In Vivo Imagerie biphotonique d'expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

Résumé

Expérience dépendant des changements moléculaires dans les neurones sont essentiels pour la capacité du cerveau à s'adapter en réponse à des problèmes de comportement. Un In vivo à deux photons est décrit ici, qui permet le suivi de ces changements moléculaires dans les différents neurones corticaux par les journalistes génétiquement codés.

Résumé

La capacité du cerveau de changer en réponse à l'expérience est essentielle pour le fonctionnement sain du cerveau et des anomalies dans ce processus contribue à une variété de troubles neurologiques ^1,2. Pour mieux comprendre les mécanismes par lesquels les circuits du cerveau réagissent à l'expérience d'un animal nécessite la capacité de surveiller les changements vécus par dépendantes moléculaires dans un ensemble donné de neurones, sur une période de temps prolongée, chez l'animal vivant. Bien que l'expérience et l'activité neuronale associée est connu pour déclencher des changements d'expression des gènes dans les neurones ^1,2, la plupart des méthodes pour détecter ces changements ne permettent pas l'observation répétée des mêmes neurones sur plusieurs jours ou qui n'ont pas une résolution suffisante pour observer les neurones individuels ^{3 , 4.} Nous décrivons ici une méthode qui combine in vivo microscopie à deux photons avec un journaliste codées génétiquement fluorescent pour suivre l'expérience dépendant de changements d'expression génétique dans les différents neurones corticaux au cours de la cours de la journée-à-jour l'expérience.

L'une des expériences bien établies qui dépendent gènes est régulée l'activité protéine du cytosquelette associée (Arc) ^5,6. La transcription d'Arc est rapidement et fortement induite par l'intensification de l'activité neuronale ^3, et son produit protéique régule l'endocytose des récepteurs au glutamate et à long terme de plasticité synaptique ^7. L'expression d'Arc a été largement utilisé comme un marqueur moléculaire pour cartographier les circuits neuronaux impliqués dans les comportements spécifiques ^3. Dans la plupart de ces études, l'expression Arc a été détecté par hybridation in situ ou immunohistochimie dans des coupes de cerveau fixes. Bien que ces méthodes ont révélé que l'expression d'Arc a été localisé à un sous-ensemble de neurones excitateurs après l'expérience du comportement, la façon dont les modèles cellulaires d'expression Arc pourrait changer avec de multiples épisodes d'expériences répétées sur plusieurs jours ou distinctif n'a pas été étudiée. ntent "> In vivo microscopie à deux photons offre un moyen puissant d'examiner l'expérience qui dépendent des changements cellulaires dans le cerveau ^8,9 vivre. Afin de permettre l'examen de l'expression Arc de neurones vivants par microscopie à deux photons, nous avons déjà généré un knock- en ligne de la souris dans lequel un rapporteur GFP est placé sous le contrôle du promoteur endogène d'arc ^10. Ce protocole décrit la préparation et procédures chirurgicales pour le suivi de l'expérience d'imagerie dépendant de profils d'expression Arc-GFP dans des ensembles de neurones chez l'animal vivant. Dans ce procédé , chroniques fenêtres crâniennes ont d'abord été implanté à Arc-GFP souris sur les régions corticales d'intérêt. Ces animaux ont ensuite été reprises imagée par microscopie à deux photons après souhaités paradigmes comportementaux au cours de plusieurs jours. Cette méthode peut être applicable aux animaux porteurs d'autres reporters fluorescents d'expérience dépendant de changements moléculaires ^4.

Protocole

Les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvés par l'Institut national de la santé mentale et des animaux comité sur l'utilisation et sont conformes aux National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparation pré-opératoire

1. Nettoyer tous les outils dans un stérilisateur à billes à chaud avant la chirurgie aseptique, nettoyer le site de la chirurgie avec de l'éthanol à 70%, et posa toiles propres. Porter des gants stériles. Anesthésier l'animal avec une solution fraîchement préparée avertin 1,2%, donnée à 0,02 ml / g, intrapéritonéale. En variante, l'isoflurane avec du gaz anesthésier à travers un cône de nez, 5% pour l'induction, 1,5% pour la maintenance, avec un circuit accepteur passive. Vérifier le niveau d'anesthésie utilisant pincées de queue ou de l'orteil pour assurer une sédation complète.
2. Couvrir les yeux de l'animal avec une pommade ophtalmique stérile et injecter la dexaméthasone fraîchement préparée (0,2 mg / kg) et le carprofène (5 mg / kg) subcutaneously pour prévenir l'enflure et l'inflammation du cerveau ^11. Se raser les cheveux sur le crâne entre les oreilles, et stériliser la peau avec gommage bétadine et trois tampons en alternance de l'éthanol à 70%.
3. Montez l'animal à un stade chirurgie stéréotaxique avec earbars, avec un coussin chauffant à circulation d'eau ci-dessous l'ensemble des animaux à 37 ° C. Vérifiez régulièrement les niveaux d'anesthésie de l'animal, et compléter la dose initiale anesthésie si nécessaire.
4. Injecter 200 pi de Marcaïne 0,5% sous la peau du cuir chevelu pour engourdir la région. Inciser la peau et retirer le lambeau de peau sur le crâne. Retirez le périoste et sécher la zone avec des cotons-tiges propres.

2. Chronique chirurgie crânienne fenêtre

1. Utiliser une perceuse à grande vitesse dentaire avec une fraise de 0,5 mm à décrire un cercle délicatement 3-5 mm de diamètre sur la région du cerveau d'intérêt. Périodiquement, mouiller avec le site de forage stérile poussière d'os saline à 0,9% et claire loin avec des cotons-tiges propres. Si les saignements osseux, utilisez gelfoam préalablement trempés avec une solution saline stérile pour effacer la purge et attendre que ça s'arrête.
2. Lorsque la couche d'os dernière est atteinte, soulever et retirer l'île os avec pointe fine pince. Dura pièces jointes à l'étagère inférieure de l'os peut se produire si la fenêtre traverse une suture osseuse. Ceux-ci devraient être éliminées en douceur comme le volet osseux est levée.
3. Rouleau mousse de gel humide doucement sur ​​la dure-mère exposée à nettoyer sa surface et attendre que le saignement dure-mère d'arrêter étape critique:. Ne commencera pas avant que tout saignement s'est arrêté dural. Sang qui se retrouve piégé à l'intérieur de la fenêtre crânienne conduit généralement à une fenêtre opaque.
4. Si la région d'intérêt est sous un emplacement où la durée est particulièrement épais, enlever la dure-mère ci-dessus, il peut être nécessaire. Si c'est le cas, séparez doucement la durée de la pie-dessous avec des pinces très fines, faire une petite incision dans la levée dure-mère avec une autre paire de pinces fines, puis saisissez les bords coupés et doucementdiviser la dure-mère. La dure-mère est mince mais solide, donc soyez prudent de ne pas trancher le cerveau avec les bords intacts de la dure-mère.
5. Rincer la zone avec ACSF stérile ou une solution saline stérile.
6. Posez une lamelle de verre stérile (3-5 mm) au cours de la dure-mère ou pia étape critique:. Si les courbes du crâne entourant de manière significative, utilisez Kwiksil colle ¹² pour remplir des espaces où la mère ou pia serait pas en contact étroit avec la lamelle dans les régions qui ne sera pas mis en image.
7. Utiliser un gel cyanoacrylate à couvrir l'adhésif élastomère et les bords de la lamelle couvre-objet en verre. Couvrir l'ensemble du crâne exposé au gel cyanoacrylate, ou un mélange de ciment et de soins dentaires krazyglue étape critique:. Ne laissez pas n'importe quel gel cyanoacrylate de toucher la surface du cerveau.
8. Intégrer un bar sur mesure en métal tête de fixation à l'extrémité opposée du crâne.
9. Le réexpédier vers une chambre de récupération à chaud, après une injection intrapéritonéale de kétoprofène, 5 mg / kg, fogestion de la douleur r. Continuer l'analgésique deux jours de plus après l'opération.
10. Après deux semaines de récupération post-opératoire, anesthésie de l'animal à l'isoflurane (5% pour l'induction, 1,5% pour la maintenance), le monter dans une platine de microscope sur mesure avec un châssis de tête de fixation et vérifiez la fenêtre crânienne pour plus de clarté optique sous illumination avec une lumière bleue. Surface des vaisseaux sanguins du cerveau clarté est très révélateur de la qualité de fenêtre crânienne. Si les bords des vaisseaux sanguins sont nettement définies, la fenêtre est susceptible d'être utilisables. Le temps de deux semaines de récupération post-opératoire est recommandé de laisser suffisamment de temps pour que l'animal récupérer de la chirurgie. Fenêtres crâniens généralement nettoyer et améliorer pendant ce temps, et restent optiquement transparent pendant des semaines à des mois supplémentaires avant que le regain du crâne ou un épaississement de la dure-mère dégrade la qualité de la fenêtre.

3. Protocole de comportement et à balayage laser microscopie à deux photons

1. Les animaux atteints clair cranial fenêtres seront exposés à un stimulus environnemental ou soumis à une session de formation comportementale, puis imagée après au moment du maximum Arc-GFP expression. Avant de commencer un protocole de comportement, l'animal doit être gardé dans un environnement cage cohérente afin de minimiser au jour le jour la variation des niveaux de référence d'expression Arc-GFP.
2. Commencer la formation comportementale ou paradigmes de stimulation de l'environnement, en fonction de la région cérébrale d'intérêt. Par exemple, les animaux peuvent être exposés à différents environnements visuels sur des jours consécutifs, et imager chaque jour après la stimulation visuelle pour identifier les stimulus-réponse spécifique dans le cortex visuel ^10.
3. Arc-fluorescence de la GFP dans les neurones atteint généralement son niveau maximum deux heures après la stimulation. Le calendrier expérimental peut être optimisée afin de faciliter la détection d'Arc-GFP expression dans les neurones à leurs niveaux de fluorescence de pointe.
4. Après une session de formation comportementale ou environnementastimulation l est terminée, anesthésier l'animal avec de l'isoflurane (5% pour l'induction, 1,5% pour la maintenance) et monter l'animal dans la platine du microscope sur mesure avec tête de fixation cadre, sous le microscope à deux photons.
5. Position de la tête de l'animal est fixé sur le cadre de tête de fixation qui se connecte directement à l'étape, à l'aide de la barre métallique implanté sur la boîte crânienne. L'isoflurane et l'oxygène sont fournis en continu à la souris par un cône de nez. La température du corps est maintenue à l'aide d'un coussin chauffant.
6. Assurez-vous que les détecteurs de microscope sont protégés de la lumière ambiante en effectuant balayage laser à deux photons dans une pièce sombre. Utilisez un objectif 20x ou 25x eau (1,05 ouverture numérique) d'immersion pour l'imagerie. Tout d'abord, sous l'épifluorescence illumination, acquérir une image de motifs de surface du vaisseau sanguin dans le cerveau de la région d'intérêt avec une caméra CCD pour l'alignement d'image future.
7. Commencer à deux photons laser à balayage pour acquérir une pile d'images 3-D. Un FV1000 OlympusMPE multi-photon microscope est utilisé dans notre configuration. La longueur d'onde d'excitation du laser à deux photons est réglé à 920 nm, et la puissance du laser émise à partir de l'objectif est fixé à environ 50 mW. Fluorescence émise est simultanément détectée dans les canaux vert et rouge (miroir dichroïque à 570 nm, des filtres barrières à 495-540 nm et 570-625 nm), en utilisant un canal externe de deux systèmes de détection photomutiplier placé à proximité du spécimen. Arc-fluorescence de la GFP apparaît uniquement dans le canal vert, tandis que le tissu auto-fluorescence apparaît dans les deux canaux ^{13, 14.}
8. Piles d'images typiques ont des dimensions d'environ 320x320x100 um (largeur x longueur x profondeur), une résolution horizontale de 0,5 um / pixel, et une résolution verticale de 3 um / pixel.
9. Après l'acquisition de la pile d'images, le retour de l'animal à sa cage. Ne pas déranger l'animal jusqu'à la prochaine session de comportement et d'imagerie. Répétez le comportement et la procédure d'imagerie au fil des jours comme souhaitableed. Utilisez la surface préalablement acquis des vaisseaux sanguins du cerveau l'image d'orienter vers l'emplacement d'imagerie même.

Résultats

Ce protocole décrit une méthode pour suivre l'expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les différents neurones corticaux dans les animaux vivants. Une fenêtre crânienne chronique est d'abord créé sur une région corticale d'intérêt dans une souris portant un rapporteur fluorescent de l'expression génique. Microscopie à deux photons peut ensuite être couplé avec divers paradigmes comportementaux pour observer comportemental induit des changements moléculaires dans ...

Discussion

L'imagerie in vivo méthode décrite ici permet l'examen répété des changements d'expression des gènes dans l'arc les mêmes ensembles de neurones sur plusieurs jours chez l'animal vivant. Il s'agit d'une méthode efficace et polyvalent pour obtenir des informations sur la plasticité neuronales liées à la dynamique moléculaire dans les neurones individuels en réponse à diverses expériences comportementales. Standard des méthodes histochimiques comme l'hyb...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de l'équipement	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
FV1000 multi-photons microscope à balayage laser	Olympe	FV1000MPE	Imagerie
Microscope à dissection	Omano	555V107	Chirurgie
Stade de la chirurgie stéréotaxique pour la souris	Harvard Apparatus	726335	Chirurgie
20X 25X ou objectif immersion dans l'eau	Olympe	XLPL25XWMP	Imagerie
La platine du microscope avec tête de fixation cadre	Sur mesure	N / A	Imagerie
Pinces fines	Outils Fine Science	11251-20	Chirurgie
Foret fraise dentaire	Outils Fine Science	19007-05	Chirurgie
Caméra CCD	QImaging	QICAM 12-bit	Imagerie