皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

要約

ニューロンにおける経験依存的分子変化は行動の課題に応じて適応する脳の能力のために不可欠である。アン 2光子イメージング法は、遺伝的にコードされた記者を通じて、個々の皮質ニューロンにおけるそのような分子の変化の追跡を可能にする、ここで説明されます。

要約

経験に応じて変更することが脳の能力は、健康な脳機能に不可欠であり、この過程で異常が脳障害の^1,2の様に貢献しています。より良い脳の回路は、動物の経験に反応するメカニズムを理解するために生きている動物で、長期間にわたってニューロンの指定されたセットの中で経験依存分子の変化を監視する機能が必要です。経験と関連した神経活動は神経細胞^1,2における遺伝子発現の変化を引き起こすことが知られているが^、そのような変化を検出する方法のほとんどは、複数日にわたって同じニューロンの繰り返し観測を許可していないか、または個々のニューロン^3を観察するのに十分な解像度を持っていない^、4。ここでは、以上の個々の皮質ニューロンにおける経験依存性の遺伝子発現の変化を追跡するために遺伝的にコードされた蛍光レポーターを用いた in vivo二光子顕微鏡に組み合わせた方法を記載する日々の経験のコース。

定評のある経験依存性遺伝子の一つが活性調節細胞骨格関連タンパク質（ARC）は^5,6です。アークの転写は急速であり、非常に激化神経活動³により誘導され^、そのタンパク質産物は、グルタミン酸受容体との長期的なシナプス可塑性⁷のエンドサイトーシスを調節する。アークの発現は広く³特定の行動に関与する神経回路をマッピングするための分子マーカーとして使用されてきた。これらの研究の大部分では、アーク式は固定の脳切片におけるin situハイブリダイゼーションや免疫組織化学によって検出した。これらのメソッドはArcの発現が調べていなかったアーク発現の細胞パターン日間反復または一味違った体験の複数のエピソードに変更される可能性がありますどのように、行動の経験の後、興奮性ニューロンのサブセットに局在していたことが明らかになっていますが。 ntentが"> 生体内では 2光子顕微鏡は、生きている脳^8,9における経験依存的細胞の変化を調べるための強力な方法を提供しています。2光子顕微鏡による生きた神経細胞におけるアーク式の検査を有効にするには、我々は、以前に生成されたノックをGFPレポーターが内因性アークプロモーター¹⁰の制御下に置かれているマウス系統インチこのプロトコルでは、生きた動物におけるニューロンのアンサンブルにおける経験依存アーク-GFPの発現パターンを追跡するための手術の準備と撮像法について説明していますこの方法では、慢性頭蓋窓は最初の利息の皮質領域にわたってアーク-GFPマウスに移植した。これらの動物は、その後、繰り返し数日間にわたって所望の行動パラダイム後の2光子顕微鏡で撮像した。このメソッドは、帳簿動物に一般的に適用することができる経験依存性分子の変化の他の蛍光レポーター^4。

プロトコル

後述の実験手順は、メンタルヘルス動物のケアと使用委員会の国立研究所によって承認され、 実験動物の管理と使用のための健康ガイドの国立研究所に合わせてあった。

1。術前準備

1. 無菌手術前にホットビーズ滅菌器ですべてのツールをきれいにし、70％エタノールで手術部位を掃除し、きれいなドロップ布を下に置く。滅菌手袋を着用してください。 intraperitonially 0.02ミリリットル/ gであり、与えられた時に作りたての1.2パーセントAVERTIN溶液で動物を麻酔。あるいは、受動スカベンジャー回路付きノーズコーン、誘導のための5％、メンテナンスのために1.5％、イソフルランを通してガスと麻酔。完全鎮静状態を確保するためにテールやつま先ピンチを使用して麻酔レベルをチェックします。
2. 無菌の眼軟膏を用いて動物の目をカバーし、作りたてのデキサメタゾンを注入する（0.2 mg / kg）及びカルプロフェン（5 mg / kg）をsubcutaneousl脳の腫れや炎症^を防ぐために^、11 yである。耳の間の頭蓋骨の上の毛を剃ると、ベタジンスクラブと70％エタノール3交互綿棒で皮膚を消毒する。
3. earbarsと定位手術の段階で動物をマウントし、37℃に設定動物下水循環加熱パッド付き℃、定期的に動物の麻酔レベルをチェックし、必要に応じてオリジナルの麻酔量を補う。
4. エリアを麻痺させるために、頭皮の皮膚の下に0.5％Marcaineの200μlを注入します。皮膚を切開し、頭蓋骨の上に皮弁を取り外します。骨膜を取り外し、きれいな綿棒でその領域を乾燥させます。

2。慢性頭蓋窓手術

1. 穏やかに興味のある脳領域にわたって3〜5ミリメ​​ートルの直径の円を概説する0.5ミリメートルバリで高速歯科用ドリルを使用します。定期的にクリーン綿棒と滅菌0.9％食塩水と離れて明確な骨塵で掘削地点を濡らす。骨、出血した場​​合、gを使用するelfoamはブリードをブロットおよびそれが停止するのを待つように滅菌生理食塩水に浸漬した。
2. 最後の骨の層に到達すると、先の細いピンセットで骨の島を持ち上げて外します。ウィンドウは骨縫合を超えた場合に、骨の一番下の棚に硬添付ファイルが発生する可能性があります。骨弁が持ち上げられるように、これらは、優しく除去しなければならない。
3. ロールは、その表面をきれいにし、停止するために、任意の硬膜出血を待つさらさ硬膜の上にそっとゲル発泡体を湿らせた重要なステップは：すべての硬膜出血が停止するまで、先に進まないでください。頭蓋窓の中に閉じ込めになる血液は、通常不透明なウィンドウにつながる。
4. 関心領域は、硬膜は、特に厚さは場所の下にある場合、その上に硬膜を除去することが必要な場合があります。このような場合は、優しく、非常に微細鉗子で下PIAから硬膜を分離し、細かい鉗子の別のペアで持ち上げる硬膜の小さな切開を行い、その後、カットエッジをつかみ、そっと硬膜を分割します。硬膜が薄くても強いので、硬膜の無傷のエッジを持つ脳をスライスしないように注意してください。
5. 無菌ACSFまたは滅菌生理食塩水で洗い流してください。
6. 硬膜またはPIA経由で滅菌ガラスカバースリップ（3-5 mm）を築く重要なステップ：大幅頭蓋骨カーブを囲む場合は、硬膜またはPIAは地域でカバースリップとの密接な接触をすることはないだろうスペースを埋めるためにKwiksil ¹²接着剤を使用それが画像化されることはありません。
7. エラストマーの接着剤とガラスカバースリップの端をカバーするためにシアノアクリレートゲルを使用しています。 。任意シアノアクリレートゲルが脳表面に触れないように注意してください：シアノアクリレートゲル、またはkrazyglueと歯科用セメント混合物と全露出頭蓋骨重要なステップをカバーしています 。
8. 頭蓋骨の反対側の端にあるカスタムメイドの金属頭部固定バーを埋め込む。
9. ケトプロフェン、5 mg / kgを、foのintraperitonial注射後、暖かい回復室に動物を戻すrの疼痛管理。手術後2日以上鎮痛剤を続行します。
10. 術後の回復の2週間後には、（誘導の場合は5％、保守のための1.5％）イソフルランで動物を麻酔し、頭部固定用フレームを使用してカスタムメイドの顕微鏡ステージでそれをマウントし、光学的透明度のために頭蓋窓をチェック青色光と照明の下で。脳表面の血管の明瞭さは頭蓋窓の質の高い指標である。血管エッジがはっきりと定義されている場合、ウィンドウが使用可能である可能性が高い。 2週間の術後の回復時間は、手術から回復するために動物のための十分な時間を確保することをお勧めします。頭蓋窓は一般的にクリアして、改善するこの時期に、と硬膜の肥厚や頭蓋骨の再生、ウィンドウの画質を劣化させるまで数ヶ月に付加週間の光学的に透明なままです。

3。二光子顕微鏡を行動プロトコルおよびレーザー

1. 明確なcと動物ranial窓は環境刺激にさらされたり、行動のトレーニングセッションを行い、その後、最大アーク-GFP発現時にその後結像される。行動プロトコルを開始する前に、動物は、ベースラインアーク-GFPの発現レベルでの日々の変動を最小限にするために一貫性のあるホームケージ環境で保たれるべきである。
2. 興味のある脳領域に応じて、行動訓練や環境刺激パラダイムを開始します。例えば、動物が日連続で異なるビジュアルな環境にさらされることができ、視覚野¹⁰に刺激特異的応答を識別するための視覚的な刺激の後に毎日結像される。
3. ニューロンにおけるアーク-GFPの蛍光は、通常は2時間刺激した後にそのピークレベルに達する。実験のタイムラインは、そのピーク蛍光レベルでのニューロンにおけるアーク-GFP発現の検出を容易にするために最適化することができる。
4. 行動訓練セッションまたはenvironmenta後にlの刺激が完了すると、（誘導の場合は5％、保守のための1.5％）イソフルランで動物を麻酔し、二光子顕微鏡でヘッド固定用フレームを使用してカスタムメイドの顕微鏡ステージで動物をマウントします。
5. 動物の頭の位置が頭蓋骨に注入された金属棒を使って、ステージに直接接続し、ヘッド固定用フレームに固定されています。イソフルランと酸素が継続的にノーズコーンを介してマウスに供給される。体温は加熱パッドを使用して維持されます。
6. 顕微鏡の検出器は、暗い​​部屋で二光子レーザー走査を行うことで、周囲の光から保護されていることを確認します。イメージングのための20倍または25倍（開口数1.05）水​​浸レンズを使用しています。まず、落射蛍光照明の下で、将来像の位置合わせのためのCCDカメラを使って、対象の脳領域の上表面の血管パターンの画像を取得する。
7. 3次元画像スタックを取得するためにスキャン二光子レーザーを起動します。オリンパスFV1000MPEの多光子顕微鏡は、我々のセットアップで使用されています。二光子レーザーの励起波長は920 nmに設定されており、客観から出射されるレーザのパワーが約50 mWで設定されています。放出される蛍光を同時に標本の近くに配置し外部2チャンネルphotomutiplier検出システムを使用して、緑と赤のチャネル（570nmでのダイクロイックミラー、495から540 nmと570から625 nmにおけるバリアフィルタ）で検出される。組織の自家蛍光は、チャンネル^13、14の両方に表示され、一方の円弧GFP蛍光は唯一、緑のチャンネルに表示されます。
8. 典型的な画像スタックは約320x320x100μmの寸法（幅×長さ×深さ）が0.5μm/ピクセルの水平方向の解像度、と3μm/ピクセルの垂直方向の解像度を持っています。
9. 画像スタックを取得した後、そのホームケージに動物を返す。次の行動やイメージングセッションまで動物を乱すことがありません。 desirとして日間にわたる行動やイメージング手順を繰り返しエド。同じ画像の場所に戻って方向付けるために以前に取得した脳表面の血管画像を使用しています。

結果

このプロトコルは、生きた動物の個々の皮質ニューロンにおける経験依存的分子の変化を追跡する方法について説明します。慢性頭蓋ウィンドウが最初に遺伝子発現の蛍光レポーターを運ぶマウスへの関心の皮質領域上に作成されます。二光子顕微鏡は、その後、個々のニューロンにおける行動的に誘発され分子の変化を観察して、複数の日にわたってニューロンの同じセットでこのよ?...

ディスカッション

ここで説明するin vivoイメージング法で生きている動物で、複数の日にわたってニューロンの同じセットでアーク遺伝子発現変化の反復検査が可能になります。それは様々な行動の経験に応じて、個々のニューロンにおける神経可塑性関連分子動力学に関する情報を取得するための効率的かつ汎用性の高い方法です。そのようなin situハイブリダイゼーションおよび免疫染?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
機器の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
FV1000多光子レーザー走査顕微鏡	オリンポス	FV1000MPE	イメージング
解剖顕微鏡	Omano	555V107	手術
マウスに対する定位手術の段階	ハーバード装置	726335	手術
20Xまたは25X水浸対物レンズ	オリンポス	XLPL25XWMP	イメージング
ヘッド固定用フレーム付き顕微鏡ステージ	カスタムメード	N / A	イメージング
ファイン鉗子	ファイン科学ツール	11251から20	手術
歯科用ドリルバリ	ファイン科学ツール	19007から05	手術
CCDカメラ	QImaging	QICAM 12ビット	イメージング