יישום מקומי של תרופות לללמוד לתפקד קולטן אצטילכולין ניקוטינית בפרוסות מוח עכבר

Summary

במאמר זה, אנו מתארים שיטה יעילה ללמוד לתפקד ערוץ יון יגנד מגודר בנוירונים של פרוסות מוח מבודד בחריפות. שיטה זו כרוכה בשימוש בתרופה micropipette מלא ליישום מקומי של תרופות לתאי עצב שנרשמו באמצעות טכניקות מהדקות תיקון סטנדרטיות.

Abstract

שימוש בטבק מוביל לבעיות בריאותיות רבות, כולל סרטן, מחלות לב, אמפיזמה, ושבץ. התמכרות לעישון סיגריות היא הפרעה נפוצה נוירופסיכיאטריות שנובעת מפעולות biophysical והסלולריות של ניקוטין על קולטני אצטילכולין ניאציניות (nAChRs) ברחבי מערכת העצבים המרכזית. ההבנה תת nAChR השונה שקיימת באזורי המוח רלוונטיים להתמכרות לניקוטין היא בעדיפות עליונה.

ניסויים המשתמשים בשיטות electrophysiology כגון מהדק תיקון כל תאים או הקלטות מהדק מתח 2 ואלקטרודות שימושיים לאפיון תרופתי של nAChRs של עניין. תאים המבטא nAChRs, כגון תאי יונקי רקמות תרבות או ביציות Xenopus laevis, מבודד מבחינה פיזית ולכן הם למדו בקלות להשתמש בכלים של פרמקולוגיה המודרנית. התקדמות הרבה כבר נעשתה שימוש בטכניקות אלה, במיוחד כאשר הקולטן היעד כבר היה ידועביטוי אקטופי nd הושג בקלות. אולם לעתים קרובות, יש צורך ללמוד nAChRs בסביבה הטבעית שלהם: בתאי עצב בתוך פרוסות מוח חריף נקטפו מעכברים או חולדות מעבדה. לדוגמה, עכברים להביע יחידות משנה "רגישות יתר" nAChR כגון α4 עכברי L9'A ¹ ועכברי α6'S L9 ^2, מאפשר זיהוי חד משמעי של נוירונים המבוססים על ביטוים התפקודי של מקטע nAChR ספציפי. למרות שהקלטות מהדקות תיקון כל תא מתאי עצב בפרוסות מוח נעשות באופן שגרתי על ידי electrophysiologist המיומן, הוא מאתגר מקומי כדי להחיל תרופות כגון אצטילכולין או ניקוטין לתא נרשם בתוך פרוסת מוח. הדילול של תרופות לתוך superfusate (יישום אמבטיה) הוא לא מהירות הפיך, ומערכות U-צינור אינן מותאמות בקלות לעבודה עם פרוסות מוח.

במאמר זה, אנו מתארים שיטה ליישום במהירות תרופות nAChR-מפעילות לנוירונים שנרשמו במבוגרים מ 'ouse פרוסות מוח. קלטות סטנדרטיות כל תאים עשויות מנוירונים בפרוסות, וmicropipette שני, מלאי סמים של הריבית תמרן לעמדה ליד התא המוקלט. הזרקה של אוויר דחוס או חנקן אינרטי לתוך פיפטה תרופה המלאה גורמת לכמות קטנה של פתרון תרופה להיפלט פיפטה אל התא המוקלט. באמצעות שיטה זו, זרמי nAChR בתיווך יכולים להיפתר ברמת דיוק של האלפית שני. זמני יישום תרופה בקלות יכולים להיות מגוונים, ופיפטה תרופה המלאה ניתן חזרה בו והחליפה עם פיפטה חדשה, המאפשרת לעקומות ריכוז בתגובה לתיוצרנה לנוירון בודד. למרות שתאר בהקשר של nAChR נוירוביולוגיה, טכניקה זו צריכה להיות שימושית ללימוד סוגים רבים של ערוצי יגנד מגודרי יון או קולטנים בתאי עצב מפרוסות מוח.

Protocol

1. הכנה של פתרונות להכנת Slice מוח ואלקטרופיזיולוגיה

1. פתרונות להכנת פרוסות מוח תוארו בעבר ^{3, 4.} הכן N-methyl-D glucamine (NMDG)-מבוסס פתרון התאוששות וחיתוך של הרכב הבא (במ"מ): 93 N-methyl D-glucamine, 2.5 KCl, 1.2 nah ₂ PO _4, 30 ₃ NaHCO, 20 HEPES, 25 גלוקוז, 5 Na ⁺ ascorbate, 2 Thiourea, 3 Na ⁺ פירובט, 10 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 0.5 CaCl ₂ • 2H ₂ O. התאם ל300-310 mOsm עם NMDG. התאם לחומציות 7.3-7.4 עם 10 N HCl.
   1. ממס MgSO ₄ • 7H ₂ O וCaCl ₂ • 2H ₂ O במי Millipore לעשות 2 פתרוני מניות M של כל אחד.
   2. תשקול את הרכיבים אחרים בהסדר המפורט ולהוסיף לבקבוק נפחית מלאה חלקית במי Millipore תוך ערבוב להמסה. פעם הכל הוא הוסיף, למלאבקבוק מים עם הנפח Millipore.
   3. מדוד את ה-pH ולהתאים עם 10 N HCl.
   4. מדוד את אוסמולריות ולהתאים עם NMDG במידת צורך.
2. הכן HEPES מחזיק נוזל השדרתי מלאכותי (aCSF) של הרכב הבא (במ"מ): 92 NaCl, KCl 2.5, 1.2 nah ₂ PO _4, 30 ₃ NaHCO, 20, 25 HEPES גלוקוז, 5 Na ⁺ ascorbate, 2, 3 Thiourea Na ⁺ פירובט, 2 ₄ MgSO • 7H ₂ O, 2 CaCl ₂ • 2H ₂ O. התאם ל300-310 mOsm עם סוכרוז. התאם לחומציות 7.3-7.4 עם N HCl 1 או NaOH.
   1. תשקול את המרכיבים לפי הסדר הרשום ולהוסיף לבקבוק נפחית מלאה חלקית במי Millipore תוך ערבוב להמסה. פעם הכל הוא הוסיף, למלא בקבוק במי נפחית Millipore.
   2. מדוד את ה-pH ולהתאים עם NaOH או HCl במידת צורך.
   3. מדוד את אוסמולריות ולהתאים עם סוכרוז במידת צורך.
3. הכן את הפתרון הסטנדרטי aCSF הקלטה של הרכב הבא (במ"מ): 124 NaCl, KCl 2.5, 1.2 nah ₂ PO _4, 24 NaHCO _3, 12.5 גלוקוז, 2 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 2 CaCl ₂ • 2H ₂ O. התאם ל300-310 mOsm עם סוכרוז. התאם לחומציות 7.3-7.4 עם N HCl 1 או NaOH.

2. הכנה של פרוסות מוח החריפות

1. חיתוך והתאוששות פרוסת מוח נעשים כמתוארים ^{3, 4} בעבר. שתי מנות קריסטל בועות מלאות בNMDG פתרון התאוששות עם חמצן 95% / 5% ₂ גז CO (carbogen), צלחת אחת על קרח, השני על 33 ° C.
2. מנת גביש בועה אחד מלא עם HEPES מחזיק aCSF עם carbogen בטמפרטורת חדר.
3. הרדם עכבר בוגר (גילי 2 עד 12 חודשים) עם Na ⁺ פנטוברביטל (200 מ"ג / ק"ג, ip). להמשיך בהליך כאשר בעלי החיים אין לה מענה לבוהן קמצוץ.
4. במידת צורך, לחתוך דגימת רקמת זנב למועד מאוחר יותר genotyping של בעלי החיים.
5. פתח את חלל החזה, לחשוף את הלב, ומהדק את אב העורקים היורד. פצע את העלייה הימנית.
6. Transcardially ינקב את החיה עם 5-10 מ"ל של 0-4 ° C NMDG פתרון התאוששות.
7. לערוף חיה, הסר את המוח ולמקם אותו בפתרון 4 ° C-NMDG התאוששות עבור 1 דקות.
8. על לוחית מתכת קרח צוננת, חתוך את המוח בכיוון הרצוי (עטרה, parasagittal, אופקי, וכו ') כך שאכלול את השטח של עניין.
9. להדביק בלוק המוח בדבק מגע למשטח השלב היבש של מבצעה רוטט (DSK-Zero 1; Dosaka), להטביע את הבלוק במוח 4 מעלות צלזיוס פתרון NMDG התאוששות, והרף בועת הפתרון עם carbogen.
10. לחתוך פרוסות של האזור במוח של עניין. עובי פרוסה הוא 200-400 מיקרומטר, בהתאם לאזור הספציפי במוח של עניין, גיל חיה, והניסוי שבצע.
11. מייד לאחר חיתוך, פרוסות רצויות אינקובטורים בcarbogenated, 33 ° C-NMDG התאוששות solutiבבדיוק 12 דקות, ולאחר מכן להעביר ל, HEPES טמפרטורת החדר carbogenated מחזיק פתרון לתקופה ראשונית של 60 דקות. לאחר הדגרת 60 דקות זה, פרוסות יכולות לשמש להקלטה. פרוסות נשמרות בHEPES מחזיק פתרון כל היום, עד שהם משמשים להקלטה.

3. הקלטת קלאמפ תיקון מנוירונים בפרוסות מוח

1. משוך micropipette תיקון סטנדרטי עם תכנות Flaming-בראון חולץ (סאטר P-97 או חולץ אנכי מקביל). Pipettes שהם אופטימליים להיווצרות חותם גיגה אוהם בדרך כלל יש התנגדות של 4-6 MΩ
2. העברת פרוסה אחת לתא ההקלטה (RC-27L; מכשירי Warner) על הבמה של מיקרוסקופ זקוף (ניקון FN-1). רציפות superfuse (1.5-2.0 מ"ל / דקה) עם פרוסת carbogenated, ההקלטה aCSF הסטנדרטי מחוממת ומתוחזק על 32 ° C. לחלופין, פרוסות יכולות להישמר בטמפרטורת חדר.
3. אתר ומרכז האזור במוח של ריבית באמצעותמטרת אוויר 10X (ניקון התכנית פלואוריד 10X; NA 0.3; WD: 16 מ"מ).
4. דמיינו נוירונים בודדים באמצעות אובייקטיבי 40X קרוב אינפרא אדום (IR) מי טבילה (ניקון APO 40XW; NA: 0.80; WD: 3.5 מ"מ) מחוברים לניגוד IR-הפרש התערבות (DIC) אופטיקה ומהירות גבוהה ליד אינפרא אדום טעון מכשיר יחד (CCD) מצלמת וידאו (Hamamatsu C-7500). תחת תצפית IR-DIC, נוירונים בריאים מפגינים קרום פלזמה חלקה, בצבע אפור בהיר.
5. מלא micropipette עם פתרון הקלטה תאי מתאים. עבור רוב היישומים, אנו משתמשים בפתרון הבא (במ"מ): 135 גלוקונאט האשלגן, 5 EGTA, 0.5 CaCl _{2, 2} MgCl _2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, ו -0.1 GTP (חומציות מותאמת ל7.25 עם טריס בסיס, אוסמולריות מותאם ל290 mOsm עם סוכרוז). להקים הקלטה כל תא מתאי עצב באופן חזותי.

4. יישום מקומי של תרופות לנוירונים בפרוסות

1. משוך micropipette מהדק תיקון סטנדרטי כפי שתואר לעיל. שימושחולץ פיפטה כגון סאטר P-97 שמייצר שני טיפים זהים "אחותי" מאותה חתיכת הזכוכית הוא יתרון כאשר פתרונות תרופתיים רבים יש לעשות שימוש באותו התא. עצת גדלים שיש להם התנגדות של ~ 5 MΩ אם הם היו מלאים בפתרון התאי שתואר לעיל הם אופטימליים.
2. המילוי החוזר micropipette עם תמיסה של תרופה בדילול aCSF ההקלטה carbogenated, הסטנדרטי. כוון את הקצה כלפי מטה, ומעיפי micropipette תרופה המלא כדי להסיר כל בועות אוויר שנלכדו בעמודה של פתרון.
3. הר micropipette תרופה המלאה בבעל פיפטה מחובר עם צינורות למערכת מתאימה לחץ פליטה, כגון Picospritzer III (כללי Valve ושות). בעל פיפטה צריך להיות מותקן על גבי micromanipulator עם אותה הרזולוציה של מניפולטורים נפוצים להקלטת מהדק תיקון (לדוגמה, סאטר MP-285). בנוסף, מניפולטור צריך לאפשר תנועה אלכסונית לתוך ומחוץ לפרוסה. גברually להוציא לחץ 3 עד 4 פעמים בmicropipette כדי לבנות את הלחץ מתאים מאחורי עמוד הנוזל.
4. באמצעות פקדי micromanipulator, להנמיך פיפטה התרופה לפרוסה תוך לדמיין את הקצה מתחת אופטיקה IR-DIC. אופן אידיאלי, צריך לזהות ויזואלית והמרכז נוירון שיירשם מ, ואחרי המיצוב של פיפטה הסמים ליד התא לפני הפחתת micropipette ההקלטה לפרוסה. מיצוב פיפטה התרופה יכולה לגרום לתנועה של רקמות באזור התא המוקלט שעלולות לשבש את ההקלטה אם פיפטה התרופה עברה לתפקיד לאחר הקמת חותם gigaohm.
5. באמצעות וידאו IR, למקם micropipette הסמים במשטח העליון של פרוסת הרקמה. Execute פליטה 1 לחץ וצג 1) הסביבה של הקצה לתנועה של פסולת קשורה לפליטה, ו 2) בקצה micropipette עבור כל סימנים שהעצה היא סתומה או חסומים. אם הקצה חסום / סתום, לחזור בי pipettדואר ולהחליפו באחד חדש.
6. מתקרב לתא המוקלט אלכסון מהחלק העליון של הפרוסה כך שכאשר במצב סופי, קצה פיפטה תרופה המלאה הוא 1) באותו המישור מוקד (או מעט מתחתיו) כתא מוקלט וקצה החוט הרושם , ו 2) 10-40 מיקרומטר מהתא המוקלט. אם קצה פיפטה תרופה מלאה הוא מעל לתא המוקלט, הכח מפליטת הלחץ עלול לשבש את חותם gigaohm.
7. רשום את התגובה התאית הרצויה תוך כדי החזקה הסלולרית במצב מהדק מתח או במצב הנוכחי מהדק. אנחנו באופן שגרתי להקליט אצטילכולין ו / או ניקוטין שהושר זרמים סלולריים תוך החזקת נוירונים במצב מהדק מתח. למרות שיכולה להיות מופעלת על פליטת לחץ ידני בעת שימוש Picospritzer שלישי, לתוצאות יותר לשעתק מומלץ להפעיל לחץ הפליטה באמצעות מערכת הרכישה (אקסון Digidata 1440 וpClamp 10.3) עם דיגיטלי TTL דופק.

5. שליטהmicropipette תרופות המלאה עם מתורגמן פיזואלקטריים

1. אם אפשר, הר בעל פיפטה תרופה המלאה למתרגם-ממד אחד פיזואלקטריים (למשל Piezojena רשות-100 או Burleigh PZM-150), כי הוא מסוגל לקבל קלט אנלוגי מתח (שוב, ממערכת הרכישה), אשר לאחר מכן רכוב על micromanipulator הדיוק גבוה (סאטר MP-285). מתורגמן פיזואלקטריים שימושי כי התנועה של פיפטה תרופה המלאה לתוך ומחוץ לפרוסה, כולל תזמון והמהירות של כניסה / יציאה, ניתן לשלוט בקלות רבה יותר ולשכפל מניסוי לניסוי. כאשר לומדים nAChRs, השפעות להקהות רגישויות של דליפה מניקוטין פיפטה תרופה המלאה, צריכים פעם הם מתרחשים, הם מזעריים כאשר פיפטה מועברת רק בסמוך לתא עם מתרגם פיזואלקטריים לרגע של פליטת לחץ.
2. שימוש בפוטנציומטר ידני המבוקר על מגבר בקרת המתח פיזואלקטריים, חייג מתחלערכו המקסימאלי.
3. שימוש micromanipulator, עמדת פיפטה תרופה המלאה בפרוסה בי פיפטה תהיה להוציא את תכולתו על התא המוקלט, ולחזור בו באופן ידני על ידי הפחתת פיפטה המתח לאפס על מגבר בקרת המתח פיזואלקטריים.
4. שימוש באות פלט אנלוגית מרכישת מערכת ההקלטה, להזיז את פיפטה תרופה המלאה לפרוסה על פני תקופה של 250 אלפיות שניים מתחילים 300 אלפיות שניים לפני שלחץ פליטת TTL הדופק מתרחש. לחזור בי פיפטה על פני תקופה של 250 אלפיות שני, החל 50 אלפית שני לאחר TTL הדופק מסתיים.

תוצאות

בניסויים שלנו, אנחנו באופן שגרתי להקליט מדופמין (DA)-ייצור תאי עצב באזור גחון tegmental (VTA) וsubstantia nigra החלקי compacta (SNC). במצב מתח מהדק, יישום לחץ של אצטילכולין או ניקוטין לתאים אלה בדרך כלל תוצאה נוכחית מהירה, פנימה קטיון שמגיע לשיא תוך 100-200 אלפיות (איור 1 א, ב). דעיכתו של...

Discussion

השיטה שהוצגה במאמר זה היא רחב שימושית לחקר תפקוד ערוץ היון יגנד מגודר בהכנות פרוסות מוח. עם זאת, יש מספר גורמים שישפיעו באופן משמעותי את האיכות והשחזור של נתונים ניסיוניים הנובעים מניצול שיטה זו. לדוגמה, זרמים מעוררים רגישים מאוד לקוטר של קצה פיפטה תרופה המלאה. טיפים ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-מתיל D-glucamine	סיגמא	M2004
KCl	סיגמא	P3911
Nah 2 PO 4	סיגמא	S9638
NaHCO 3	סיגמא	S6014
HEPES	סיגמא	H3375
גלוקוז	סיגמא	G5767
Na + Ascorbate	סיגמא	A4034
Thiourea	סיגמא	T8656
Na + פירובט	סיגמא	P2256
MgSO 4 • 7H 2 O	סיגמא	230391
CaCl 2 • 2H 2 0	סיגמא	223506
NaCl	סיגמא	S9625
Na + פנטוברביטל	פרמצבטיקה Vortech	76351315
גלוקונאט האשלגן	סיגמא	G4500
EGTA	סיגמא	E3889
Mg-ATP	סיגמא	A9187
GTP	סיגמא	G8877
DSK-Zero 1 רטט פורס	טד פלה, Inc
P-97 Flaming / בראון micropipette חולץ	סאטר
קאמרי RC-27 הקלטה	וורנר
בקר דוד זלוף TC-344B	וורנר	640101
וורנר	640102
ניקון FN-1	ניקון
C-7500 מצלמת וידאו CCD	Hamamatsu
Picospritzer III	כללי Valve ושות
MP-285 micromanipulator	סאטר
רשות-100 מתורגמן פיזואלקטריים	Piezosystem Jena, Inc
12V40 piezo מגבר	Piezosystem Jena, Inc
Axopatch 200B	התקנים המולקולרי קורפ
Digidata 1440A	התקנים המולקולרי קורפ