In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

Resumen

La experiencia-dependientes cambios moleculares en las neuronas son esenciales para la capacidad del cerebro para adaptarse en respuesta a problemas de comportamiento. Un In vivo De dos fotones método de formación de imágenes se describe aquí que permite el seguimiento de dichos cambios moleculares en las neuronas corticales individuales a través de la prensa codificados genéticamente.

Resumen

La capacidad del cerebro para cambiar en respuesta a la experiencia es esencial para la función cerebral sano, y anormalidades en este proceso de contribuir a una variedad de trastornos del cerebro ^1,2. Para comprender mejor los mecanismos por los que los circuitos cerebrales reaccionan a la experiencia de un animal requiere la capacidad de monitorizar los cambios moleculares que dependen de la experiencia en un determinado conjunto de neuronas, durante un período de tiempo prolongado, en el animal vivo. Si bien la experiencia y de la actividad neural asociada se sabe para accionar los cambios de expresión génica en neuronas ^{1,2, la} mayoría de los métodos para detectar tales cambios no permiten la observación repetida de las mismas neuronas más de varios días o no tienen suficiente resolución para observar las neuronas individuales ^{3 , 4.} Aquí se describe un método que combina en dos fotones microscopía in vivo con un reportero codificado genéticamente fluorescente para rastrear dependientes experiencia-cambios de expresión génica en las neuronas corticales individuales sobre la curso de la experiencia día a día.

Uno de los bien establecidos que dependen de la experiencia de los genes es la actividad regulada citoesqueleto proteínas asociadas (Arc) ^5,6. La transcripción de Arco es rápida y altamente inducida por la intensificación de la actividad neuronal ^3, y su producto de proteína regula la endocitosis de los receptores de glutamato y largo plazo plasticidad sináptica ^7. La expresión de Arco ha sido ampliamente utilizado como un marcador molecular para asignar circuitos neuronales implicados en comportamientos específicos ^3. En la mayoría de estos estudios, la expresión Arc se detectó mediante hibridación in situ o inmunohistoquímica en secciones de cerebro fijos. Aunque estos métodos reveló que la expresión de Arco fue localizado en un subconjunto de neuronas excitadoras después de experiencia de comportamiento, cómo los patrones celulares de expresión Arc podría cambiar con episodios múltiples de experiencias repetidas o distintivo más días no fue investigado. ntent "> In vivo de dos fotones microscopía ofrece una poderosa manera de examinar la experiencia-dependientes cambios celulares en el cerebro de los vivos ^8,9. Para habilitar el examen de expresión Arco en neuronas vivas por microscopía de dos fotones, hemos generado previamente un golpe- en línea de ratón en el que un reportero GFP se pone bajo el control del promotor endógeno del arco ^10. Este protocolo describe las preparaciones quirúrgicas y procedimientos de formación de imágenes para el seguimiento dependientes experiencia-GFP Arc-patrones de expresión en conjuntos neuronales en el animal vivo. En este método , crónicas ventanas craneales se implantaron primero en ratones GFP Arc-en las regiones corticales de interés. Estos animales fueron entonces repetidamente fotografiada por dos fotones microscopía después de paradigmas de comportamiento deseadas en el transcurso de varios días. Este método puede ser aplicable en general a animales portadores otros reporteros fluorescentes de experiencia-dependientes cambios moleculares ^4.

Protocolo

Los procedimientos experimentales se describen a continuación fueron aprobados por el Instituto Nacional de la Atención Mental de Salud Animal y el empleo y estaban de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Pre-operatorio Preparación

1. Limpie todas las herramientas en un esterilizador caliente cordón antes de la cirugía aséptica, limpie el sitio de la cirugía con un 70% de etanol, y poner paños limpios gota. Use guantes estériles. Se anestesia el animal recién preparada con 1,2% de solución de avertina, dado a 0,02 ml / g, intraperitonealmente. Alternativamente, anestesiar con gas isoflurano a través de un cono nasal, 5% para la inducción, 1,5% para el mantenimiento, con un circuito eliminador pasiva. Compruebe el nivel de anestesia con pizcas de cola o del pie para asegurarse de sedación total.
2. Cubrir los ojos del animal con ungüento oftálmico estéril, y se inyecta dexametasona recién preparada (0,2 mg / kg) y carprofeno (5 mg / kg) subcutaneously para prevenir la hinchazón y la inflamación cerebral ^11. Afeitar el pelo sobre el cráneo entre las orejas, y esterilizar la piel con matorrales betadine y tres hisopos alternos de 70% de etanol.
3. Montar el animal en una etapa de la cirugía estereotáxica con earbars, con una almohadilla de calentamiento de agua de circulación a continuación el conjunto de los animales a 37 ° C. Compruebe regularmente los niveles de anestesia del animal, así como complementar el original dosis de anestesia según sea necesario.
4. Inyectar 200 l de bupivacaína al 0,5% debajo de la piel del cuero cabelludo para adormecer el área. Incisión de la piel y eliminar el colgajo de piel sobre el cráneo. Retire el periostio y seque el área con hisopos de algodón limpios.

2. Cirugía crónica ventana craneal

1. Use un taladro dental de alta velocidad con una fresa de 0,5 mm para delinear suavemente un círculo 3-5 mm de diámetro en la región cerebral de interés. Periódicamente humedecer el sitio de perforación con polvo estéril al 0,9% de solución salina y hueso clara distancia con hisopos de algodón limpios. Si los sangrados de hueso, utilizar gelfoam remojados previamente con solución salina estéril para secar la hemorragia y esperar a que se detenga.
2. Cuando la capa de hueso se llega al último, levante y retire la isla hueso con unas pinzas de punta fina. Dura adjuntos a la plataforma inferior del hueso se pueden encontrar si la ventana cruza una sutura ósea. Éstos se deben retirar suavemente el colgajo óseo se levanta.
3. Rollo de espuma de gel humedecido suavemente sobre la duramadre expuesta a limpiar su superficie y esperar a que el sangrado dural dejar paso crítico:. No continúe hasta que la hemorragia se ha detenido dural. La sangre que queda atrapada en el interior de la ventana craneal usualmente lleva a una ventana opaca.
4. Si la región de interés está bajo un lugar donde la duramadre es particularmente gruesa, la eliminación de la duramadre por encima puede ser necesario. Si este es el caso, separar suavemente la dura desde la pia abajo con pinzas muy finas, realizar una pequeña incisión en la duramadre levantado con otro par de pinzas finas, a continuación, sujete los bordes de corte y suavementedividir la duramadre. La duramadre es delgada pero fuerte, así que ten cuidado de no cortar el cerebro con los bordes intactos de la duramadre.
5. Enjuague el área con ACSF estéril o solución salina estéril.
6. Coloque un cubreobjetos de vidrio estéril (3-5 mm) a lo largo de la duramadre o pia paso crítico:. Si las curvas del cráneo que rodean de manera significativa, el uso Kwiksil adhesivo ¹² para llenar los espacios donde la dura o pia no hacen contacto con el cubreobjetos en regiones que no se va a examinar.
7. El uso de gel de cianoacrilato para cubrir el adhesivo elastómero y los bordes del cubreobjetos de vidrio. Cubrir el cráneo expuesto con toda gel de cianoacrilato, o una mezcla de cemento y krazyglue dental paso crítico:. No permita que el gel de cianoacrilato para tocar la superficie del cerebro.
8. Insertar una medida cabeza de metal barra de sujeción en el extremo opuesto del cráneo.
9. Volver al animal a una cámara de recuperación caliente, después de una inyección intraperitoneal de ketoprofeno, 5 mg / kg, for el manejo del dolor. Continuar con el analgésico durante dos días más después de la operación.
10. Después de dos semanas de recuperación post-operatoria, anestesiar al animal con isoflurano (5% para la inducción, 1,5% para mantenimiento), montarlo en una platina del microscopio a medida con un marco de fijación de cabeza, y marque la ventana craneal para la claridad óptica bajo iluminación con luz azul. Superficie hematoencefálica claridad recipiente es altamente indicativo de la calidad de ventana craneal. Si los bordes de los vasos sanguíneos están claramente definidos, la ventana es probable que sea utilizable. El dos semanas después de la operación el tiempo de recuperación se recomienda para permitir tiempo suficiente para que el animal pueda recuperarse de la cirugía. Ventanas craneales típicamente limpiar y mejorar durante este tiempo, y siendo ópticamente transparente para semanas adicionales a mes hasta rebrote de cráneo o engrosamiento de la duramadre degrada la calidad de ventana.

3. Protocolo del comportamiento y de escaneo láser de dos fotones microscopía

1. Los animales con clara cventanas ranial estará expuesto a un estímulo ambiental o sometidos a una sesión de entrenamiento del comportamiento, y luego fotografiada después en el momento de máxima Arc-GFP expresión. Antes de iniciar un protocolo de comportamiento, el animal deberá ser mantenido en un entorno doméstico jaula consistente para minimizar día a día variación en los niveles basales de expresión de GFP-Arc.
2. Comenzar el entrenamiento conductual o paradigmas ambientales de estimulación, en función de la región cerebral de interés. Por ejemplo, los animales pueden ser expuestos a diferentes ambientes visuales en días consecutivos, y fotografiado cada día después de la estimulación visual para identificar específicos de estímulo-respuesta en la corteza visual ^10.
3. Arc-GFP fluorescencia en las neuronas normalmente alcanza su nivel máximo dos horas después de la estimulación. La línea de tiempo experimental puede ser optimizado para facilitar la detección de la expresión Arc-GFP en las neuronas en sus niveles pico de fluorescencia.
4. Después de una sesión de entrenamiento conductual o environmental estimulación se completa, anestesiar al animal con isoflurano (5% para la inducción, 1,5% para el mantenimiento) y montar el animal en la platina del microscopio a medida con bastidor de la cabeza de fijación bajo el microscopio de dos fotones.
5. La posición de la cabeza del animal se fija al bastidor de la cabeza de fijación que se conecta directamente a la etapa, con la barra de metal implantado en el cráneo. El isoflurano y oxígeno se suministran continuamente al ratón a través de un cono nasal. La temperatura corporal se mantiene utilizando una almohadilla térmica.
6. Asegúrese de que los detectores de microscopio están protegidos de la luz ambiente mediante la realización de dos fotones de láser de barrido en una habitación oscura. Utilice un objetivo de inmersión en agua 20x o 25x (1,05 apertura numérica) para formación de imágenes. En primer lugar, en virtud de epi-fluorescencia iluminación, adquirir una imagen de los patrones de los vasos sanguíneos superficiales más de la región del cerebro de interés con una cámara CCD para la alineación de la imagen en el futuro.
7. Iniciar la de dos fotones de exploración por láser para adquirir una pila de imágenes en 3-D. Una Olympus FV1000MPE multi-fotón microscopio se utiliza en nuestra configuración. La excitación de longitud de onda del láser de dos fotones se ha fijado en 920 nm, y la potencia del láser emitido desde el objetivo se fija a aproximadamente 50 mW. Fluorescencia emitida se detecta simultáneamente en los canales verde y rojo (espejo dicroico a 570 nm, filtros de barrera a 495-540 nm y 570-625 nm), utilizando un externo de dos canales sistema de detección photomutiplier colocado cerca de la muestra. Arc-GFP fluorescencia sólo aparece en el canal verde, mientras que el tejido auto-fluorescencia aparece tanto en los canales ^{13, 14.}
8. Pilas típicas imágenes tienen dimensiones de aproximadamente 320x320x100 m (largo x ancho x profundidad), una resolución horizontal de 0,5 m / pixel, y una resolución vertical de 3 m / pixel.
9. Después de adquirir la pila de imágenes, devolver el animal a su jaula. No moleste a los animales hasta la próxima sesión de imágenes y de comportamiento. Repita el comportamiento y el procedimiento de imagen a través de días como desired. Utilice la superficie previamente adquirido hematoencefálica imagen buque para orientar a la ubicación de imágenes iguales.

Resultados

Este protocolo describe un método para rastrear dependientes experiencia-cambios moleculares en las neuronas corticales individuales en los animales vivos. Una ventana craneal crónica se crea por primera vez en una región cortical de interés en un ratón que lleva un indicador fluorescente de la expresión génica. Microscopía de dos fotones se puede acoplar con varios paradigmas de comportamiento para observar su comportamiento inducidos cambios moleculares en las neuronas individuales y rastrear tales cambi...

Discusión

El método de obtención de imágenes in vivo descrito aquí permite el examen repetido de los cambios de expresión génica en Arco los mismos conjuntos de neuronas durante varios días en el animal vivo. Es un método eficiente y versátil para obtener información acerca de la plasticidad neuronal relacionada-dinámica molecular en neuronas individuales en respuesta a diversas experiencias de comportamiento. Estándar métodos histoquímicos tales como la hibridación in situ y la inmunotinción se ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del Equipo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
FV1000 multi-fotón microscopio de barrido láser	Olimpo	FV1000MPE	Proyección de imagen
Disección microscopio	Omano	555V107	Cirugía
Stereotaxis etapa de la cirugía para los ratones	Harvard Apparatus	726335	Cirugía
20X o 25X objetivo de inmersión en agua	Olimpo	XLPL25XWMP	Proyección de imagen
Microscopio etapa con marco de fijación de cabeza	Una medida que se	N / A	Proyección de imagen
Pinzas finas	Herramientas Artes Ciencias	11251-20	Cirugía
Dental taladro fresa	Herramientas Artes Ciencias	19007-05	Cirugía
CCD cámara	QImaging	QICAM 12-bit	Proyección de imagen