ניתוח של תפקוד גן ויזואליזציה של זרימת נוזל צילה שנוצרה בשלפוחיות של Kupffer

Summary

זרימת cilia שנוצר נוזל בשלפוחיות של Kupffer (KV) שולטת דפוסים של שמאל וימין של עובר דג הזברה. כאן, אנו מתארים טכניקה לווסת תפקוד גן ספציפי בתאי KV. בנוסף, אנו מראים כיצד לספק חרוזי ניאון לKV לדמיין זרימת נוזל.

Abstract

איברים פנימיים כגון לב, מוח, מעיים ולפתח סימטריות שמאל ימין (LR) כי הם קריטיים עבור הפונקציות הרגילות שלהם ^1. ריסים ניעתי מעורבים בהקמת LR אסימטריה בעוברי החולייתנים, כוללים עכבר, צפרדע, ודג זברה ^2-6. "הריסים" הללו LR לייצר זרימת נוזל סימטרית שיש צורך לעורר סימטרי קטרי משומר (TGF-β superfamily) איתות מפל במזודרם צלחת הרוחב מהשמאל, שהוא חשב לספק מידע דפוסי LR לפיתוח איברים ^7. לכן, כדי להבין את המנגנונים בבסיס דפוסי LR, זה חיוני לזיהוי גנים ששולטים בארגון של תאי ריסי LR, תנועתיות ואורך ריסי LR והיכולת שלהם לייצר תזרים חזק סימטרי.

בעובר דג הזברה, ריסי LR נמצאים בשלפוחית ​​של Kupffer (KV) ^2,4,5. KV מורכב משכבה אחת של תאי האפיתל monociliatedשמצרפים לום מלא נוזל. מיפוי הגורל הראה כי KV נגזר מקבוצה של 20-30 ~ תאים המכונית תאי גב Forerunner (DFCs) שנודדים בשולי blastoderm הגבו במהלך שלבי epiboly ^8,9. במהלך השלבים מוקדמים somite, אשכול DFCs ולהתמיין לתאי אפיתל ריסים כדי ליצור KV בtailbud של העובר ^10,11. היכולת לזהות ולעקוב אחר DFCs-בשילוב עם שקיפות אופטית והתפתחות מהירה של עובר דג זברת דג הזברה KV-להפוך את מערכת מודל מצוינת ללמוד תאי ריסי LR.

מעניין, אבות של המשפחה של תאי DFC / KV לשמור גשרי cytoplasmic בין תא החלמון עד 4 לאחר הפרית שעה (hpf), ואילו גשרי cytoplasmic בין תא החלמון והתאים עובריים אחרים הקרוב לאחר 2 hpf ^8. ניצול של גשרי cytoplasmic אלה, פתחו אסטרטגית הזרקת שלב ספציפית, כדי לספק morpholino oligonucleotides (MO) באופן בלעדי לDFCs ומציאת הפונקציה של גן מטרה בתאים ¹² אלה. טכניקה זו יוצרת עוברי chimeric שבתפקוד הגן הוא הפיל אותי בשושלת DFC / KV פיתוח בהקשר של עובר פראי מסוג. כדי לנתח את זרימת נוזל סימטרית בKV, אנחנו מזריקים microbeads ניאון לKV הלום ותנועת חרוז שיא באמצעות videomicroscopy ^2. זרימת נוזל בקלות ודמיין ניתן לכמת על ידי מעקב עקירת חרוז לאורך זמן.

הנה, באמצעות טכניקת במה הספציפית DFC ממוקד מציאת הגן וההזרקה של microbeads ניאון לKV לדמיין זרימה, אנו מציגים פרוטוקול המספק גישה יעילה כדי לאפיין את תפקידו של גן מסוים בזמן ההתפתחות ותפקוד KV.

Protocol

סקירה כללית של זריקות עובר דג זברת שלב ספציפיים

אנטיסנס morpholino (MO), אשר נקלטת על mRNA ממוקד ולשבש ביטוי חלבון שמהתמליל, נמצאות בשימוש נרחב במציאת גן (פסד-of-פונקציה) לימודים בדג הזברה ^13,14. הגדרות גנים, LLC מציעות MOS שמתויגים עם או carboxyfluorescein (פולט הירוק פלואורסצנטי) או lissamine (פולט האדום פלואורסצנטי) כדי לזהות MO בעוברים הזריקו באמצעות מיקרוסקופ ניאון. באמצעות הזרקת MO לתוך תא החלמון בשלבים שונים של פיתוח דג זברה, זה אפשרי כדי לספק את MO לתאים ספציפיים של העובר (איורי 1 א-F). MO מוזרק לתוך החלמון בין 1-4 השלבים הסלולריים (0-1 hpf) נכנס כל התאים העובריים (איורים 1 א ', ד', ד ') באמצעות קשרים עם החלמון שנמשכים עד השלב ^32-15 התאים כדי להקל על מציאה העולמית. MO מוזרק לתוך החלמון בmidblastשלבי אולא (2.5-3 hpf) יכולים להיכנס לאבות של DFCs (האיורים 1B, E, E ') הסביר דרך גשרי cytoplasmic ⁸ ותפקוד גן מציאה במיוחד בשושלת DFC / KV תא ^12, בלי להיכנס לשושלות תאים עובריות אחרות ביותר . כשליטה חשובה לבחון האם תפקוד הגן נדרש בDFC / KV או גם בחלמון ^12,16, אפשר גם להגביל את MO לתא החלמון ידי הזרקה בין שלבי epiboly כיפה-30% (~ 4.5 hpf) לאחר כל גשרי cytoplasmic נסגרו (תרשימי 1C, F, ו '). זריקות אלה היו בשימוש בשילוב לנתח תפקוד גן בתאי DFC / KV ^17-24. כדי להעריך את זרימת נוזל בKV, microbeads ניאון הם מוזרקים לתוך KV הלום בין 6-10 שלבי somite (12-14 hpf) ולאחר מכן צלם באופן מיידי באמצעות videomicroscopy (תרשימי 1G-J). Microbeads זמין שפולטים פלואורסצנטי אדום או ירוק (או שניהם), כך שניתן להשתמש שוניםערוצים לתמונת הניאון microbeads ומו.

1. הזרקת שלב ספציפי של Morpholinos (MO)

הזרקה של MO לעוברי דג זברה כבר הוכיח בעבר ^25,26. כאן, אנו מתארים בקצרה זריקות MO שלב ספציפיות. בעקבות כל הזריקות, עוברים מועברים לצלחת פטרי והודגרו ב 28.5 מעלות צלזיוס

1. הזרקת MO גלובלית: איסוף עוברים מייד לאחר הפריה ולטעון אותם לתוך צלחת הזרקה. טען MO ניאון למחט נימים ולעגן את המחט על microinjector (למשל הרווארד Apparatus PLI-90 פיקו מזרק). לשבור את קצה המחט ולהתאים את הגדרות הזרקה (לחץ ו / או שעה) כדי ליצור טיפת הזרקה שיש נפח של 1 nl כמתואר ^25,26. שימוש stereomicroscope לנתח, להזריק 1 nl של MO בחלמון (איור 1 א) של ≥ 50 עוברים לניסוי. לעבוד במהירות כדי להשלים את הזריקות על ידי אייל 4-התאדואר.
2. DFC ממוקד הזרקת MO: איסוף עוברים מייד לאחר הפריה ולדגור על 28.5 מעלות צלזיוס כאשר העוברים הגיעו לשלב 256-התא (~ 2.5 hpf), לטעון אותם במהירות אל תוך צלחת הזרקה ואז מזריק 1 nl של הניאון MO בחלמון של ≥ 100 עוברים בין שלבי 256-תא והתא 1000 (איור 1B).
3. זריקת חלמון ממוקד-MO: איסוף עוברים מייד לאחר הפריה ולדגור על 28.5 מעלות צלזיוס בשלב הכיפה (~ 4 hpf), לטעון את העוברים לתוך צלחת הזרקה ואז מזריק 1 nl של הניאון MO בחלמון של ≥ 100 עוברים בין הכיפה ושלבי epiboly 30% (התרשים 1C).

2. בחירת עוברים הזריקו לניתוח

1. כאשר הזריק MO עוברים מגיעים לשלב 75%-epiboly (8 hpf), להסיר עוברים מופרים ומתים, ואז עובר מסך חיים תחת מיקרוסקופ לנתח ניאון לחלוקת MO הניאון. אז allow נבחר עוברים להתפתח ב28.5 ° C.
   1. לMO זריקות עולמיות, בחר עוברים שפלואורסצנטי מופצים באופן שווה לאורך כל התאים העובריים (1D איור; 2A איור).
   2. לDFC ממוקד MO זריקות, בחר עוברים בי הניאון MO יש המתפרש על פני החלמון ונראה מרוכז בשולי blastoderm הגבו (DFCs) (האיור 1E; התרשים 2B). בשלב זה, זה יכול להיות קשה לדמיין DFCs ניאון בשל פלואורסצנטי הבהיר בחלמון הבסיסי. תשמרו על עצמך שלא לכלול בעוברים שMO הניאון כבר שולב תאים עובריים שונים מDFCs או נשאר מצטבר באזור ההזרקה (האיור 2D).
   3. לחלמון ממוקד MO זריקות, בחר עוברים בי MO פלואורסצנטי מופץ באופן שווה בחלמון ולא נצפה בכל תאים עובריים (האיור 1F; האיור 2C). שוב, הסר עוברים בי MO הניאון נשארמקובצת באזור ההזרקה.
2. בין שלבי 2-4-somite (~ 11 hpf), עוברי מסך פעם שנייה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות הגדלה גבוהה יותר. לאחר מכן, הנח עוברים נבחרים להתפתח ב28.5 מעלות צלזיוס
   1. לזריקות MO הגלובליות, להבטיח עוברים נבחרים יש MO פלואורסצנטי מופץ באופן שווה KV וכל התאים העובריים (1D איור '; 2E איור).
   2. לDFC ממוקד MO זריקות, בחר בקפידה עוברים שפלואורסצנטי MO רק בתאי KV והחלמון (האיור 1E '). עוברים מהונדסים שמביע GFP בתאי KV, כגון Tg (Dusp6: d2EGFP) ^27, יכול לסייע בזיהוי של עוברים בי MO נמסר בהצלחה לתאי KV (האיור 2F). השלך עוברים בעלי MO פלואורסצנטי בתאים עובריים שתאי KV אחרים.
   3. לחלמון ממוקד MO זריקות, בחר עוברים שפלואורסצנטי MO באופן בלעדי בחלמון (איור 1F ': איור2G).

3. עוברי הרכבה לנתח את זרימת נוזל בKV

1. כדי לנתח את זרימת נוזל סימטרית בKV העולמי MO, DFC הממוקד MO או חלמון במיקוד MO עוברים מוזרקים, בזהירות dechorionate ~ 20 עוברים בין 4-6 שלבי somite (~ 11-12 hpf) עם מלקחיים חדים.
2. הכן 50 מ"ל של 1% agarose נקודת התכה נמוכה וaliquot לתוך 5 מיליליטר צינורות להישמר כנוזל באמבט יבש על 42 ° C.
3. העברה עוברת אחד לשקופית זכוכית דיכאון (ציוד מדעי המאוחד, Inc) ולהסיר כמה שיותר המים ככל האפשר. לשתק את העובר על ידי ההוספה מספיק חם 1% agarose נקודת התכה נמוכה, רק כדי לכסות את העובר (יותר מדי agarose יכול להפריע להדמיה שלאחר מכן). כagarose מתמצק, להשתמש במלקחיים כדי למקם את העובר באופן שKV פונה כלפי מעלה (תצוגה הגבתה) (איור 1H). הר 10 עוברים עם עובר אחד לכל שקופית. לעבוד במהירות כדי להבטיח את כל הזריקות בשלב הבא הן Completed ידי שלב 10 somite (14 hpf).

4. הזרקה של microbeads פלורסנט לתוך KV

1. דלל Fluoresbrite Multifuorescent 0.5 מיקרון הקוטר microspheres (Polysciences, Inc) ל1:50 במים סטריליים בצינור 1.5 מ"ל אפנדורף.
2. מערבב 1:50 דילול microbeads ביסודיות על ידי קשה על הצינור ולטעון 3 μl למחט נימים. שימוש באותה microinjector משמש לMO זריקות (למשל הרווארד Apparatus PLI-90 פיקו מזרק), לשבור את קצה המחט עם מלקחיים ולהתאים את הגדרות ההזרקה לייצר הקטנה ביותר האפשרית (<0.5 NL) טיפת הזרקה.
3. תחת מיקרוסקופ לנתח, ליישר את המחט עם לום KV של העובר המורכב הראשון. הכנס את המחט לתוך הלום ולהזריק נפח קטן (<0.5 NL) של חרוזים (האיור 1G). קצה מחט קטן ונפח הזרקה קטן הם קריטיים כדי למנוע KV המזיק.
4. הזרק את כל העוברים רכובים. ברגע שעובר כבר injecteד, ירידה של מים סטריליים ניתן להוסיף על גבי agarose כדי למנוע ממנו להתייבש. במהלך הזריקות, החרוזים לעתים קרובות לחסום את פתיחת המחט. זה דורש שובר-קצה המחט והתאמת עוצמת קול ההזרקה על ידי ויסות לחץ או הגדרת זמן של מנגנון microinjection. החלף את המחט, אם זה הופך בוטה מספיק כדי לגרום לניזק משמעותי בעת ההזרקה.
5. מסך העוברים המוזרקים למסירה מוצלחת של חרוזים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתחם זקוף (למשל Zeiss AxioImager M1) באמצעות 20X אובייקטיבי. ראשית, לקבוע אם מבנה KV הוא ללא פגע באמצעות brightfield תאורה (איור 1J), ולאחר מכן להשתמש פלואורסצנטי כדי לבחון את החרוזים. בחר עוברים בי חרוזים נמצאים ונע בתוך חלל KV. השלך עוברים עם ניזק KV או אין חרוזים צפים בKV. זה קל לפספס KV ולספק חרוזים לרקמות סמוכות או חלמון הבסיסי. גם אם ייכשל, ההר anoTher 10 עוברים וחזרו על תהליך ההזרקה.

5. הדמיה וניתוח של זרימת נוזל KV

1. עבור כל עובר שנבחר עם חרוזים בתוך KV, להוסיף טיפה של מים סטריליים כדי לכסות agarose ולאחר מכן להתבונן KV תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתחם הזקוף באמצעות אובייקטיבי טבילת מי 63X (איור 1 ט). לחלופין, ניתן ליישם coverslip לשימוש עם מטרות שאינן מי טבילה ו / או מיקרוסקופים הפוכים.
2. שימוש במצלמה במהירות גבוהה רכובה על המיקרוסקופ (למשל Zeiss AxioCamHSm) כדי להקליט סרט 10 שניות. להקליט שני החרוזים באמצעות ערוץ הניאון (כ 70 מסגרות / שני) ולום KV באמצעות brightfield או לעומת פער התערבות (DIC) ערוץ.
3. כדי להמחיש את כל התנועות החרוזות לאורך זמן, לייבא את הסרט של חרוזי ניאון לImageJ תוכנה (להורדה בחינם בhttp://rsb.info.nih.gov/ij/)nd ליצור הקרנה מרבית של כל אותות הניאון בסרט. כדי לבצע את ההקרנה המרבית בImageJ, לחץ על "תמונה → סטאקס → Z פרויקט." בחלון "Z הפרויקט", יקרין כל הפרוסות עם סוג ההקרנה של "מקס עצמה". תמונה זו יכולה להיות על גבי תמונת דסק KV שבחרוזים היו הדמיה (איורי 3A-B).
4. התנועות של חרוזים בודדים ניתנות למעקב באמצעות ImageJ. תוסף ("מעקב ידני") ניתן להוריד בhttp://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html. פתח את סרט חרוזי הניאון בImageJ ולהפעיל את פונקציית המעקב הידנית. בחלון של מעקב ידני, לבדוק פרמטרים "מופע" ופרמטרי קלט ל" מרווחי זמן "ו" כיול X / Y ". בחר ידני חרוזים שנותרו במישור המוקד של הסרט ל≥ 50 מסגרות ולאחר מכן לעקוב אחר ≥ 5 חרוזים לעובר. הנתיב ואת המהירות של כל חרוז נוצר על ידי התוכנת דואר (איורים 3 תקליטורים).

תוצאות

זריקות MO שלב ספציפיים לספק גישה שימושית לניתוח תפקוד גן בתאים מסוימים של העובר. איור 1 מציג תרשים זרימה של אסטרטגיות ההזרקה משמשות לבדיקת תפקוד גן בתאי DFC / KV ואיך להציג את חרוזי ניאון כדי להמחיש את זרימת נוזל בKV. חלוקת MO ניאון בעוברים מוצלחים שלב ספציפיים הזר?...

Discussion

שימוש בזריקות שלב ספציפיים כדי למקד MO למשפחה של תאי DFC / KV הוא גישה שימושית ללמוד תא האוטונומיה של תפקוד גן ולהימנע פנוטיפים pleiotropic נגרמים על ידי מציאת גנים העולמית. עם זאת, הזריקות האלה יכולות להיות מאתגרות מבחינה טכנית. הזרקה של MO בין שלבי 256-תא והתא 1000 עלולה לגרום לשל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב / חומרים	חברה	מספר קטלוגים
תקן בקרת Oligo-Lissamine מתויג	גן כלים, LLC
אישית Rock2b morpholino Oligo	גן כלים, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 מיקרון microspheres	Polysciences, Inc	24054