccharose). Établir un enregistrement de cellule entière d'un neurone visualisées.

4. Application locale de médicaments à neurones de tranches

1. Tirez une micropipette de raccordement standard de serrage comme décrit ci-dessus. Utilisationun extracteur pipette comme une Sutter P-97 qui produit deux «sœurs» identiques conseils de la même pièce de verre est avantageuse lorsque plusieurs solutions médicamenteuses doivent être utilisés sur la même cellule. Tailles de buses qui ont une résistance d'environ 5 MW s'ils ont été remplis avec la solution intracellulaire décrit ci-dessus sont optimales.
2. Remblai de la micropipette avec une solution de médicament dilué dans carbogenated, aCSF enregistrement standard. Pointer le bout vers le bas et secouez la micropipette remplie de médicaments pour éliminer les bulles d'air piégées dans la colonne de solution.
3. Monter la micropipette remplie de médicament dans un support de pipette reliée à un tube de système d'éjection de pression approprié, tel qu'un Picospritzer III (General Valve Co.). Le porte-pipette doit être monté sur un micromanipulateur avec la même résolution que les manipulateurs couramment utilisé pour l'enregistrement de patch-clamp (par exemple, Sutter MP-285). En outre, le manipulateur doit permettre un mouvement dans et hors diagonale de la tranche. Hommegressivement éjecter pression 3 à 4 fois dans la micropipette afin de faire monter la pression suffisant derrière la colonne de fluide.
4. Utilisation des commandes micromanipulateur, abaisser la pipette médicament dans la tranche tout en visualisant la pointe sous IR-DIC optique. Idéalement, on devrait identifier visuellement et au centre d'un neurone à être enregistrés à partir, suivi par le positionnement de la pipette de drogue près de la cellule avant d'abaisser la micropipette enregistrement dans la tranche. Le positionnement de la pipette de médicaments peuvent provoquer un déplacement du tissu dans le voisinage de la cellule enregistrée qui pourrait perturber l'enregistrement si le médicament pipette est déplacée en position après l'établissement d'un joint d'étanchéité gigaohm.
5. Utilisation de la vidéo IR, positionner la micropipette médicament à la surface supérieure de la tranche de tissu. Exécutez une pression d'éjection et le moniteur 1) au voisinage de la pointe pour le mouvement des débris liés à l'éjection, et 2) la pointe de la micropipette pour tous les signes que la buse est bouché ou bloqué. Si la pointe est bloqué / bouché, rétracter le pipette et le remplacer par un nouveau.
6. Approcher la cellule enregistrée en diagonale à partir de la partie supérieure de la tranche de telle sorte que lorsqu'il est en position finale, l'extrémité de la pipette est remplie de médicament 1) dans le même plan focal (ou légèrement inférieur) que la cellule enregistrée et l'extrémité de l'électrode d'enregistrement , et 2) 10 à 40 um de la cellule enregistrée. Si la pointe de pipette remplie de médicament est enregistrée au-dessus de la cellule, la force de la pression d'éjection pourrait perturber le joint gigaohm.
7. Enregistrer la réponse cellulaire désiré tout en maintenant la cellule en mode voltage imposé ou en mode pince de courant. Nous avons l'habitude d'enregistrer l'acétylcholine et / ou à la nicotine a suscité des courants cellulaires tout en maintenant les neurones en mode voltage imposé. Bien que la pression d'éjection peut être déclenchée manuellement lorsque vous utilisez un Picospritzer III, pour des résultats plus reproductibles, il est recommandé de déclencher l'éjection sous pression à l'aide du système d'acquisition (Axon Digidata 1440 et pClamp 10,3) avec une impulsion TTL numérique.

5. ContrôleMicropipette la Drug-remplie avec un traducteur piézoélectrique

1. Si possible, monter le support de pipette remplie de médicament à un traducteur piézo-électrique à une seule dimension (par exemple Piezojena PA-100 ou Burleigh PZM-150) qui est capable d'accepter une entrée de tension analogique (encore une fois, à partir du système d'acquisition), qui est ensuite monté sur le micromanipulateur de haute précision (Sutter MP-285). Un traducteur piézo-électrique est utile parce que le mouvement de la pipette remplie de drogue dans et hors de la tranche, y compris le calendrier et la vitesse d'entrée / sortie, peuvent être plus facilement contrôlées et reproduites par une expérience à l'. Lorsque l'on étudie les nAChR, les effets de fuite de désensibilisation nicotine de la pipette remplie de médicament, ils doivent toujours se produire, sont réduits au minimum lorsque la pipette est déplacée uniquement à proximité de la cellule avec un traducteur piézo-électrique pour le moment de l'éjection de pression.
2. L'aide du potentiomètre à commande manuelle sur l'amplificateur de commande de tension piézo-électrique, composez la tensionà sa valeur maximale.
3. À l'aide du micromanipulateur, la position de la pipette remplie de médicament dans la tranche où la pipette est éjectée de son contenu sur la cellule enregistrée, et rétracter par la pipette manuelle réduire la tension de zéro sur l'amplificateur de commande de tension piézo-électrique.
4. En utilisant un signal de sortie analogique à partir du système d'acquisition d'enregistrement, déplacer la pipette remplie de médicament dans la tranche sur une période de 250 ms 300 ms à partir de la pression d'éjection avant TTL impulsion se produit. Rétracter la pipette sur une période de 250 ms, à partir 50 ms après l'impulsion TTL extrémités.

Résultats

Dans nos expériences, nous avons l'habitude d'enregistrer à partir de la dopamine (DA) de production de neurones de l'aire tegmentale ventrale (ATV) et la substantia nigra pars compacta (SNC). Dans voltage-clamp mode, application de pression de l'acétylcholine ou la nicotine à ces cellules entraîne habituellement de façon rapide, courant vers l'intérieur cation qui atteint pic entre 100-200 ms (figure 1A-B). Décroissance du courant est largement dictée par la diffusion du m?...

Discussion

La méthode présentée dans cet article est généralement utile pour étudier ligand-gated fonction des canaux ioniques dans les préparations de tranches de cerveau. Cependant, il ya un certain nombre de facteurs qui vont affecter de manière significative la qualité et la reproductibilité des données expérimentales qui résultent de l'utilisation de cette méthode. Par exemple, les courants évoqués sont très sensibles au diamètre de la pointe de la pipette remplie de médicament. Petits conseils provoque...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-méthyl D-glucamine	Sigma	M2004
KCl	Sigma	P3911
NaH 2 PO 4	Sigma	S9638
NaHCO 3	Sigma	S6014
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G5767
Na + Ascorbate	Sigma	A4034
Thiourée	Sigma	T8656
Na + Pyruvate	Sigma	P2256
MgSO 4 • 7H 2 O	Sigma	230391
CaCl 2 • 2H 2 0	Sigma	223506
NaCl	Sigma	S9625
Na + Pentobarbital	Produits pharmaceutiques Vortech	76351315
Gluconate de potassium	Sigma	G4500
EGTA	Sigma	E3889
Mg-ATP	Sigma	A9187
GTP	Sigma	G8877
DSK-Zero 1 vibrant trancheur	Ted Pella, Inc
P-97 Flaming / Brown micropipette extracteur	Sutter
Chambre RC-27 Enregistrement	Warner
TC-344B régulateur de chauffage perfusion	Warner	640101
Warner	640102
Nikon PN-1	Nikon
C-7500 Caméra vidéo CCD	Hamamatsu
Picospritzer III	Général Valve Co.
MP-285 Micromanipulateur	Sutter
PA-100 Traducteur piézoélectrique	Piezosystem jena, Inc
12V40 piézo amplificateur	Piezosystem jena, Inc
Axopatch 200B	Molecular Devices Corp
Digidata 1440A	Molecular Devices Corp