El análisis de la función génica y visualización de los cilios-generó un flujo de líquido en la vesícula Kupffer

Resumen

Los cilios generada por el flujo de líquido en la vesícula Kupffer (KV) controla de izquierda a derecha del patrón del embrión de pez cebra. Aquí se describe una técnica para modular la función de genes específicamente en células KV. Además, se muestra cómo entregar perlas fluorescentes en KV para visualizar el flujo de fluido.

Resumen

Los órganos internos como el corazón, el cerebro y el intestino desarrollar izquierda-derecha (LR) las asimetrías que son críticos para sus funciones normales ^1. Cilios Motile están involucrados en el establecimiento de LR asimetría en embriones de vertebrados, incluyendo ratón, rana, pez cebra y ^2-6. Estos 'cilios LR, generar un flujo de fluido asimétrico, que es necesario para desencadenar una conservadas nodal asimétrica (TGF-β superfamilia) cascada de señalización en el mesodermo de la placa lateral izquierda, que se cree que proporcionan información LR patrones para el desarrollo de órganos ^7. Por lo tanto, para entender los mecanismos subyacentes a los patrones LR, es esencial para identificar los genes que regulan la organización de las células ciliadas LR, la motilidad y la longitud de los cilios LR y su capacidad para generar el flujo asimétrico robusto.

En el embrión de pez cebra, LR cilios se encuentran en la vesícula Kupffer (KV) ^2,4,5. KV se compone de una sola capa de células epiteliales monociliatedque encierran un lumen lleno de líquido. Mapeo de destino ha demostrado que KV se deriva de un grupo de ~ 20-30 células conocidas como células precursoras dorsales (CFD) que migran en el margen blastodermo dorsal durante las etapas epibolia ^8,9. Durante las etapas tempranas somite, cluster CFD y se diferencian en células epiteliales ciliadas para formar KV en la tailbud del embrión ^10,11. La capacidad de identificar y rastrear las CFD-en combinación con la transparencia óptica y el rápido desarrollo del pez cebra embriones de pez cebra KV hacer un excelente sistema modelo para estudiar las células ciliadas LR.

Curiosamente, los progenitores del linaje de células DFC / KV retener puentes citoplasmáticos entre la célula de yema de hasta 4 horas después de la fertilización (hpf), mientras que los puentes citoplásmicos entre la célula de yema y otras células embrionarias después de cerrar 2 hpf ^8. Aprovechando estos puentes citoplasmáticos, hemos desarrollado una estrategia de inyección etapa específica para entregar morfolino oligonucleotides (MO) exclusivamente a las CFD y desmontables la función de un gen diana en estas ¹² células. Esta técnica crea embriones quiméricos en los que se tocaron la función de genes en el linaje DFC / KV desarrollo en el contexto de un embrión de tipo salvaje. Para el análisis de flujo de fluidos asimétrica en KV, inyectamos microesferas fluorescentes en la luz y el movimiento KV registro perla usando videomicroscopy ^2. El flujo de fluido se visualiza fácilmente y se puede cuantificar mediante el seguimiento de desplazamiento talón con el tiempo.

Aquí, utilizando la etapa específica de DFC orientada técnica gen desmontables y la inyección de microesferas fluorescentes en KV para visualizar el flujo, se presenta un protocolo que proporciona un enfoque eficaz para caracterizar el papel de un gen en particular durante el desarrollo y la función KV.

Protocolo

Visión general de la etapa específica de embriones de pez cebra inyecciones

Oligonucleótidos antisentido de morfolino (MO), que se unen a un ARNm objetivo e interrumpir la expresión de proteínas de transcripción que, son ampliamente utilizados en gen desmontables (pérdida de función) en el pez cebra estudios ^13,14. Gene Herramientas, LLC ofrece OMs que están etiquetados con cualquiera de carboxifluoresceína (emite fluorescencia verde) o lisamina (emite fluorescencia roja) para detectar MO en embriones inyectados usando microscopía fluorescente. Mediante la inyección de MO en la célula de yema en diferentes etapas de desarrollo del pez cebra, es posible entregar el MO a compartimientos específicos del embrión (Figuras 1A-F). MO inyectado en la yema entre las etapas 1-4 de células (0-1 hpf) entra en todas las células embrionarias (Figuras 1A, D, D ') a través de conexiones con la yema de que persisten hasta la etapa de 32 células ¹⁵ para facilitar la caída global. MO inyectado en la yema durante midblastetapas ULA (2,5-3 hpf) puede entrar en los progenitores de los CFD (Figuras 1B, E, E ') probablemente a través de puentes citoplásmicos ⁸ y función de los genes desmontables específicamente en el linaje de células DFC / KV ^12, sin entrar en linajes embrionarios mayoría de las otras células . Como un importante control para comprobar si la función del gen se requiere en DFC / KV o también en la yema de ^12,16, también es posible restringir MO a la célula mediante la inyección de yema entre las etapas epibolia cúpula-30% (~ 4,5 hpf) tras todos los puentes citoplasmáticos han cerrado (Figuras 1C, F, F '). Estas inyecciones se han utilizado en combinación para analizar la función de genes en DFC / KV células ^17-24. Para evaluar el flujo de fluido en KV, microperlas fluorescentes se inyecta en el lumen KV entre las etapas 6-10 somite (12-14 HPF) y luego inmediatamente imágenes utilizando videomicroscopía (Figuras 1G-J). Microperlas están disponibles que emiten fluorescencia roja o verde (o ambos), por lo que es posible utilizar diferentescanales a imagen fluorescente microperlas y MO.

1. Fase específica de Inyección de Morpholinos (MO)

La inyección de MO en embriones de pez cebra se ha demostrado previamente ^25,26. A continuación, describimos brevemente etapa específica de inyecciones MO. Después de todas las inyecciones, los embriones se transfieren a una placa de Petri y se incubaron a 28,5 ° C.

1. Global inyección MO: Recoger embriones inmediatamente después de la fertilización y cargarlos en una placa de inyección. Carga fluorescente MO en una aguja capilar y montar la aguja en un microinyector (por ejemplo, Harvard Apparatus PLI-90 Pico-inyector). Romper la punta de la aguja y ajustar los parámetros de inyección (presión y / o el tiempo) para crear una caída de inyección que tiene un volumen de 1 nl como se describe ^25,26. Usando un estereomicroscopio de disección, inyectar 1 nl de MO en la yema (Figura 1A) de ≥ 50 embriones por experimentar. Trabaje con rapidez para completar las inyecciones por el ciervo de 4 celdase.
2. DFC-dirigido inyección MO: Recoger embriones inmediatamente después de la fecundación y se incuba a 28,5 ° C. Cuando los embriones se han llegado a la etapa 256-celular (~ 2,5 hpf), rápidamente a cargar en una placa de inyección y luego inyectar 1 nl de MO fluorescente en la yema de ≥ 100 embriones entre las etapas 256-celulares y 1.000 células-(figura 1B).
3. Yema orientados MO inyección: Recoger inmediatamente después de la fecundación de embriones e incubar a 28,5 º C. En la etapa de cúpula (~ 4 hpf), cargar los embriones en una placa de inyección y luego inyectar 1 nl de MO fluorescente en la yema de ≥ 100 embriones entre la cúpula y el 30% epibolia etapas (Figura 1C).

2. Selección de embriones inyectados para el Análisis de

1. Cuando MO inyectado embriones llegar a la fase 75%-epibolia (8 hpf), retirar los embriones fertilizados y embriones muertos y luego de pantalla que viven bajo un microscopio de disección fluorescente para la distribución de la MO fluorescente. Entonces allow seleccionado para desarrollar embriones a 28,5 ° C.
   1. Para mundial inyecciones MO, seleccionar embriones que han fluorescencia uniformemente distribuidos a lo largo de todas las células en embriones (Figura 1D; Figura 2A).
   2. Para DFC-dirigida inyecciones MO, seleccionar embriones en los que fluorescente MO ha difundido a través de la yema y parece concentrarse en el margen blastodermo dorsal (CFD) (Figura 1E; Figura 2B). En esta etapa, puede ser difícil de visualizar las CFD fluorescentes debido a la fluorescencia brillante en la yema subyacente. Tenga cuidado de excluir embriones en los que el fluorescente MO ha incorporado en las células embrionarias que no sean las CFD o permanece agregados en el sitio de inyección (Figura 2D).
   3. Para yema dirigida inyecciones MO, seleccionar embriones en los que MO fluorescencia se distribuye uniformemente a lo largo de la yema y no se observó en las células embrionarias (Figura 1F; Figura 2C). Una vez más, eliminar embriones en los que la fluorescencia se mantiene MOagregados en el sitio de inyección.
2. Entre las etapas 2-4-somite (~ 11 hpf), embriones pantalla una segunda vez bajo un microscopio de fluorescencia utilizando un mayor aumento. Luego permita embriones seleccionados para desarrollar a 28,5 ° C.
   1. Para globales inyecciones MO, asegurar embriones seleccionados tienen MO fluorescencia distribuida uniformemente en KV y todas las células embrionarias (Figura 1D '; Figura 2E).
   2. Por DFC-dirigido inyecciones MO, seleccione cuidadosamente los embriones que tienen fluorescencia MO sólo en las células KV y la yema (Figura 1E '). Embriones transgénicos que expresan GFP en células KV, tales como Tg (Dusp6: d2EGFP) ^27, puede ayudar en la identificación de los embriones en el que MO ha sido entregado correctamente a las células kV (Figura 2F). Deseche los embriones con MO fluorescencia en las células embrionarias otras que las células KV.
   3. Para yema dirigida inyecciones MO, seleccionar los embriones que tienen fluorescencia MO exclusivamente en la yema ('Figura 1F: Figura2G).

3. Los embriones de montaje para analizar el flujo de líquido en KV

1. Para el análisis de flujo de fluidos asimétrica en KV mundial de MO, MO DFC-dirigido o yema orientada embriones inyectados MO, cuidadosamente dechorionate ~ 20 embriones de 4-6 somite etapas (~ 11-12 HPF) con pinzas cortantes.
2. Preparar 50 ml de 1% de bajo punto de fusión de agarosa y alícuota en tubos de 5 ml a ser mantenidos como un líquido en un baño seco a 42 ° C.
3. Transferir un embrión a una diapositiva de la depresión de vidrio (Reino Suministros Científicos, Inc.) y retirar la mayor cantidad de agua posible. Inmovilizar el embrión mediante la adición de suficiente caliente 1% de bajo punto de fusión de agarosa para cubrir sólo el embrión (demasiado agarosa puede interferir con la formación de imágenes posterior). A medida que la agarosa se ​​solidifica, utilice unas pinzas para colocar el embrión de tal manera que se KV hacia arriba (vista dorsal) (Figura 1H). Montar 10 embriones con un embrión por diapositiva. Trabaje con rapidez para asegurar que todas las inyecciones en el siguiente paso es complpuestó por el somite etapa 10 (14 HPF).

4. La inyección de microperlas fluorescentes en KV

1. Diluir Fluoresbrite Multifuorescent 0,5 micras de diámetro microesferas (Polysciences, Inc.) a 1:50 en agua estéril en un tubo Eppendorf de 1,5 ml.
2. Mezcle la dilución 1:50 de microesferas a fondo tocando el tubo de carga y 3 l en una aguja capilar. Utilizando el mismo microinyector utilizado para MO inyecciones (por ejemplo Harvard Apparatus PLI-90 Pico-inyector), romper la punta de la aguja con un fórceps y ajustar la configuración de inyección para generar el menor posible (<0,5 nl) gota inyección.
3. Bajo un microscopio de disección, alinear la aguja con la luz KV del primer embrión montado. Insertar la aguja en el lumen y se inyecta un volumen pequeño (<0,5 nl) de las perlas (Figura 1G). Una punta de la aguja pequeña y pequeño volumen de inyección son críticos para evitar KV perjudicial.
4. Inyectar todos los embriones montados. Una vez que un embrión ha sido injected, una gota de agua estéril se puede añadir en la parte superior de la agarosa para evitar que se seque. Durante el curso de las inyecciones, las perlas a menudo obstruya la abertura de la aguja. Esto requiere volver a romper la punta de la aguja y ajustando el volumen de inyección por la modulación de la presión o de ajuste de tiempo del aparato de microinyección. Vuelva a colocar la aguja si pierde filo suficiente para causar un daño significativo durante la inyección.
5. Pantalla de los embriones inyectados para la entrega exitosa de perlas con un microscopio compuesto fluorescente vertical (por ejemplo, Zeiss AxioImager M1) usando un objetivo 20X. En primer lugar, determinar si la estructura está intacta KV usando iluminación de campo claro (Figura 1J), y luego usar de fluorescencia para observar las perlas. Seleccionar embriones en los que las cuentas están presentes y se mueve dentro del lumen KV. Deseche los embriones con daño KV o no cuentas flotantes en KV. Es fácil pasar por alto KV y entregar cuentas a los tejidos cercanos o la yema subyacente. Si no tiene éxito, montaje another 10 embriones y repita el procedimiento de inyección.

5. Visualización y Análisis de Flujo de Fluidos KV

1. Para cada embrión seleccionado con los granos dentro KV, añadir una gota de agua estéril para cubrir la agarosa y luego observar KV bajo el microscopio compuesto fluorescente vertical utilizando un objetivo de inmersión de agua 63X (Figura 1I). Alternativamente, un cubreobjetos se puede aplicar para su uso con objetivos de no inmersión de agua y / o microscopios invertidos.
2. Utilice una cámara de alta velocidad montado en el microscopio (Zeiss AxioCamHSm por ejemplo) para grabar una película de 10 segundos. Registrar tanto las perlas usando el canal de fluorescencia (aproximadamente 70 cuadros / seg) y el lumen KV utilizando un campo claro o de contraste de interferencia diferencial (DIC) de canal.
3. Para visualizar todos los movimientos de cuentas con el tiempo, importar la película de perlas fluorescentes en ImageJ software (descarga gratuita en http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) unand crear una proyección máxima de todas las señales fluorescentes en la película. Para realizar la proyección máxima en ImageJ, haga clic en "Imagen → → Pilas proyecto Z". En el "Proyecto Z" de la ventana, proyectar todos los cortes con el tipo de proyección de "intensidad máxima". Esta imagen puede ser superpuesta sobre una imagen DIC de la KV en la que las perlas fueron imágenes (Figuras 3A-B).
4. Los movimientos de las perlas individuales pueden ser rastreados usando ImageJ. Un plugin ("Tracking Manual") se puede descargar en http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html . Abra la película perlas fluorescentes en ImageJ y ejecutar la función de seguimiento manual. En la ventana de seguimiento manual, revise los "parámetros" y muestran los parámetros de entrada para los "intervalos de tiempo" y "x / y calibración". Seleccione manualmente los granos que quedan en el plano focal de la película durante ≥ 50 cuadros y luego un seguimiento de ≥ 5 cuentas por embrión. La trayectoria y la velocidad de cada perla se genera por the software (Figuras 3 CD).

Resultados

Específicos Stage-inyecciones MO proporcionar un enfoque útil para analizar la función de genes en compartimentos específicos del embrión. Figura 1 presenta un diagrama de flujo de las estrategias de inyección usados ​​para probar la función de genes en DFC / KV células y cómo introducir perlas fluorescentes para visualizar el flujo de fluido en KV. La distribución de MO fluorescente en exitosos específicos etapa-embriones inyectados se muestra esquemáticamente en las figuras 1D-...

Discusión

Usando etapa específica de inyecciones para apuntar MO con el linaje celular DFC / KV es un enfoque útil para el estudio de células autonomía de la función de genes y fenotipos pleiotrópicos evitar causados ​​por caída génica global. Sin embargo, estas inyecciones pueden ser técnicamente difícil. La inyección de MO entre las etapas de 256 y 1.000 células por células puede dar lugar a tres resultados posibles: 1) el MO sigue siendo agregadas en el sitio de inyección, 2) se difunde en toda la yema de MO ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo / material	Empresa	Número de catálogo
Estándar de Control oligo-lisamina etiquetado	Gene Tools, LLC
Custom Rock2b morfolino oligo	Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0,5 micras Microesferas	Polysciences, Inc.	24054