Applicazione locale di farmaci allo studio delle funzioni recettore nicotinico in fettine di cervello del mouse

Riepilogo

In questo articolo, si descrive un metodo utile per lo studio ligando funzione di canale ionico in neuroni di fettine di cervello acuto isolato. Questo metodo comporta l'uso di un farmaco-riempita micropipetta per applicazione locale di farmaci per neuroni registrati utilizzando tecniche standard di patch clamp.

Abstract

L'uso del tabacco porta a numerosi problemi di salute, tra cui il cancro, malattie cardiache, enfisema, e ictus. Dipendenza da fumo di sigaretta è un disturbo neuropsichiatrico prevalente che deriva dalle azioni biofisici e cellulari della nicotina sui recettori nicotinici (nAChR) in tutto il sistema nervoso centrale. Comprendere i vari sottotipi nAChR esistenti in aree cerebrali importanti per la dipendenza da nicotina è una delle principali priorità.

Esperimenti che impiegano tecniche elettrofisiologiche, come cellula intera o patch clamp a due elettrodi registrazioni voltage clamp sono utili per la caratterizzazione farmacologica dei nAChR di interesse. NAChRs cellule esprimenti, come cellule di mammifero o di coltura tissutale oociti di Xenopus laevis, sono fisicamente isolata e sono quindi facilmente studiato utilizzando gli strumenti della moderna farmacologia. Molti progressi sono stati fatti utilizzando queste tecniche, in particolare quando il recettore bersaglio era già noto unnd espressione ectopica è facile da realizzare. Spesso, tuttavia, è necessario studiare nAChR nel loro ambiente nativo: in neuroni in fettine cerebrali acutamente raccolti da topi o ratti di laboratorio. Ad esempio, i topi che esprime "ipersensibili" subunità nAChR come topi α4 L9'A ¹ e topi α6 L9'S ^2, consente l'identificazione univoca dei neuroni in base alla loro espressione funzionale di una subunità nAChR specifico. Sebbene cellule intere registrazioni di patch clamp da neuroni in fettine di cervello è fatto di solito dal elettrofisiologo esperto, è difficile da applicare localmente farmaci come acetilcolina o la nicotina alla cella di registrare, in una sezione del cervello. Diluizione dei farmaci nella superfusate (applicazione bagno) non è rapidamente reversibile, e U-tube sistemi non si adattano facilmente a lavorare con fettine di cervello.

In questo articolo, si descrive un metodo per la rapida applicazione di nAChR-attivazione farmaci neuroni registrati in pazienti adulti mOuse fettine di cervello. Standard di cellule intere registrazioni sono fatte da neuroni in fettine, e una micropipetta secondo riempito con un farmaco di interesse viene manovrata in posizione vicino alla cella registrata. Una iniezione di aria compressa o azoto inerte nella droga-riempita pipetta provoca una piccola quantità di soluzione di farmaco ad essere espulso dalla pipetta sulla cella registrata. Usando questo metodo, nAChR mediati correnti possono essere risolti con precisione millisecondo. Tempi di applicazione del farmaco può essere facilmente variata, e il farmaco-riempita pipetta può essere retratto e sostituita con una nuova pipetta, consentendo curve concentrazione-risposta per la creazione di un singolo neurone. Sebbene descritta nel contesto di nAChR neurobiologia, questa tecnica dovrebbe essere utile per studiare molti tipi di ligando canali ionici o recettori nei neuroni da fettine cerebrali.

Protocollo

1. Preparazione di soluzioni per la preparazione del cervello Slice ed Elettrofisiologia

1. Soluzioni per la preparazione di fette di cervello precedentemente descritte ^{3, 4.} Preparare N-metil-D glucammina (NMDG) basata taglio e soluzione di recupero della seguente composizione (in mM): 93 N-metil-D glucammina, KCl 2,5, 1,2 NaH ₂ PO _4, 30 NaHCO _3, 20 HEPES, 25 glucosio, 5 Na ⁺ ascorbato, tiourea 2, 3 Na piruvato ^+, 10 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 0,5 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Portare a 300-310 mOsm con NMDG. Regolare il pH a 7,3-7,4 con 10 N HCl.
   1. Sciogliere MgSO ₄ • 7H ₂ O e CaCl ₂ • 2H ₂ O in acqua Millipore per fare 2 soluzioni madre M di ciascuno.
   2. Pesare gli altri componenti nella sequenza indicata e aggiungere in un matraccio tarato parzialmente riempito con acqua Millipore e mescolare per sciogliere. Una volta che tutto è aggiunto, riempirepallone tarato con acqua Millipore.
   3. Misurare il pH e regolare con HCl 10 N.
   4. Misurare l'osmolarità e regolare con NMDG se necessario.
2. Preparare HEPES titolari fluido cerebrospinale artificiale (aCSF) della seguente composizione (in mM): NaCl 92, KCl 2,5, 1,2 NaH ₂ PO _4, 30 NaHCO _3, 20, 25 HEPES glucosio, 5 Na ascorbato ⁺ 2, tiourea, 3 Na ⁺ piruvato, 2 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 2 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Portare a 300-310 mOsm con saccarosio. Regolare il pH a 7,3-7,4 con 1 N HCl o NaOH.
   1. Pesare i componenti nella sequenza indicata e aggiungere in un matraccio tarato parzialmente riempito con acqua Millipore e mescolare per sciogliere. Una volta che tutto è aggiunto, riempire pallone tarato con acqua Millipore.
   2. Misurare il pH e regolare con NaOH o HCl, se necessario.
   3. Misurare l'osmolarità e regolare con saccarosio, se necessario.
3. Preparare la soluzione standard di registrazione aCSF della seguente composizione (in mM): 124 NaCl, KCl 2,5, 1,2 NaH ₂ PO _4, 24 NaHCO _3, glucosio 12,5, 2 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 2 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Portare a 300-310 mOsm con saccarosio. Regolare il pH a 7,3-7,4 con 1 N HCl o NaOH.

2. Preparazione di fette cerebrale acuto

1. Slice taglio cervello e recupero vengono eseguiti come precedentemente descritto ^{3, 4.} Bubble due piatti di cristallo pieno di NMDG soluzione di ripristino con il 95% di ossigeno / 5% di CO ₂ gas (CarboGen), un piatto sul ghiaccio, l'altra a 33 ° C.
2. Bubble un piatto di cristallo pieno di HEPES tengono aCSF con CarboGen a temperatura ambiente.
3. Anestetizzare topo adulto (dai 2 ai 12 mesi) con Na ⁺ pentobarbital (200 mg / kg, ip). Procedere con procedura quando l'animale non ha alcuna risposta ad un dito del piede-pizzico.
4. Se necessario, tagliare un campione di tessuto per la successiva coda Genotypzione dell'animale.
5. Aprire la cavità toracica, esporre il cuore, e bloccare l'aorta discendente. Lacerano l'atrio destro.
6. Transcardiaca perfusione animale con 5-10 ml di 0-4 ° C NMDG soluzione di ripristino.
7. Decapitare animale, rimuovere il cervello e posizionarlo in 4 ° C NMDG soluzione di ripristino per 1 min.
8. Su una pista fredda lastra di metallo, tagliare il cervello con l'orientamento desiderato (coronale, parasagittale, orizzontale, ecc) per includere l'area di interesse.
9. Fissare il blocco cervello con colla sulla superficie stadio secco di un filtro vibrante (DSK-Zero 1, Dosaka), immergere il blocco cervello in 4 ° C NMDG soluzione di ripristino, e continuamente bolla la soluzione con CarboGen.
10. Tagliare fette della zona cerebrale di interesse. Spessore della fetta è 200-400 micron, a seconda della zona del cervello specifico di interesse, età degli animali, e esperimento da eseguire.
11. Subito dopo il taglio, fette incubare desiderati in carbogenated, 33 ° C NMDG recupero soluzione moltosu per esattamente 12 minuti, poi il trasferimento a HEPES camera carbogenated, temperatura di mantenimento soluzione per un periodo iniziale di 60 min. Dopo questa incubazione 60 min, fette può essere utilizzato per la registrazione. Fette sono mantenute in HEPES tengono soluzione tutto il giorno fino al loro impiego per la registrazione.

3. Registrazione Patch Clamp di neuroni in fettine di cervello

1. Tirare una micropipetta standard di patch con una programmabile Flaming-Brown estrattore (Sutter P-97 o equivalente estrattore verticale). Pipette ottimali per giga-ohm formazione tenuta in genere hanno una resistenza di 4-6 MW
2. Trasferire una fetta alla camera di registrazione (RC-27L; Instruments Warner), sul palco di un microscopio in posizione verticale (Nikon FN-1). Continua superfuse (1,5 - 2,0 ml / min) la fetta con carbogenated, registrazione aCSF serie riscaldata e mantenuta a 32 ° C. In alternativa, fette può essere mantenuto a temperatura ambiente.
3. Individuare e centro l'area del cervello di interesse utilizzandoun obiettivo aria 10 volte (Nikon Plan Fluor 10X, NA 0.3; WD: 16 mm).
4. Visualizza singoli neuroni con un 40X nel vicino infrarosso (IR) Obiettivo immersione in acqua (Nikon APO 40XW; NA: 0,80; WD: 3,5 mm) collegato ad IR-differenziale contrasto interferenziale (DIC) e ottiche ad alta velocità vicino infrarosso Charged Coupled Device (CCD) telecamera (Hamamatsu C-7500). In IR-DIC osservazione, neuroni sani presentano una superficie liscia, di colore grigio chiaro membrana plasmatica.
5. Riempire una micropipetta con una soluzione adeguata registrazione intracellulare. Per la maggior parte delle applicazioni, si usa la seguente soluzione (in mM): 135 gluconato di potassio, EGTA 5, CaCl ₂ 0,5, 2 MgCl _2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, GTP e 0,1 (pH regolato a 7,25 con Tris base, osmolarità regolato a 290 mOsm con saccarosio). Stabilire una cellula intera registrazione da un neurone visualizzato.

4. Applicazione locale di farmaci ai neuroni a fette

1. Tirare uno standard micropipetta patch clamp come descritto sopra. Utilizzoun estrattore pipetta come un Sutter P-97 che produce due identici "sorelle" consigli dai lo stesso pezzo di vetro è vantaggioso quando soluzioni farmacologiche multiple devono essere utilizzati sulla stessa cella. Suggerimento dimensioni che potrebbero avere una resistenza di ~ 5 MW se sono stati riempiti con la soluzione intracellulare sopra descritta sono ottimali.
2. Backfill la micropipetta con una soluzione diluita di farmaco in carbogenated, aCSF registrazione standard. Puntare la punta verso il basso, e aspirare il farmaco pieno micropipetta per eliminare eventuali bolle d'aria intrappolate nella colonna di soluzione.
3. Montare il farmaco in una micropipetta riempita portapipette collegata con la tubazione di un adeguato sistema di espulsione a pressione, ad esempio un Picospritzer III (General Valve Co.). Il titolare pipetta deve essere montato su un micromanipolatore con la stessa risoluzione manipolatori comunemente utilizzato per la registrazione di patch clamp (per esempio, Sutter MP-285). Inoltre, il manipolatore deve consentire movimento diagonale e verso la fetta. Uomomanualmente espellere pressione 3 a 4 volte nella micropipetta per costruire un'adeguata pressione dietro la colonna di fluido.
4. Utilizzando i controlli micromanipolatore, abbassare la pipetta farmaco nel fetta mentre visualizzi la punta sotto IR-DIC ottica. Idealmente, si dovrebbe identificare visivamente e centro un neurone da registrare da, seguito dal posizionamento della pipetta farmaco vicino alla cella prima di abbassare la micropipetta registrazione nella sezione. Posizionare la pipetta farmaco può causare il movimento del tessuto in prossimità della cella registrata che potrebbe disturbare la registrazione se il farmaco pipetta viene spostata in posizione dopo aver stabilito un sigillo gigaohm.
5. Utilizzando video IR, posizionare la micropipetta farmaco alla superficie superiore della fetta tessuto. Eseguire una espulsione di pressione e monitor 1) prossimità della punta per il movimento dei detriti legata alla espulsione, e 2) la punta micropipetta per qualsiasi segno che la punta sia ostruiti o bloccati. Se la punta è bloccato / intasato, ritrarre il pipettE e sostituirlo con uno nuovo.
6. Avvicinare la cella registrata diagonalmente dall'alto della fetta tale che quando in posizione finale, la punta della pipetta farmaco-riempita è 1) nello stesso piano focale (o leggermente inferiore) come cella registrata e la punta dell'elettrodo di registrazione , e 2) 10 a 40 um dalla cella registrata. Se il farmaco-riempita puntale è sopra la cella registrata, la forza di espulsione dalla pressione potrebbe compromettere la tenuta gigaohm.
7. Registrare la risposta cellulare desiderata tenendo la cella in modalità voltage clamp o modalità morsetto corrente. Abbiamo regolarmente registrare acetilcolina e / o nicotina suscitato correnti cellulari tenendo neuroni in modalità voltage clamp. Anche se la pressione di espulsione può essere attivato manualmente utilizzando un Picospritzer III, per risultati più riproducibili si consiglia di attivare l'espulsione pressione utilizzando il sistema di acquisizione (Axon Digidata 1440 e pClamp 10.3) con un TTL impulsi digitali.

5. ControlloDrug-riempita Micropipetta ad un traduttore piezoelettrico

1. Se possibile, montare il farmaco-riempita portapipette ad un traduttore monodimensionale piezoelettrico (es Piezojena PA-100 o Burleigh PZM-150) che è in grado di accettare un ingresso analogico di tensione (di nuovo, dal sistema di acquisizione), che è poi montato sul micromanipolatore alta precisione (Sutter MP-285). Un traduttore piezoelettrico è utile perché il movimento del farmaco-riempita pipetta dentro e fuori della fetta, inclusi i tempi e la velocità di entrata / uscita, possono essere più facilmente controllata e riprodotto da esperimento a esperimento. Quando si studia nAChR, gli effetti di desensibilizzazione perdite nicotina dal farmaco-riempita pipetta, se mai verificarsi, vengono minimizzati quando la pipetta viene spostata solo vicino alla cella con un traduttore piezoelettrico per il momento della pressione di espulsione.
2. Con il potenziometro a controllo manuale dell'amplificatore piezoelettrico controllo della tensione, selezionare la tensioneal suo valore massimo.
3. Utilizzando la, posizione micromanipolatore farmaco-riempita pipetta nella fetta dove la pipetta viene espulso il contenuto nella cella registrata, e ritrarre la pipetta manualmente riducendo la tensione a zero dell'amplificatore piezoelettrico controllo di tensione.
4. Utilizzando un segnale di uscita analogico dal sistema di acquisizione di registrazione, spostare il farmaco-riempita pipetta nella fetta su un periodo di 250 msec 300 msec prima di iniziare la pressione di espulsione impulsi TTL verifica. Ritrarre la pipetta in un periodo di 250 msec, iniziando a 50 msec dopo l'impulso TTL termina.

Risultati

Nei nostri esperimenti, abbiamo regolarmente registrare da dopamina (DA) alla produzione di neuroni dell'area ventrale tegmentale (VTA) e substantia nigra pars compacta (SNC). In voltage-clamp modalità di applicazione di pressione di acetilcolina o nicotina a queste cellule in genere come risultato un rapido, corrente catione attivo che raggiunge picco entro 100-200 msec (Figura 1A-B). Decadimento della corrente in larga misura dalla diffusione del farmaco dal sito di azione, e se enzimi nella fett...

Discussione

Il metodo presentato in questo articolo è ampiamente utile per studiare ligando funzione di canale ionico nella preparazione fetta del cervello. Tuttavia, ci sono un certo numero di fattori che influenzano significativamente la qualità e la riproducibilità dei dati sperimentali che derivano da utilizzando questo metodo. Per esempio, le correnti evocate sono molto sensibili al diametro della punta della pipetta farmaco-riempita. Piccoli consigli causerà difficoltà con espulsione della soluzione di farmaco, e le punt...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-metil-D glucammina	Sigma	M2004
KCl	Sigma	P3911
NaH 2 PO 4	Sigma	S9638
NaHCO 3	Sigma	S6014
HEPES	Sigma	H3375
Glucosio	Sigma	G5767
Na + Ascorbato	Sigma	A4034
Tiourea	Sigma	T8656
Na + Piruvato	Sigma	P2256
MgSO 4 • 7H 2 O	Sigma	230391
CaCl 2 • 2H 2 0	Sigma	223506
NaCl	Sigma	S9625
Na + Pentobarbital	Vortech Pharmaceuticals	76351315
Gluconato di potassio	Sigma	G4500
EGTA	Sigma	E3889
Mg-ATP	Sigma	A9187
GTP	Sigma	G8877
DSK-Zero 1 vibrante affettatrice	Ted Pella, Inc.
P-97 Flaming / Brown micropipetta estrattore	Sutter
Camera di RC-27 Registrazione	Warner
TC-344B perfusione regolatore riscaldamento	Warner	640101
SH-27B soluzione di riscaldamento	Warner	640102
Nikon FN-1	Nikon
C-7500 CCD Videocamera	Hamamatsu
Picospritzer III	Generale Valve Co.
MP-285 Micromanipolatore	Sutter
PA-100 traduttore piezoelettrico	Piezosystem jena, Inc.
12V40 piezo amplificatore	Piezosystem jena, Inc.
Axopatch 200B	Molecular Devices Corp.
Digidata 1440A	Molecular Devices Corp.