Местное применение наркотиков по изучению никотиновых рецепторов ацетилхолина функции в срезах мозга мыши

Резюме

В этой статье мы описываем полезный метод для изучения лигандами ионных каналов функции в нейронах остро изолированных кусочков мозга. Этот метод включает в себя использование наркотиков заполненные микропипетки для местного применения препаратов на нейроны, записанные с помощью стандартных методов зажим патч.

Аннотация

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent neuropsychiatric disorder that stems from the biophysical and cellular actions of nicotine on nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) throughout the central nervous system. Understanding the various nAChR subtypes that exist in brain areas relevant to nicotine addiction is a major priority.

Experiments that employ electrophysiology techniques such as whole-cell patch clamp or two-electrode voltage clamp recordings are useful for pharmacological characterization of nAChRs of interest. Cells expressing nAChRs, such as mammalian tissue culture cells or Xenopus laevis oocytes, are physically isolated and are therefore easily studied using the tools of modern pharmacology. Much progress has been made using these techniques, particularly when the target receptor was already known and ectopic expression was easily achieved. Often, however, it is necessary to study nAChRs in their native environment: in neurons within brain slices acutely harvested from laboratory mice or rats. For example, mice expressing "hypersensitive" nAChR subunits such as α4 L9′A mice ¹ and α6 L9′S mice ², allow for unambiguous identification of neurons based on their functional expression of a specific nAChR subunit. Although whole-cell patch clamp recordings from neurons in brain slices is routinely done by the skilled electrophysiologist, it is challenging to locally apply drugs such as acetylcholine or nicotine to the recorded cell within a brain slice. Dilution of drugs into the superfusate (bath application) is not rapidly reversible, and U-tube systems are not easily adapted to work with brain slices.

In this paper, we describe a method for rapidly applying nAChR-activating drugs to neurons recorded in adult mouse brain slices. Standard whole-cell recordings are made from neurons in slices, and a second micropipette filled with a drug of interest is maneuvered into position near the recorded cell. An injection of pressurized air or inert nitrogen into the drug-filled pipette causes a small amount of drug solution to be ejected from the pipette onto the recorded cell. Using this method, nAChR-mediated currents are able to be resolved with millisecond accuracy. Drug application times can easily be varied, and the drug-filled pipette can be retracted and replaced with a new pipette, allowing for concentration-response curves to be created for a single neuron. Although described in the context of nAChR neurobiology, this technique should be useful for studying many types of ligand-gated ion channels or receptors in neurons from brain slices.

протокол

1. Подготовка решения для мозга Подготовка Slice и электрофизиологии

1. Решения для подготовки срезах мозга были описаны ^{3, 4.} Подготовка N-метил-D-глюкамин (NMDG)-основанной резки и восстановления данных следующего состава (в мМ): 93 N-метил-D-глюкамин, 2,5 KCl, 1,2 NaH _{2 4} PO, 30 NaHCO _3, 20 HEPES, 25 глюкозы, 5 Na ⁺ аскорбиновая кислота, 2 тиомочевины, 3 Na ⁺ пируват, 10 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 0,5 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Отрегулируйте до 300-310 мосм с NMDG. Отрегулируйте рН до 7.3-7.4 с 10 N HCl.
   1. Растворите MgSO ₄ • 7H ₂ O и CaCl ₂ • 2H ₂ O в Millipore воды, чтобы сделать 2 М растворов каждого из них.
   2. Взвесить другие компоненты в указанном порядке и добавить в мерную колбу частично заполненный Millipore воды при перемешивании до растворения. Как только все будет добавлен, введитемерную колбу с водой Millipore.
   3. Измерить рН и корректировать с 10 N HCl.
   4. Измерьте осмолярности и настроить NMDG если это необходимо.
2. Подготовка HEPES проведения искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF) следующего состава (в мМ): 92 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH _{2 4} PO, 30 NaHCO _3, 20 HEPES, 25 глюкозы, 5 Na ⁺ аскорбиновая кислота, 2 тиомочевины, 3 Na ⁺ пируват, 2 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 2 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Отрегулируйте до 300-310 мосм с сахарозой. Отрегулируйте рН до 7.3-7.4 с 1 N HCl или NaOH.
   1. Взвесить компоненты в указанном порядке и добавить в мерную колбу частично заполненный Millipore воды при перемешивании до растворения. Как только все будет добавлен, введите мерную колбу с водой Millipore.
   2. Измерить рН и корректировать с NaOH или HCl, если необходимо.
   3. Измерьте и отрегулируйте осмолярности с сахарозой, если необходимо.
3. Подготовка стандартной записи ACSF решение следующего состава (в мМ): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH _{2 4} PO, 24 NaHCO _3, 12,5 глюкозы, 2 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 2 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Отрегулируйте до 300-310 мосм с сахарозой. Отрегулируйте рН до 7.3-7.4 с 1 N HCl или NaOH.

2. Подготовка Острые фрагменты мозга

1. Мозг резки срез и восстановление выполняется, как описано ранее ^{3, 4.} Bubble два блюда кристалл заполнен NMDG решение для восстановления с 95% кислорода / 5% CO ₂ газ (карбогена), одно блюдо на льду, другая на 33 ° C.
2. Bubble одном кристалле блюдо заполнено HEPES проведения ACSF с карбогена при комнатной температуре.
3. Anesthetize взрослой мыши (в возрасте от 2 до 12 месяцев) с Na ⁺ фенобарбитала (200 мг / кг, внутрибрюшинно). Продолжайте процедуру, когда животное не имеет ответа на ноги-пинча.
4. Если необходимо, вырезать образец ткани хвоста для последующего genotypING животного.
5. Откройте грудную полость, подвергать сердце, и зажмите нисходящей аорты. Lacerate в правое предсердие.
6. Transcardially заливать животных с 5-10 мл 0-4 ° C NMDG-решения для восстановления.
7. Обезглавьте животного, удалить мозга и поместить его в 4 ° C NMDG-решения для восстановления в течение 1 мин.
8. На льду охлажденной металлической пластины, обрезать мозга в нужной ориентации (корональные, парасагиттальных, горизонтальная и т.д.), включают в сферу интересов.
9. Прикрепите блок с мозгом суперклей на сухой поверхности этапе вибрирующий среза (ДСК-Zero 1; Dosaka), погрузить мозг в блоке 4 ° C NMDG-решения для восстановления и постоянно пузыря решение с карбогена.
10. Вырежьте кусочки мозга сфере интересов. Толщина среза составляет 200-400 мкм, в зависимости от конкретной области мозга интересов, возраста животных, и эксперимент должны быть выполнены.
11. Сразу же после резки, инкубировать желаемого ломтики в carbogenated, 33 ° C NMDG восстановления solutiна ровно на 12 мин, затем переносить их на carbogenated, комнатной температуры HEPES проведение решение для начального периода 60 мин. После этого 60 мин инкубации срезы могут быть использованы для записи. Фрагменты сохраняются в HEPES проведение решение в течение дня, пока они используются для записи.

3. Patch Clamp Запись от нейронов в срезах мозга

1. Потяните стандартных микропипетки патч с программируемым Flaming-Brown съемник (Саттер Р-97 или эквивалент вертикального съемник). Пипетки, которые являются оптимальными для гига-ом уплотнения образование, обычно имеют сопротивление 4-6 МОм
2. Трансфер один кусочек к записи камеры (RC-27L; Warner Instruments) на этапе прямого микроскопа (Nikon FN-1). Постоянно переливать (1,5 - 2,0 мл / мин) с ломтиком carbogenated, стандартная запись ACSF нагревают и выдерживают при 32 ° C. Кроме того, ломтики можно поддерживать при комнатной температуре.
3. Найдите и центр мозга прочих интересных использования10X цель воздуха (Nikon Plan Fluor 10X, NA 0,3; WD: 16 мм).
4. Визуализация отдельных нейронов использованием 40X ближней инфракрасной (ИК) погружение в воду цель (APO Nikon 40XW; NA: 0,80; WD: 3,5 мм), подключенный к ИК-дифференциального интерференционного контраста (DIC) Оптика и высокоскоростных инфракрасных устройств с зарядовой связью (CCD) видеокамеры (Hamamatsu C-7500). В ИК-DIC наблюдения, здоровые нейроны обладают гладкие, светло-серый плазматической мембраны.
5. Заполните микропипетки с подходящим внутриклеточных решение для записи. Для большинства приложений, мы используем следующие решения (в мм): 135 глюконат калия, 5 EGTA, 0,5 ₂ CaCl, 2 MgCl _2, 10 HEPES, 2 Mg-АТФ, ГТФ и 0,1 (рН до 7,25 с Tris базы, осмолярность скорректирована до 290 мосм с сахарозой). Создание цельноклеточной запись с визуализировать нейрона.

4. Местное применение лекарственных средств для нейронов в срезах

1. Потяните стандартных микропипетки зажим патч как описано выше. Использованиепипетки съемник, таких как Саттер Р-97, который производит два одинаковых "сестра" Советы из того же куска стекла выгодно, когда несколько решений препарата будут использоваться на той же клетке. Совет размеров, что бы сопротивление ~ 5 МОм, если они были наполнены внутриклеточных решения описанных выше оптимальной.
2. Засыпка микропипетки с раствором препарата разводят в carbogenated, стандартный ACSF записи. Направьте наконечник вниз, и вылить препарат заполненные микропипетки, чтобы удалить пузырьки воздуха в ловушке в колонке решение.
3. Установите наркотиков заполненные микропипетки в пипетку держатель связанных с трубкой подходящей системы выброса давления, такие как Picospritzer III (General Valve Co.) Держатель пипетки должны быть установлены на микроманипулятора с таким же разрешением, как манипуляторы широко используются для исправления записи зажим (например, Sutter MP-285). Кроме того, манипулятор должен позволять диагональное движение в и из среза. Человекually извлечь давление от 3 до 4 раз в микропипетки для того, чтобы создать достаточное давление за колонной жидкости.
4. Использование микроманипулятора управления, снизить наркотиков пипетки в срезе при визуализации кончик при ИК-DIC оптики. В идеале, нужно визуально определить и в центре нейрона быть записан с, а затем позиционирования препарата пипетку рядом с ячейкой до снижения записи микропипетки в срез. Позиционирование препарата пипетку может вызвать движение ткани в непосредственной близости от записанной ячейки, которые могут нарушить записи, если препарат пипеткой перемещается в позицию после установления гигаом уплотнения.
5. Использование видео IR, позиционировать препарат микропипетки на верхней поверхности ткани срез. Выполнить одну выброса давления и монитор 1) вблизи острия для перемещения мусора, связанные с выбросом и 2) микропипетки совет для любых признаков того, что наконечник засорился или заблокированы. Если кончик заблокирован / забиты, убрать pipettе и заменить его на новый.
6. Подойдите к записанной ячейки по диагонали от верхнего среза так, что, когда в конечном положении, кончик наркотиков заполненной пипетки 1) в той же фокальной плоскости (или чуть ниже), записанный клетки и кончик электрода записи , и 2) 10 до 40 мкм от записали клетки. Если препарат заполненной пипетки выше записанного клетки, сила от давления выброса могут нарушить гигаом уплотнения.
7. Запись желаемый клеточный ответ, удерживая ячейки в режиме напряжения зажима или текущем режиме зажим. Мы регулярно записывать ацетилхолина и / или никотина вызвала сотовой токи, удерживая нейронов в режиме напряжения зажима. Несмотря на давление выброса может быть вызвано вручную при помощи Picospritzer III, для более воспроизводимых результатов желательно, чтобы вызвать давление выброса использованием системы сбора (Axon Digidata 1440 и pClamp 10,3) с цифровой TTL импульса.

5. Управлениенаркотиков заполненные микропипетки с пьезоэлектрическим переводчик

1. Если возможно, установите наркотиков заполненные пипетки держателю одномерный пьезоэлектрических переводчик (например, Piezojena PA-100 или Burleigh ПЗМ-150), который способен принимать аналоговое входное напряжение (опять же, от приобретения системы), которые затем установлен на высокоточные микроманипулятора (Sutter MP-285). Пьезоэлектрические переводчик полезно, потому что движение наркотиков заполненные пипетки в и из среза, в том числе сроков и скорости въезда / выезда, может быть легко контролируется и воспроизводится от эксперимента к эксперименту. При изучении нАХР, десенсибилизирующее воздействие никотина утечки наркотиков заполненной пипетки, если они когда-нибудь произойдет, сводятся к минимуму, когда пипетки только переехали около клетки с пьезоэлектрическими переводчиком на данный момент давление выброса.
2. Использование ручного контролируемого потенциометра на пьезоэлектрический усилитель напряжения управления, набрать напряжениядо максимального значения.
3. Использование микроманипулятора, должность наркотиков заполненной пипетки в срезе, где пипетка будет извлечь его содержимое на записанную ячейку, и отказаться от пипетки вручную снижении напряжения до нуля на пьезоэлектрический усилитель управления напряжения.
4. Используя аналоговый сигнал от системы сбора записи, переместите наркотиков заполненные пипетки в срезе в течение 250 мс от 300 мс до давления выброса TTL импульса происходит. Уберите пипетки в течение 250 мс, начиная с 50 мс после окончания импульса TTL.

Результаты

In our experiments, we routinely record from dopamine (DA)-producing neurons of the ventral tegmental area (VTA) and substantia nigra pars compacta (SNc). In voltage-clamp mode, pressure application of acetylcholine or nicotine to these cells will typically result in a rapid, inward cation current that reaches peak within 100-200 msec (Figure 1A-B). Decay of the current is largely dictated by diffusion of the drug from the site of action, and whether enzymes in the slice are present to metabolize the dru...

Обсуждение

Метод, представленный в этой статье в целом полезны для изучения лигандами ионных каналов функцию в подготовке среза мозга. Тем не менее, существует ряд факторов, которые существенно влияют на качество и воспроизводимость экспериментальных данных, которые являются результатом исполь...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-Methyl D-glucamine	Sigma	M2004
KCl	Sigma	P3911
NaH2PO4	Sigma	S9638
NaHCO3	Sigma	S6014
HEPES	Sigma	H3375
glucose	Sigma	G5767
Na+ ascorbate	Sigma	A4034
thiourea	Sigma	T8656
Na+ pyruvate	Sigma	P2256
MgSO4∙7H2O	Sigma	230391
CaCl2∙2H20	Sigma	223506
NaCl	Sigma	S9625
Na+ pentobarbital	Vortech Pharmaceuticals	76351315
potassium gluconate	Sigma	G4500
EGTA	Sigma	E3889
Mg-ATP	Sigma	A9187
GTP	Sigma	G8877
DSK-Zero 1 Vibrating slicer	Ted Pella, Inc.
P-97 Flaming/Brown micropipette puller	Sutter
RC-27 Recording chamber	Warner
TC-344B Perfusion heater controller	Warner	640101
SH-27B Solution heater	Warner	640102
Nikon FN-1	Nikon
C-7500 CCD Video camera	Hamamatsu
Picospritzer III	General Valve Co.
MP-285 Micromanipulator	Sutter
PA-100 Piez–lectric translator	piezosystem jena, Inc.
12V40 piezo amplifier	piezosystem jena, Inc.
Axopatch 200B	Molecular Devices Corp.
Digidata 1440A	Molecular Devices Corp.