Inmunofluorescencia y FISH Combinado de ADN en 3D conservados núcleos en interfase para estudiar los cambios en la organización nuclear 3D

Resumen

Aquí se describe un protocolo para la detección simultánea de las modificaciones de histonas por secuencias de ADN de inmunofluorescencia y por FISH de ADN seguido por microscopía 3D y análisis (3D inmuno-ADN FISH).

Resumen

La hibridación fluorescente in situ con sondas de ADN sobre el 3-dimensional núcleos conservan seguido por microscopía confocal 3D (3D FISH AND) representa la forma más directa para visualizar la localización de loci de genes, cromosomas sub-regiones o territorios enteros en celdas individuales. Este tipo de análisis permite conocer la arquitectura global del núcleo, así como el comportamiento de los loci genómicos y regiones específicas dentro del espacio nuclear. Inmunofluorescencia, por otro lado, permite la detección de proteínas nucleares (histonas modificadas, variantes de histonas y modificadores, maquinaria de transcripción y factores nucleares, sub-compartimientos, etc.) El principal reto en la combinación de ADN FISH inmunofluorescencia y 3D es, por un lado, para preservar el epítopo detectados por el anticuerpo, así como la arquitectura 3D del núcleo, y por otra parte, para permitir la penetración de la sonda de ADN para detectar loci de genes o cromosomas territorios ^1-5. A continuación presentamos un protocolo que combina la visualización de las modificaciones de la cromatina con loci genómicos en los núcleos 3D conserva.

Introducción

Epigenética establecimiento de mecanismos de disparo y la herencia de desarrollo y el tipo de células perfiles de transcripción específicos. Por un lado se trata de la modulación de la cromatina embalaje que define regiones genómicas activas o en silencio. En una escala mayor, la organización global de 3D del genoma nuclear y de la arquitectura también desempeñar un papel en el control de los patrones transcripcionales. Por lo tanto, la disección de estas características epigenomic es esencial para una comprensión completa de cómo se regulan los genes ^6-11.

FISH Combinado de ADN de inmunofluorescencia y 3D ofrecen una oportunidad única para complementar los análisis moleculares y bioquímicos mediante la evaluación de las interacciones específicas / asociaciones de secuencias de ADN y / o proteínas en el núcleo. Por otra parte, mientras que en todo el genoma técnicas de alto rendimiento, tales como cromatina immunoprecipitation (CHIP-seq) o conformación cromosoma captura junto con la secuenciación profunda (4C-seq, 5C, Hi-C) ofrecen dat mundialuna en ¹² poblaciones celulares, inmunofluorescencia / ADN técnicas de FISH permitir el análisis a nivel de células individuales.

Aquí se describe un protocolo para la detección simultánea de modificaciones de las histonas por secuencias de ADN de inmunofluorescencia y por FISH ADN seguido por microscopía y análisis 3D (3D inmuno-FISH). La ventaja de este protocolo es la visualización combinada de ADN y la preservación de las estructuras proteicas. Nuestra experiencia en este campo nos ha permitido mejorar y simplificar los protocolos existentes. Aunque hemos utilizado este protocolo para detectar ADN de doble cadena se rompe en los linfocitos sometidos a recombinación, este método se puede aplicar a otras proteínas y otros tipos de células.

Protocolo

1. Etiquetado de ADN Probe con fluoróforos: Nick Translation (~ 6 horas)

1. Clean BAC ADN (preparado por maxi-prep) o plásmidos o productos de PCR, todos resuspendió en H ₂ O, se puede utilizar para el etiquetado. Tenga en cuenta que para una señal de FISH robusto, sondas deberían abarcar al menos 10 kb.
2. Incubar ADN en RNasa A durante 30 min a 37 ° C (Todos los reactivos se enumeran en la Tabla 1).
3. Incubar la reacción de traducción nick durante 2 horas a 16 ° C (véanse los cuadros 2 y 3). Los métodos alternativos de etiquetado directo puede ser utilizado (Ejemplo: Etiqueta FISH, Invitrogen).
4. Inactivar la reacción durante una hora a -80 ° C o durante la noche a -20 ° C.
5. Determinar el tamaño de la sonda en un 2% de gel de agarosa. La prueba debe ser de entre 100 y 1.000 pares de bases, con la mayoría en aproximadamente 300-500 pb (Tenga en cuenta que la mancha de Cy5 sondas no es visible). Si el ADN no se digiere suficiente, más ADN Pol I yDNasa I se puede añadir a la reacción y se incubaron durante dos horas más a 16 ° C.
6. Purificar sondas en filtros 0,025 mm en dos vasos de precipitados litro llenos de H ₂ 0 durante dos horas en la oscuridad.
7. Añadir factores de bloqueo para las sondas de la siguiente manera: 10 g de ADN Cot-1, 10 g de ADN Hybloc y 100 g de esperma de salmón de 10 g de sondas de ADN. Sondas de ADN Tienda a -20 ° C.

2. Probe Precipitación / desnaturalización / hibridación Pre-(hr 3-4)

1. Entre 0,3 mg y 1 g de sonda de ADN se utiliza por cubreobjetos. Las sondas se mezclan con 0,1 volumen de NaAc 3M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%, incubar durante una hora a -80 ° C o durante la noche a -20 ° C y centrifugar a 13.000 rpm a 4 ° C durante 30 min. Tenga en cuenta que la cantidad de sonda de ADN puede ser ajustada dependiendo de la calidad del ADN y la región nuclear de la hibridación. Los métodos alternativos de etiquetado directo puede permitir el uso de cantidades reducidas desonda. Para la detección de múltiples señales de ADN de FISH en una diapositiva, las diferentes sondas pueden precipitarse juntos (excepto sondas que no deberían estar pre-recocido, como secuencias de repetición). Las sondas para varios experimentos realizados al mismo tiempo también se puede precipitar juntos. Pellets debe ser ligeramente coloreado de acuerdo con los fluoróforos utilizados (en caso de pequeñas cantidades de sondas se precipitan, el precipitado puede no ser visible).
2. Pellets secos y resuspender ellos en 15 l de tampón de hibridación (véase la Tabla 4) por cubreobjetos con agitación (usando un termomezclador Eppendorf) en la oscuridad a 37-45 ° C (aproximadamente 20 min).
3. Sondas desnaturalizan durante 5 minutos a 75-95 ° C.
4. Pre-recocido de sondas a 37 º C durante 30-60 min. Longitud de pre-recocido puede ser ajustada dependiendo de la complejidad y la calidad de las sondas.
5. Aplicar las sondas a los cubreobjetos para la hibridación durante la noche (véase la Sección 3).

3. 3Tridimensional del ADN FISH - Primer día (~ 3 h)

1. Las células no adherentes se concentran en un pequeño volumen de PBS 1x (~ 2x10 ⁵ células en 5-10 l de PBS 1x por cubreobjeto) y se dejó caer sobre el centro de un cubreobjetos recubierto con poli-L-lisina. Las células adherentes se cultivaron en cubreobjetos durante al menos 24 horas (confluencia ~ 70%) (cubreobjetos se pueden recubrir con gelatina 0,1%). Cuadrados 18x18 a 24-24 mm cubreobjetos se colocan en placas de 6 pocillos, y durante todo el protocolo, dos ml de cada solución se utiliza por pocillo (alternativamente redondas 1,5 mm cubreobjetos se pueden colocar en placas 12/24-well).
2. Fijar las células en 2% de paraformaldehído / PBS 1x, pH 7-7.4, durante 10 min a TA (4% PFA existencias puede alícuotas, se almacenó a -20 ° C). El paraformaldehído se pueden comprar en solución (16%), o 4% soluciones madre se puede preparar a partir de polvo / gránulos. Paraformaldehído en polvo se disuelve en 1x PBS a> 60 ° C (pH puede aumentarse a 8.9 para facilitar la disolución), enfriado en hielo, ajustared a pH 7-7.4, se filtró, alícuotas de halcones y almacenados durante semanas a -20 ° C.
3. Después de tres enjuagues en PBS 1x, permeabilizar las células en hielo enfriado con 0,4% Triton-X-100/1 x PBS durante 5 min en hielo. Longitud de permeabilización puede ajustarse dependiendo de la célula de tipo NB:. Si FISH de ADN se combina con la inmunofluorescencia, la inmunotinción se debe realizar en esta etapa (véase la Sección 4).
4. Después de tres enjuagues en 1x PBS, las células se incuban con 0,1 g / l de RNasa A en 1x PBS durante una hora a 37 ° C. Los cubreobjetos se colocan células hacia abajo sobre una gota de 100 l de solución en parafilm o un portaobjetos en una cámara húmeda. Los cubreobjetos son entonces cuidadosamente con fórceps. Si alguno se encuentra resistencia, los cubreobjetos se inundó con 1x PBS con el fin de evitar daños en las células.
5. Después de tres enjuagues en PBS 1x, permeabilizar las células en hielo enfriado con 0,7% Triton-X-100 HCl / 0,1 M durante 10 min en hielo.
6. Después de tres lavados in 1x PBS, las células desnaturalizan en 1,9 M HCl durante 30 min a TA. Alternativamente, las células pueden ser desnaturalizados en formamida / SSC 2x 50% a 75-80 ° C durante al menos 30 min. Cuenta que la longitud de hibridación (y la temperatura) puede ser optimizada en función del tipo de célula.
7. Después de tres enjuagues en hielo frío 1x PBS, las células se hibridan con sondas durante la noche a 37 ° C en una cámara oscura y húmeda. Los cubreobjetos se colocan celda hacia abajo en una caída de 15 l de la sonda en un portaobjetos, y se sella con cemento de goma.

4. 3-dimensional Immuno-FISH - First Day (~ 6-7 h)

1. Para combinar inmunofluorescencia / ADN FISH, inmuno-tinción debe realizarse después de la permeabilización en el 0,4% de Triton-X-100 (Paso 3,3).
2. Se incuban las células en solución de bloqueo durante 30 min a TA (2,5% albúmina de suero bovino (BSA), 10% de suero de cabra normal, 0,1% de Tween-20). La solución de bloqueo se filtra, se dividió en alícuotas en Eppendorfs 1,5 ml y se almacenó para meses a -20 ° C.
3. Se incuban las células con el anticuerpo primario contra la proteína o la modificación de las histonas de interés diluido en solución de bloqueo, durante una hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda. Aquí se muestra el ejemplo de un anticuerpo contra fosforilados serina-139 de H2AX (γ-H2AX, Millipore, Ver Tabla 5 para más detalles). Los cubreobjetos se colocan células hacia abajo sobre una gota de 100 l de solución en parafilm o un portaobjetos en una cámara húmeda. Los cubreobjetos son entonces cuidadosamente con fórceps (inundado con 1x PBS si es necesario). Nota que la dilución y la duración de la incubación puede ser ajustado dependiendo de la calidad de los anticuerpos y de células tipos.
4. Lavar las células en 0,2% BSA / 0,1% Tween-20 / 1x PBS, tres veces 5 min a TA con agitación.
5. Se incuban las células con el apropiado fluoróforo conjugado con anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo durante una hora a RT en una cámara oscura y húmeda. Aquí se muestra un ejemplo de detección con unsecundario de cabra anti-ratón de anticuerpos (Alexa Fluor 488 o 555, Invitrogen; Ver Tabla 5 para más detalles). Hapteno conjugado con anticuerpos secundarios (biotina, digoxigenina, etc) también podría ser utilizado. En este caso, un paso adicional para la detección apropiado (estreptavidina, anti-dig, etc) se puede realizar ya sea antes o después de ADN-FISH hibridación durante la noche.
6. Enjuagar las células en 0,1% de Tween-20 / 1x PBS, tres veces 5 min a TA con agitación en la oscuridad.
7. Post-fix células en 2% de paraformaldehído / PBS 1x durante 10 min a TA en la oscuridad.
8. Continuar FISH ADN como anteriormente a partir de la incubación en RNasa A (Paso 3,4).

5. 3-dimensional de ADN FISH / Immuno-FISH - Segundo día (~ 2 h)

1. Retire con cuidado el cemento de goma, cubreobjetos de inundación con 2x SSC, retire con cuidado con unas pinzas y colóquelos en los pocillos con solución de lavado.
2. Lavar las células en 2x SSC durante 30 minutos a 37 ° C en la oscuridad con agitación.
3. Lavar las células en 2x SSC durante 30 min a TA en la oscuridad con agitación.
4. Lavar las células en 1x SSC durante 30 min a TA en la oscuridad con agitación Tenga en cuenta que en caso de desnaturalización con formamida, lavados debe ser sustituido por el siguiente:. 3 lavados en lavados de 50% de formamida / SSC 2x y 3 en 2x SSC, 5 minutos cada uno, a 37 º C.
5. Montar las células en ProLong oro medio de montaje que contiene 1,5 mg / ml DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) para la contratinción de ADN total. Los cubreobjetos se colocan células hacia abajo sobre una gota de 10-15 l de medio de montaje en un portaobjetos y se sellaron con esmalte de uñas. Las diapositivas se mantuvo durante meses a -20 ° C.

6. Microscopia y Análisis de 3D

1. Imágenes 3D pueden ser adquiridos con los sistemas de microscopios. En nuestros experimentos, las secciones ópticas separadas por 0,3 micras se recogen en un sistema Leica SP5 AOBS confocal (acústico-óptico divisor de haz). Tenga en cuenta que la separación entre Optical planos se pueden ajustar dependiendo del tipo de análisis.
2. Pilas de imágenes 3D se pueden analizar usando software diferente y herramientas. Usamos el software Image J para evaluar las mediciones de distancia entre loci de interés y analizar diferentes tipos de asociación de los lugares de interés con los sub-compartimientos nucleares o proteínas.
3. Todos los análisis estadísticos se realizaron para comparar dos (o más) diferentes condiciones biológicas con pairwise evaluación (s) de significación: Comparación entre diferentes tipos de células o fases, la comparación entre los diferentes loci de interés. En todas las pruebas estadísticas, los valores de p ≤ 5.00e-2 (a = 0,05) se considera que son significativos (1,00 E-2 ≤ P ≤ 5.00e-2 * significativo; 1,00 E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * muy significativa, p <1,00 E-3 *** altamente significativo).

El análisis estadístico de las distribuciones de enteros de las distancias entre los dos alelos. Hemos primera construct acumulativos curvas de distribución de frecuencias en toda la gama de distancias medidas entre el alleles.To NAEP la significación de las diferencias en las distribuciones empíricas de inter-alélicas distancias que usamos la prueba no paramétrica de dos muestras de Kolmogorov-Smirnov (KS) prueba de ^13,14.

El análisis estadístico de una estrecha asociación (es decir, el emparejamiento) de dos alelos con una distancia óptima de corte. Identificar el rango de la mayoría de las diferencias robustas en las distancias entre dos alelos o loci, utilizamos una serie de ¹⁵ dos colas prueba exacta de Fisher s. Es decir, en cada distancia medida se prueba si una condición es significativamente más representadas en distancias más cortas entre las dos muestras. El mínimo en la distribución de los valores P indica la gama de distancias que deben ser considerados como un límite para cerrar asociación (es decir, emparejamiento) de los dos alelos. Posteriormente, la prueba de dos colas exacta de Fisher se utiliza to evaluar la importancia de emparejamiento de dos alelos en el identificada valor de corte ^15. Correcciones de prueba múltiples se aplica a la cuenta para el número total de pruebas de Fisher realizó ^16.

El análisis estadístico de la asociación del locus de interés con sub-compartimentos nucleares o proteínas. La prueba de dos colas de Fisher-exacta se utiliza para analizar la significación de la asociación del locus de interés con diferentes compartimentos o proteínas ^15.

Resultados

ADN y la inmuno-FISH se utilizan en el laboratorio Skok para estudiar los cambios en la organización nuclear asociados con el proceso de V (D) J recombinación de loci receptores de antígenos durante el desarrollo de linfocitos B y T. Las técnicas detalladas anteriormente nos permiten i) medir distancias entre los dos extremos de un locus (contracción) ii) medir distancias entre los alelos o loci (emparejamiento), iii) analizar el daño del ADN que ocurre dentro de loci, iv) evaluar la ubicación de los alelos y en ...

Discusión

Las técnicas detalladas anteriormente se han utilizado en nuestro laboratorio para analizar la regulación de V (D) J recombinación de la inmunoglobulina y loci TCRA / d en el desarrollo de los linfocitos ^30,31. Estamos seguros de que esta técnica se puede adaptar para la detección de varias proteínas nucleares, compartimentos nucleares y los loci, en diferentes tipos de células. Las modificaciones del protocolo puede ser necesaria, y en este caso los pasos principales de enfocar son l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo / material	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
H 2 O	Pescador	# BP2470
RNasa A	Sigma	# R4642
dNTP	Sigma	# DNTP100
Alexa dUTP	Invitrogen	# C11397 a C-11401
Cy3 o Cy5 dUTP	Pescador	º 45-001-xxx
DNasa I	Roche	# 04536282001
ADN Pol I	Biolabs	# M0209
0,025 micras filtros	Millipore	# VSWP02500
Cot-1 DNA 1 mg / ml	Invitrogen	# 18440
Hybloc ADN 1 mg / ml	Genética Aplicada	# MHB
De esperma de salmón	Sigma	# D1626	polvo que se volvieron a suspender a 10 mg / ml en H 2 O
NaAc (acetato de sodio, pH 5,2, solución tampón)	Sigma	# S7899
Ficoll 400 (Mol Biol. grado)	Pescador	# 525
Polivinilpirrolidona (Mol Biol. grado)	Pescador	# BP431
Polvo de sulfato de dextrano	Sigma	# D8906
SSPE (solución salina fosfato de sodio-EDTA) 20x solución	Pescador	# BP1328
Formamida	Pescador	# BP227
Cubreobjetos	Pescador	# 12-548-B
Diapositivas	Pescador	# 12-550
6-y las placas	Pescador	# 0720080
PBS, 10x	Pescador	# MT-46-013-CM
Poli-L-lisina	Sigma	# P8920
Paraformaldehído, gránulos, 95%	Sigma	# 441244
Triton-X-100, Mol Biol. grado	Sigma	# T8787
BSA (albúmina de suero bovino) fracción V	Pescador	# BP 1600
Suero normal de cabra	Vector Labs	# S-1000
Tween-20, Mol Biol. grado	Sigma	# P9416
SSC (citrato sódico salino) 20x solución	Pescador	# BP1325
Prolongar reactivo Antifade Oro	Invitrogen	# P36930
DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol)	Sigma	# D9542
Mejor prueba de una capa de cemento de goma	Arte o tiendas de suministros de oficina
			Tabla 1. Reactivos específicos y pequeños equipos.