クッパー胞における遺伝子機能と繊毛発生する流体の流れの可視化の分析

要約

クッパー胞の繊毛で生成された流体の流れ（KV）はゼブラフィッシュ胚の左右パターン形成を制御します。ここでは、KVの細胞に特異的に遺伝子の機能を調節するための手法について説明します。また、流体の流れを可視化するためにKVに蛍光ビーズを提供する方法を示しています。

要約

例えば、心臓、脳、腸などの内臓が正常な機能にとって重要である¹左右（LR）非対称性を開発しています。運動性繊毛はLRの確立に関与しているマウス、カエル、ゼブラフィッシュ^2月6日を含む、脊椎動物の胚の非対称性。これらの'のLR繊毛は'器官^7を開発するためのLRパターニング情報を提供すると考えられている左側側板中胚葉、内カスケードのシグナル伝達に保存された非対称節点（TGF-βスーパーファミリー）をトリガすることが必要である非対称の流体の流れを生成します。このように、LRのパターニングのメカニズムを理解するためには、それはLR繊毛細胞の組織、LRの繊毛の運動性と長さと堅牢な非対称フローを生成する能力を制御する遺伝子を同定することが不可欠である。

ゼブラフィッシュ胚に、LR繊毛でクッパー胞^{（KV）2,4,5}に配置されています。 KVはmonociliated上皮細胞の単層で構成されていますそれは液体で満たされた腔を囲みます。運命のマッピングはKVが被包ステージ^8,9の間に背の胚盤葉縁に移行背先駆細胞（DFCが）として知られている〜20から30細胞群に由来することが示されている。初期の体節の段階では、DFCは、クラスタと繊毛上皮細胞への分化は、胚^10,11の尾芽にKVを形成する。ゼブラフィッシュの光学的透明性と迅速な開発とDFCはインの組み合わせを特定して追跡する能力ゼブラKV LR繊毛細胞を研究するための優れたモデル系胚作る。

興味深いことに、DFC / KV細胞系列の前駆細胞は卵黄細胞と2 HPF ⁸後の近い他の胚細胞の間に細胞質の橋のに対し、最大4時間、受精後（HPF）に卵黄細胞の間に細胞質の橋を保持します。これらの細胞質の橋を生かし、我々は、モルホリノoligonucleを提供するためにステージ固有の注射戦略を策定DFCは、ノックダウン、これらのセル¹²における標的遺伝子の機能にもっぱらotides（MO）。この手法は、遺伝子の機能が野生型胚の文脈で発展DFC / KV系統でノックダウンさせたキメラ胚を作成します。 KVにおける不斉の流体の流れを分析するために、我々は、KVルーメンとビデオ顕微鏡^2を使用^してレコードビーズ運動に蛍光マイクロビーズを注入します。流体の流れを簡単に可視化され、時間をかけてビーズの変位を追跡することにより定​​量することができる。

ここでは、ステージ固有のDFC-標的遺伝子ノックダウン技術と流れを可視化するためのKVへの蛍光ビーズの注入を使用して、我々は、KVの発達と機能の間の特定の遺伝子の役割を特徴付けるための効果的なアプローチを提供するプロトコルを提案する。

プロトコル

ステージ固有のゼブラフィッシュ胚注射の概要

標的mRNAに結合し、その転写物からのタンパク質発現を破壊アンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチド（MO）は、広く研究がゼブラフィッシュ^13,14で（機能喪失型）遺伝子のノックダウンで使用されています。遺伝子ツールは、LLCは、蛍光顕微鏡を用いて注入胚でMOを検出するためにカルボキシフルオレセイン（緑色の蛍光を発する）またはリサミン（赤色蛍光を発する）のいずれかでタグ付けされたMOを提供しています。ゼブラフィッシュの開発のさまざまな段階で卵黄セルにMOを注入することによって、それは、胚の特定の区画（ 図1A-F）にMOを提供するのは可能です。 1から4細胞の段階（0-1 HPF）との間で卵黄に注入されたMOは、グローバルなノックダウンを容易にするために、32細胞期^15日まで存続する卵黄との接続を介してすべての胚細胞（ 図1A、D、D '）に入ります。 MOはmidblast中に卵黄に注入ULAステージは（2.5から3 HPF）他のほとんどの胚細胞系譜を入力せずに、DFC / KV細胞系統¹²に特異的に細胞質の橋⁸およびノックダウン遺伝子機能を通じてそうDFCの前駆細胞（ 図1B、E、E '）を入力することができます。卵黄^12,16でも遺伝子の機能がDFC / KVで必要かどうかをテストしたりするための重要な制御として、それは後にドーム30パーセント被包段（約4.5 HPF）の間に注入することによって、卵黄細胞にMOを制限することもできますすべての細胞質の橋が（ 図1C、F、F '）を閉鎖した。これらの注射はDFC / KV細胞^17から24における遺伝子機能を解析するために組み合わせて使用されている。 KV内の流体の流れを評価するために、蛍光マイクロビーズは6から10体節のステージの間にKVの内腔に注入され（12-14 HPF）、その後すぐにビデオ顕微鏡（ 図1G-J）を用いて画像化。ビーズは赤または緑色蛍光（あるいはその両方）を放出が利用可能であるので、それは別のを使用することが可能である画像蛍光マイクロビーズおよびMOへのチャネル。

1。モルフォのステージ固有のインジェクション（MO）

ゼブラフィッシュ胚にMOの注入は、以前^25,26実証されている。ここでは、簡単にステージ固有のMO注入を説明します。すべての注射後、胚をシャーレに移し、28.5℃でインキュベートした。

1. グローバルMO注入：直ちに受精後の胚を採取し、注入プレートにロードします。キャピラリー針に蛍光MOを読み込み、マイクロインジェクター（ 例えばハーバード装置PLI-90ピコインジェクタ）に針をマウントします。針の先端を破って^25,26に記載され^ているよう^に 1 nlの体積を有する射出ドロップを作成するために注入設定（圧力および/ ​​または時間）を調整します。解剖顕微鏡を使って、卵黄にMOの1 nlを注入する（ 図1A）実験あたり≥50胚の。 4セルクワガタで注射を完了するには、迅速に作業電子。
2. DFC-標的のMO注入：28.5にて直ちに受精後の胚を採取し、インキュベート℃に胚は256細胞期（約2.5 HPF）に達したときに、迅速に注入プレートにそれらをロードします（ 図 256セル、1,000細胞ステージ間≥100胚の卵黄中に蛍光MOの1 nlを注入する1B）。
3. 卵黄ターゲティングMO注入：28.5で受精直後、インキュベートした後に胚を収集℃にドームステージ（〜4 HPF）で、注入プレートに胚をロードしてから、ドームと30％の被包段（ 図1C）の間≥100胚の卵黄に蛍光MOの1 NLを注入します。

2。分析のために注入胚を選択する

1. MOは胚（8 HPF）は75％で被包段階に達する注入すると、蛍光MOの配布のための蛍光解剖顕微鏡下で受精卵と死亡胚を削除してから、画面生きた胚。その後、アロwは28.5で開発するために胚を選択℃を
   1. グローバルMOの注射については、蛍光均等にすべての胚細胞（;図2A図1D）全体に分布している胚を選択します。
   2. DFC-標的ミズーリ注射用、蛍光MOは卵黄に拡散しており、背胞胚マージン（DFCが）（;図2B図1E）に集中して現れる胚を選択します。この段階では、それは、基本的な卵黄で明るい蛍光による蛍光DFCを可視化することが困難な場合があります。蛍光ミズーリにDFC以外の胚細胞に取り込まれたまま、または注射部位（ 図2D）で集計していた胚を除外するように注意してください。
   3. 卵黄をターゲットとしたMOの注射については、ミズーリ蛍光が均一に卵黄全体に分布し、任意の胚細胞（;図2C図1F）で観察されていない胚を選択します。繰り返しになりますが、蛍光MOが残存する胚を取り除く注射部位に集約されます。
2. 2-4-体節ステージ（〜11 HPF）、画面の胚より高い倍率を用いた蛍光顕微鏡下で二回目の間に。次に、選択した胚は28.5で開発することができ℃、
   1. グローバルMOの注射の場合は、選択した胚は、MO蛍光が均等にKVとすべての胚細胞（;図2E図1D '）で配布があることを確認します。
   2. DFC-標的ミズーリ注射については、慎重にのみKV細胞と卵黄（ 図1E '）でMOの蛍光を有する胚を選択します。そのようなTG（Dusp6：d2EGFP）などのKV細胞でGFPを発現するトランスジェニック胚^27は 、ミズーリが正常KV細胞（ 図2F）に配信された胚の識別に役立ちます。 KVの細胞は他の胚細胞のMO蛍光を持つ胚を廃棄します。
   3. 図：卵黄をターゲットとした、MO注入については、卵黄（ 図1F 'で排他的にミズーリ蛍光を有する胚を選択する2G）。

3。 KV内の流体の流れを分析するために取り付けた胚

1. グローバルMOのKVで非対称流体の流れを分析するには、MOまたは卵黄ターゲティングMO注入胚をDFCはターゲティング、慎重dechorionate〜鋭いピンセットで4から6体節段階（〜11月12日HPF）との間に20胚。
2. 42℃で乾燥したお風呂で液体として維持するための5 mlチューブ℃に1％低融点アガロースとアリコート50mlを準備
3. ガラスうつ病スライド（米国科学用品株式会社）への転送1つの胚と多くの水の可能な限り除去する。ただ（あまりアガロースがその後の画像に干渉することができます）胚をカバーするのに十分な暖かい1％低融点アガロースを追加することで、胚を固定。アガロースが固まるように、そのようなそのKVは（ 図1H）（背側）を向いている胚を配置するためにピンセットを使用しています。スライドごとに1つの胚で10胚をマウントします。次のステップで、すべての注射はCOMPLであることを確認するために迅速に働く10体節期（14 HPF）によりeted。

4。 KVに蛍光マイクロビーズの注射

1. 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに滅菌水で1:50にMultifuorescent 0.5ミクロン径の微小球を（ポリサイエンス社）Fluoresbrite希釈します。
2. チューブをタップして、徹底的にマイクロビーズの1:50希釈液を混合し、キャピラリーニードルに3μlをロードします。ミズーリ注射（ 例えばハーバード装置PLI-90ピコインジェクタ）に使用されるのと同じマイクロインジェクターを使用して、ピンセットで針の先端を破って、可能な限り小さい（<0.5 NL）注射降下を生成するために注射の設定を調整します。
3. 解剖顕微鏡下では、最初にマウント胚のKVのルーメンと針の位置を合わせます。内腔に針を挿入し、ビーズの少量（<0.5 NL）（ 図1G）を注入。小さな針の先端と小さな注入量は、有害KVを避けるために重要です。
4. マウントされているすべての胚を注入します。胚はinjecteされたらdは、滅菌水の滴が乾燥からそれを防ぐためにアガロースの上に追加することができます。注射の過程で、ビーズはしばしば針の開口部をふさがれます。これは、針の先端を再分割することと、マイクロインジェクション装​​置の調節圧力または時間設定によって注入量を調整する必要があります。それは注射中に重大な損傷を引き起こすのに十分な鈍になった場合に、針を交換してください。
5. 画面直立蛍光化合物顕微鏡（ 例えばツァイスAxioImager M1）の下にビーズの正常な配信のために注入された胚は、20X対物レンズを使用。まず、KVの構造が明視野照明を（ 図1J）を使用して、無傷であるかどうかを判断し、次にビーズを観察する蛍光を使用します。ビーズが存在し、KVのルーメン内を移動させた胚を選択します。 KVの損傷やKVでないフローティングビーズと共に胚を破棄します。それはKVを逃すと周辺組織または基礎卵黄にビーズを送達するために簡単です。失敗した場合、マウントあの熱10胚および注入手順を繰り返します。

5。 KVの流体の流れの可視化と分析

1. KVの内側にビーズと、選択した各胚については、アガロースをカバーし、その後63X水浸対物レンズ（ 図1I）を使用して、直立蛍光化合物の顕微鏡下でKVを観察するために滅菌水の滴を追加します。あるいは、カバースリップは非水浸漬の目的および/または倒立顕微鏡で使用するために適用することができます。
2. 10秒の動画を撮影するために（ 例えばツァイスAxioCamHSm）顕微鏡に搭載されたハイスピードカメラを使用しています。明または微分干渉コントラスト（DIC）チャネルを用いた蛍光チャネル（約70フレーム/秒）とKVの内腔を用いてビーズの両方を記録します。
3. 時間をかけてすべてのビーズの動きを可視化するために、ImageJのソフトウェア（無償でダウンロード中に蛍光ビーズのムービーを読み込むhttp://rsb.info.nih.gov/ij/ ）ndはムービー内のすべての蛍光シグナルの最大投影を作成します。 ImageJの中で最大の投影を実行するには、クリックして "イメージ→スタック→Zプロジェクトを。" "Zプロジェクト"ウィンドウで、 "最大輝度"の投影タイプを持つすべてのスライスを投影。この画像は、ビーズが撮像されたKV（ 図3A-B）のDIC像に重ね合わせることができます。
4. 個々のビーズの動きはImageJを使用して追跡することができます。プラグイン（ "マニュアルトラッキング"）でダウンロードすることができますhttp://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html 。 ImageJの中に蛍光ビーズムービーを開き、マニュアルトラッキング機能を実行します。マニュアルトラッキングのウィンドウで、 "時間間隔"と "x / yのキャリブレーション"の "ショーパラメータ"と入力パラメータを確認してください。手動≥50フレームの映画の焦点面に残っているビーズを選択してから、胚あたり≥5ビーズを追跡します。各ビーズのパスと速度は目によって生成されeソフトウェア（ 図3 CD）。

結果

ステージ固有のMO注入胚の特定区画における遺伝子機能を解析する上で有効なアプローチを提供します。 図1は、DFC / KV細胞における遺伝子機能をテストするために、流体の流れを可視化する蛍光ビーズを導入する方法使用済みの注射戦略のフローチャートを提示KVインチ成功した段階特異注入胚の蛍光MOの分布は、 図1D-Fに、 図2でライブ胚における模式?...

ディスカッション

DFC / KV細胞系譜にMOをターゲットにステージ固有の注射を使用すると、遺伝子機能の細胞自律性を検討し、全体的な遺伝子ノックダウンによって引き起こされる多面的な表現型を回避するための有用なアプローチである。しかし、これらの注射は技術的に挑戦することができます。 1）MOは卵黄全体2）MOの拡散、注射部位で集計ままおよびDFC / KVセルまたは3に入る）MO：256セル、1,000細胞ステー...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/材料の名称	会社	カタログ番号
標準コントロールオリゴリサミンタグ付け	遺伝子ツール、LLC
カスタムRock2bモルホリノオリゴ	遺伝子ツール、LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5ミクロンのマイクロスフェア	ポリサイエンス社	24054