Analisi della funzione del gene e visualizzazione di Cilia-Generated flusso di fluido in vescicole di Kupffer

Riepilogo

Cilia generato il flusso del fluido in vescicole di Kupffer (KV) controlla sinistra-destra patterning dell'embrione zebrafish. Qui, si descrive una tecnica per modulare la funzione del gene specificamente in cellule KV. Inoltre, mostriamo come fornire perline fluorescenti in KV per visualizzare il flusso del fluido.

Abstract

Gli organi interni come il cuore, il cervello, e nell'intestino sviluppare sinistra-destra (LR) asimmetrie che sono fondamentali per le loro normali funzioni ^1. Ciglia mobili sono coinvolti nella creazione LR asimmetria negli embrioni dei vertebrati, tra cui mouse, rana, e zebrafish ^2-6. Questi 'cilia LR "generano flusso asimmetrico fluido che è necessario per attivare una conservata asimmetrica Nodal (TGF-β superfamiglia) di segnalazione cascata nel mesoderma piastra laterale sinistra, che è pensato per fornire informazioni patterning LR per lo sviluppo di organi ^7. Così, per comprendere i meccanismi sottostanti patterning LR, è essenziale per identificare i geni che regolano l'organizzazione delle cellule ciliate LR, la motilità e la lunghezza delle ciglia LR e la loro capacità di generare robusto flusso asimmetrico.

In zebrafish, ciglia LR si trovano in vescicole di Kupffer (KV) ^2,4,5. KV è costituito da un singolo strato di cellule epiteliali monociliatedche racchiudono un lume piene di liquido. Mappatura destino KV ha dimostrato che è derivato da un gruppo di ~ 20-30 cellule conosciute come cellule precursore dorsali (DFCS) che migrano al margine blastoderm dorsale durante fasi epiboly ^8,9. Durante le fasi iniziali somite, cluster DFCS e differenziarsi in cellule epiteliali ciliate per formare KV nel tailbud dell'embrione ^10,11. La capacità di identificare e tenere traccia di DFCS-in combinazione con trasparenza ottica e il rapido sviluppo del pesce zebra dell'embrione-make zebrafish KV un sistema ottimo modello per studiare le cellule ciliate LR.

È interessante notare che, progenitori della DFC / KV linea cellulare mantenere ponti citoplasmatici tra la cellula uovo fino a 4 ore post-fecondazione (HPF), mentre ponti citoplasmatici tra la cellula uovo e altre cellule embrionali vicino dopo 2 HPF ^8. Approfittando di questi ponti citoplasmatici, abbiamo sviluppato una fase specifica strategia di iniezione per fornire morfolino oligonucleotides (MO) esclusivamente a DFCS smontabili e la funzione di un gene mirato in queste cellule ^12. Questa tecnica crea embrioni chimerici in cui viene buttato funzione genica giù nella DFC / KV lignaggio sviluppare nel contesto di un embrione wild-type. Per analizzare il flusso asimmetrico fluido in KV, iniettiamo microsfere fluorescenti nel lume KV e movimento del disco perlina con videomicroscopia ^2. Flusso del fluido è facilmente visualizzato e può essere quantificata inseguimento spostamento tallone nel tempo.

Qui, con lo stadio-specifico DFC-targeting tecnica knockdown gene e iniezione di microsfere fluorescenti in KV per visualizzare il flusso, presentiamo un protocollo che fornisce un approccio efficace per caratterizzare il ruolo di un particolare gene durante lo sviluppo e la funzione KV.

Protocollo

Panoramica delle iniezioni zebrafish Stage-specifici embrioni

Oligonucleotidi antisenso morfolino (MO), che si legano ad un mRNA mirata e disturbare espressione proteica da tale trascrizione, sono ampiamente utilizzati in knockdown gene (perdita di funzione) Studi in zebrafish ^13,14. Strumenti di Gene, LLC offre MO che sono contrassegnati con uno carbossifluoresceina (emette fluorescenza verde) o lissamina (emette fluorescenza rossa) per rilevare MO negli embrioni iniettati usando la microscopia a fluorescenza. Iniettando MO nella cella tuorlo a diversi stadi di sviluppo zebrafish, è possibile fornire il MO a specifici compartimenti dell'embrione (Figure 1A-F). MO iniettato nel tuorlo tra le fasi 1-4 cellule (0-1 hpf) entra tutte le cellule embrionali (figure 1A, D, D ') tramite connessioni con il tuorlo che persistono fino a 32 cellule stadio ¹⁵ per facilitare knockdown globale. MO iniettato nel tuorlo durante midblastfasi ula (2,5-3 hpf) possono inserire i progenitori dei DFCS (1B figure, E, E '), che possano attraverso ponti citoplasmatici ⁸ e funzione del gene atterramento in particolare nel DFC / KV linea cellulare ^12, senza entrare maggior parte delle altre linee cellulari embrionali . Come un controllo importante per verificare se la funzione del gene è necessaria in DFC / KV o anche nel tuorlo ^12,16, è anche possibile limitare MO alla cella tuorlo iniettando tra le fasi epiboly dome-30% (~ 4,5 HPF) dopo tutti i ponti citoplasmatici hanno chiuso (figure 1C, F, F '). Queste iniezioni sono state utilizzate in combinazione per analizzare la funzione genica in DFC / KV cellule ^17-24. Per valutare il flusso di fluido in KV, microsfere fluorescenti vengono iniettati nel lume KV tra le fasi 6-10 somite hpf (12-14) e poi subito ripreso usando videomicroscopia (Figure 1G-J). Microperline sono disponibili che emettono fluorescenza rossa o verde (o entrambi), quindi è possibile utilizzare diversicanali di immagine fluorescente microsfere e MO.

1. Stadio-specifica di iniezione Morpholinos (MO)

Iniezione di MO in embrioni di zebrafish è stato dimostrato in precedenza ^25,26. Qui, descriviamo brevemente fase-specifici iniezioni MO. Seguendo tutte le iniezioni, gli embrioni vengono trasferiti ad una piastra di Petri e incubato a 28,5 ° C.

1. Globale iniezione MO: Raccogliere gli embrioni subito dopo la fecondazione e di caricarli in una piastra di iniezione. Caricare fluorescente MO in un ago capillare e montare l'ago su un microiniettore (ad esempio Harvard Apparatus PLI-90 Pico-iniettore). Rompere la punta dell'ago e regolare le impostazioni (pressione di iniezione e / o tempo) per creare una caduta di iniezione che ha un volume di 1 nl come descritto ^25,26. Utilizzando uno stereomicroscopio dissezione, iniettare 1 nl di MO nel tuorlo (Figura 1A) di ≥ 50 embrioni per esperimento. Lavorare velocemente per completare iniezioni dalla 4 celle cervoe.
2. DFC-mirata iniezione MO: Raccogliere gli embrioni subito dopo la fecondazione e incubare a 28,5 ° C. Quando gli embrioni hanno raggiunto la fase a 256 cellule (~ 2,5 HPF), rapidamente caricare in una piastra di iniezione e iniettare 1 nl fluorescente MO nel tuorlo di ≥ 100 embrioni tra le fasi a 256 celle e 1.000 celle (Figura 1B).
3. Tuorlo-mirata MO iniezione: Raccogliere gli embrioni subito dopo la fecondazione e incubare a 28,5 ° C. Nella fase cupola (~ 4 HPF), caricare gli embrioni in una piastra di iniezione e quindi iniettare 1 nl fluorescente MO nel tuorlo di ≥ 100 embrioni tra la cupola e le fasi epiboly 30% (Figura 1C).

2. Selezione di embrioni iniettati per l'analisi

1. Quando MO iniettato embrioni raggiungere il 75%-epiboly stadio (8 HPF), rimuovere gli embrioni non fecondate e morto e poi embrioni schermo che vivono sotto un microscopio a fluorescenza dissezione per la distribuzione del MO fluorescente. Poi allow selezionato embrioni a svilupparsi a 28.5 ° C.
   1. Per globale MO iniezioni, selezionare gli embrioni che hanno fluorescenza uniformemente distribuiti in tutta tutte le cellule embrionali (Figura 1D; Figura 2A).
   2. Per DFC-MO iniezioni mirate, selezionare gli embrioni in cui fluorescente MO è diffusa in tutto il tuorlo e sembra concentrata solo al margine dorsale blastoderma (DFCS) (Figura 1E; Figura 2B). In questa fase, può essere difficile visualizzare DFCS fluorescenti causa fluorescenza nel tuorlo sottostante. Fare attenzione ad escludere embrioni in cui la fluorescenza MO ha inserito nelle cellule embrionali diverse DFCS o rimane aggregati al sito di iniezione (Figura 2D).
   3. Per tuorlo-MO iniezioni mirate, selezionare gli embrioni in cui MO fluorescenza è uniformemente distribuiti su tutto il tuorlo e non osservato in tutte le cellule embrionali (Figura 1F; Figura 2C). Anche in questo caso, rimuovere gli embrioni in cui la fluorescente MO rimaneaggregati al sito di iniezione.
2. Tra i 2-4-somite stadi (~ 11 HPF), schermo embrioni una seconda volta sotto un microscopio a fluorescenza utilizzando un ingrandimento maggiore. Poi permettono embrioni selezionati di sviluppare a 28.5 ° C.
   1. Per globali iniezioni MO, garantire gli embrioni selezionati hanno MO fluorescenza uniformemente distribuiti in KV e tutte le cellule embrionali (Figura 1D '; Figura 2E).
   2. Per DFC-MO iniezioni mirate, selezionare con attenzione gli embrioni che presentano fluorescenza MO solo nelle cellule KV e il tuorlo (Figura 1E '). Embrioni transgenici che esprimono GFP in cellule KV, come Tg (Dusp6: d2EGFP) ^27, possono aiutare nella identificazione di embrioni in cui MO è stato recapitato a cellule KV (Figura 2F). Scartare gli embrioni con MO fluorescenza nelle cellule embrionali di altri che le cellule KV.
   3. Per tuorlo-MO iniezioni mirate, selezionare gli embrioni che hanno fluorescenza MO esclusivamente nel (tuorlo Figura 1F ': Figura2G).

3. Gli embrioni di montaggio per analizzare il flusso del fluido in KV

1. Per analizzare il flusso asimmetrico fluido in KV globale di MO, DFC-mirata MO o tuorlo-MO mirati embrioni iniettati, con attenzione dechorionate ~ 20 embrioni di 4-6 stadi somite (~ 11-12 hpf) con pinze taglienti.
2. Preparare 50 ml di 1% a basso punto di fusione agarosio e aliquotare in provette da 5 ml di essere mantenuto come un liquido in un bagno a secco a 42 ° C.
3. Trasferire un embrione a una diapositiva depressione vetro (Supplies Italia Scientific, Inc.) e rimuovere la maggior quantità di acqua possibile. Immobilizzare l'embrione aggiungendo abbastanza caldo 1% a basso punto di fusione agarosio a coprire appena l'embrione (troppo agarosio può interferire con immagini successive). Come l'agarosio si solidifica, utilizzare pinze per posizionare l'embrione in modo che sia rivolto verso l'alto KV (vista dorsale) (Figura 1 H). Montare 10 embrioni con un embrione per diapositiva. Lavorare rapidamente per garantire tutte le iniezioni nel passaggio successivo sono completed dalla stadio 10 somite (14 HPF).

4. Iniezione di microsfere fluorescenti in KV

1. Diluire Fluoresbrite Multifuorescent 0,5 micron di diametro Microsfere (Polysciences, Inc.) a 1:50 in acqua sterile in una provetta Eppendorf da 1,5 ml.
2. Mescolare la diluizione 1:50 di microsfere a fondo toccando il tubo e caricare 3 ml in un ago capillare. Utilizzando lo stesso utilizzato per microiniettore MO iniezioni (ad esempio Harvard Apparatus PLI-90 Pico-iniettore), rompere la punta dell'ago con una pinza e regolare le impostazioni di iniezione per generare il più piccolo possibile (<0,5 nl) goccia iniezione.
3. Sotto un microscopio per dissezione, allineare l'ago con il lume KV dell'embrione prima montato. Inserire l'ago nel lume e iniettare una piccola quantità (<0,5 nl) di microsfere (Figura 1G). Un suggerimento piccolo ago e il volume di iniezione piccole sono fondamentali per evitare di danneggiare KV.
4. Iniettare tutti gli embrioni montati. Una volta che un embrione è injected, una goccia di acqua sterile può essere aggiunto in cima al agarosio per evitare che si secchi. Nel corso delle iniezioni, le perline spesso ostruire l'apertura dell'ago. Questo richiede nuovamente rompere la punta dell'ago e la regolazione del volume di iniezione modulando la pressione di taratura o tempo dell'apparato microiniezione. Sostituire l'ago se diventa ottuso sufficiente a causare danni significativi durante l'iniezione.
5. Schermo gli embrioni iniettati per la consegna di successo di perle con un microscopio in posizione verticale composto fluorescente (per esempio Zeiss AxioImager M1) con un obiettivo 20X. In primo luogo, verificare se la struttura KV è intatto con campo chiaro illuminazione (Figura 1J), e quindi utilizzare fluorescenza per osservare le perline. Selezionare embrioni in cui perle sono presenti e lo spostamento all'interno del lume KV. Scartare gli embrioni con danni KV o nessuna perline galleggianti in KV. E 'facile perdere KV e fornire perline per tessuti circostanti o il tuorlo sottostante. In caso di insuccesso, montaggio another 10 embrioni e ripetere la procedura di iniezione.

5. Visualizzazione e analisi di flusso del fluido KV

1. Per ogni embrione selezionato con perline all'interno KV, aggiungere una goccia di acqua sterile per coprire l'agarosio e poi osservare KV al microscopio in posizione verticale composto fluorescente usando un obiettivo 63X acqua immersione (Figura 1I). In alternativa, un vetrino coprioggetto può essere applicata per l'uso con obiettivi immersione non acquosa e / o microscopi invertiti.
2. Utilizzare una telecamera ad alta velocità montata sul microscopio (es. Zeiss AxioCamHSm) per registrare un film di 10 sec. Registrare entrambe le perline utilizzando il canale fluorescente (circa 70 fotogrammi / sec) e il lume KV utilizzando un campo chiaro e contrasto interferenziale differenziale (DIC) canale.
3. Per visualizzare tutti i movimenti del tallone nel corso del tempo, importare il filmato di perline fluorescenti in ImageJ software (scaricabile gratuitamente dal http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) unand creare una sporgenza massima di tutti i segnali fluorescenti nel film. Per eseguire la proiezione massima ImageJ, fare clic su "Immagine → Pile → progetto Z". Nel "Progetto Z" finestra, proiettare tutte le fette con il tipo di proiezione di "intensità Max". Questa immagine può essere sovrapposto un'immagine DIC del KV in cui sono stati ripresi i talloni (Figure 3A-B).
4. I movimenti di perle singoli si possono seguire con ImageJ. Un plugin ("Allineamento manuale") può essere scaricato dal sito http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html . Aprire il film fluorescente perline in ImageJ ed eseguire la funzione di tracking manuale. Nella finestra di Allineamento manuale, controllare i parametri "show" e dei parametri di input per "intervalli di tempo" e "x / y di calibrazione". Selezionare manualmente perle che rimangono nel piano focale del film per ≥ 50 fotogrammi e quindi, di monitorare ≥ 5 perle per embrione. Il percorso e la velocità di ciascuna sfera è generato da the software (figure 3 CD).

Risultati

Fase-specifici iniezioni MO fornire un approccio utile per analizzare la funzione genica in specifici compartimenti dell'embrione. Figura 1 presenta un diagramma di flusso delle strategie di iniezione utilizzato per testare la funzione del gene in DFC / KV cellule e come introdurre perline fluorescenti per visualizzare il flusso del fluido in KV. La distribuzione di MO fluorescente successo in embrioni iniettati fase-specifici è mostrato schematicamente nelle figure 1D-F e in embri...

Discussione

Utilizzo di fase-specifici iniezioni di indirizzare MO al DFC / KV linea cellulare è un approccio utile per lo studio delle cellule-autonomia della funzione del gene e di evitare fenotipi pleiotropici causati da knockdown gene globale. Tuttavia, queste iniezioni possono essere tecnicamente impegnativo. Iniezione di MO tra le fasi 256-cellula e cellula-1000 può portare a tre possibili esiti: 1) la MO rimane aggregati nel sito di iniezione, 2) si diffonde MO tutto il tuorlo ed entra DFC / KV cellule o 3) il MO si diffon...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente / materiale	Azienda	Numero di catalogo
Standard di controllo oligo-lissamina tag	Gene Tools, LLC
Personalizzato Rock2b morfolino oligo	Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0,5 micron Microsfere	Polysciences, Inc.	24054