In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

Zusammenfassung

Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in Nervenzellen sind essentiell für die Fähigkeit des Gehirns, in Reaktion auf Verhaltensstörungen Herausforderungen anzupassen. Ein In vivo Zwei-Photonen-Imaging-Verfahren wird hier das ermöglicht die Rückverfolgung von molekularen Veränderungen in den einzelnen kortikalen Neuronen durch genetisch kodierte Reporter beschrieben.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit des Gehirns als Reaktion auf Erfahrungen zu ändern ist wichtig für gesunde Funktion des Gehirns, und Anomalien in diesem Prozess beitragen zu einer Vielzahl von Erkrankungen des Gehirns ^1,2. Zum besseren Verständnis der Mechanismen, durch die Schaltkreise des Gehirns reagieren auf eines Tieres Erfahrung erfordert die Fähigkeit, die Erfahrung angewiesen molekulare Veränderungen in einer bestimmten Gruppe von Neuronen zu überwachen, die über einen längeren Zeitraum, in dem lebenden Tier. Während die Erfahrung und die damit verbundenen neuronalen Aktivität ist bekannt, dass Veränderungen der Genexpression in Nervenzellen ^{1,2 auslösen,} die meisten der Methoden, um solche Veränderungen zu erkennen erlauben nicht wiederholte Beobachtung der gleichen Neuronen über mehrere Tage oder keine ausreichende Auflösung zu beobachten einzelnen Neuronen ^{3 , 4.} Hier beschreiben wir eine Methode, die in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie mit einem genetisch kodierten fluoreszierenden Reporter Erfahrungen abhängigen Veränderungen der Genexpression in einzelnen kortikalen Neuronen über die Strecke Laufe des Tages-to-day Erfahrung.

Einer der gut etablierten Erfahrung abhängigen Genen ist Activity-regulierten Zytoskelett assoziierten Protein (Arc) ^5,6. Die Transkription von Arc wird schnell und stark von verstärkten neuronalen Aktivität ³ induziert ^wird, und dessen Proteinprodukt reguliert die Endozytose von Glutamatrezeptoren und langfristige synaptischen Plastizität ^7. Die Expression von Arc wurde weithin als molekularer Marker neuronaler Schaltkreise in spezifischen Verhaltensweisen ³ beteiligten Karte verwendet. In den meisten dieser Studien wurde Arc-Expression durch in situ-Hybridisierung oder Immunhistochemie in festen Gehirnschnitte detektiert. Obwohl diese Methoden ergab, dass die Expression von Arc auf eine Teilmenge von erregenden Neuronen nach Verhaltensstörungen Erfahrung, wie die zellulären Strukturen des Arc Ausdruck kann mit mehreren Episoden von wiederholten oder besondere Erfahrungen über Tage zu ändern wurde nicht untersucht wurde lokalisiert. ntent "> In vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie ein guter Weg, um Erfahrungen-abhängige zelluläre Veränderungen im lebenden Gehirn ^8,9 untersuchen bietet. Um die Prüfung der Arc Ausdruck in Live-Neuronen durch Zwei-Photonen-Mikroskopie zu ermöglichen, haben wir vorher erzeugte einen Dominoeffekt in Maus, in der ein GFP-Reporter steht unter der Kontrolle des endogenen Promotor Arc ¹⁰ platziert. Dieses Protokoll beschreibt die chirurgischen Vorbereitungen und bildgebenden Verfahren zum Verfolgen erfahrungsabhängiger Arc-GFP-Expression in neuronalen Mustern Ensembles in dem lebenden Tier. Bei diesem Verfahren , chronische kranialen Fenster wurden zuerst in Arc-GFP-Mäuse in den kortikalen Regionen von Interesse implantiert. Die Tiere wurden dann wiederholt durch Zwei-Photonen-Mikroskopie nach gewünschten Verhaltensänderungen Paradigmen im Laufe von mehreren Tagen abgebildet. Diese Methode kann allgemein für Tiere, die anderen fluoreszierenden Reporter Erfahrung-abhängigen molekularen Veränderungen ^4.

Protokoll

Die experimentellen Verfahren beschrieben wurden vom National Institute of Mental Health Animal Care und Use Committee genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

Ein. Präoperative Vorbereitung

1. Reinigen Sie alle Werkzeuge in einem heißen Perle Sterilisator vor aseptische Chirurgie, reinigen die Operation vor Ort mit 70% Ethanol, und legte sauber Packpapier und Klebeband. Trage sterile Handschuhe. Betäuben das Tier mit frisch zubereiteten 1,2% Avertin Lösung bei 0,02 ml / g, intraperitoneal gegeben. Alternativ mit Isofluran-Gas betäubt durch einen Nasenkonus, 5% für die Induktion, 1,5% für die Wartung, mit einem passiven scavenger Schaltung. Überprüfen Sie die Anästhesie Ebene mit Schwanz oder Zehen drückt in voller Sedierung zu gewährleisten.
2. Decken die Augen des Tieres mit steriler Augensalbe, und spritzen frisch zubereitet Dexamethason (0,2 mg / kg) und Carprofen (5 mg / kg) subcutaneously zu Gehirn Schwellung und Entzündung ^{11 zu} verhindern. Rasieren die Haare über den Schädel zwischen den Ohren, und sterilisieren Sie die Haut mit betadine Peeling und drei alternierende Tupfer von 70% Ethanol.
3. Montieren Sie das Tier in einem stereotaktischen Chirurgie Bühne mit earbars mit einem Wasserkreislauf Heizkissen unter dem animal set bei 37 ° C. Überprüfen Sie regelmäßig das Tier Anästhesie Ebenen und Ergänzung des ursprünglichen Anästhesie Dosis nach Bedarf.
4. Inject 200 ul von 0,5% Carbostesin unter der Kopfhaut, um den Bereich zu betäuben. Inzision der Haut und entfernen Sie den Hautlappen über den Schädel. Entfernen Sie die Knochenhaut und trocknen Sie den Bereich mit einem sauberen Wattestäbchen.

2. Chronische Cranial Fenster Chirurgie

1. Verwenden Sie ein High-Speed-Dentalbohrer mit einem 0,5 mm-Fräse vorsichtig skizzieren 3-5 mm Durchmesser-Kreis über das Gehirn region of interest. Periodisch benetzen Bohrstelle mit steriler 0,9% iger Kochsalzlösung und klar weg Knochenmehl mit sauberen Wattestäbchen. Wenn die Knochen blutet, verwenden gelfoam mit steriler Kochsalzlösung eingeweicht, um die Blutung auslöschen und warten, bis es zu stoppen.
2. Wenn der letzte Knochen Schicht erreicht ist, heben und entfernen Sie die Knochen Insel mit spitzen Pinzette. Dura Anhänge auf der untersten Platte des Knochens können auftreten, wenn das Fenster durchquert einen Knochen Nahtmaterial werden. Diese sollten vorsichtig entfernt werden, da der Knochendeckel abgehoben ist.
3. Befeuchtetem Gel-Schaum vorsichtig über den freiliegenden dura seiner Oberfläche zu reinigen und warten jeden Dural Blutung zu stoppen Critical Schritt:. Nicht fortfahren, bis alle dural Blutung aufgehört hat. Blut, das im Inneren des kranialen Fenster eingeklemmt wird meist führt zu einem undurchsichtigen Fenster.
4. Wenn die Region von Interesse unter einer Stelle, wo die Dura ist besonders dick, Entfernen der Dura oben kann es erforderlich sein. Wenn dies der Fall ist, sanft zu trennen die Dura von der Pia unten mit sehr feinen Pinzetten, einen kleinen Einschnitt in der angehobenen Dura mit einem anderen Paar von feinen Pinzette, dann erfassen die Schnittkanten und sanftspaltete die Dura. Die Dura ist dünn, aber stark, so vorsichtig sein, nicht das Gehirn mit den intakten Rändern der Dura schneiden.
5. Spülen Sie den Bereich mit einem sterilen ACSF oder sterile Kochsalzlösung.
6. Ziehen einer sterilen Deckgläschen (3-5 mm) über die Dura oder pia Critical Schritt:. Wenn die umgebenden Schädel Kurven deutlich, verwenden Kwiksil ¹² Klebstoff in Räumen, wo die Dura oder pia keinen engen Kontakt mit dem Deckglas in Regionen füllen würde Das wird nicht abgebildet werden.
7. Verwenden Cyanoacrylat Gels, um das Elastomer und Kleber die Kanten des Deckglases bestimmt. Decken Sie die gesamte freiliegende Schädel mit Cyanacrylat Gel oder einer krazyglue und zahnmedizinischen Zement-Mischung Critical Schritt:. Lassen Sie keine Cyanacrylat-Gel, das Gehirn zu berühren.
8. Einbetten eine maßgeschneiderte Metall-Fixierung bar am gegenüberliegenden Ende des Schädels.
9. Zurückzukehren das Tier in einen warmen Wiedergewinnungskammer, nach einer Injektion von intraperitonial Ketoprofen, 5 mg / kg, for Schmerzen. Fahren Sie mit der Analgetikum für zwei Tage nach der Operation.
10. Nach zwei Wochen post-operative Erholung, betäuben das Tier mit Isofluran (5% für Induktion, 1,5% für die Wartung), montieren Sie ihn in einem maßgeschneiderten Mikroskoptisch mit einem Kopf-Befestigungsrahmen, und überprüfen Sie die kranialen Fenster für optische Klarheit unter Beleuchtung mit blauem Licht. Hirnoberfläche Blutgefäß Klarheit ist höchst bezeichnend von kranialen Fensters Qualität. Wenn die Kanten scharf Blutgefäß definiert sind, ist das Fenster wahrscheinlich verwendbar. Die Zwei-Wochen post-operative Recovery-Zeit wird empfohlen, genügend Zeit für das Tier von der Operation erholen können. Cranial Fenstern in der Regel klar, und während dieser Zeit zu verbessern, und bleiben optisch transparent für weitere Wochen bis Monate, bis das Nachwachsen des Schädels oder Verdickung der Dura verschlechtert Fenster Qualität.

3. Behavioral-Protokolls und Laser Scanning Zwei-Photonen-Mikroskopie

1. Tiere mit klaren cranial Fenstern wird es einer umgebenden Reiz ausgesetzt werden oder Gegenstand einer Verhaltenstraining Sitzung, und dann nachher zum Zeitpunkt der maximalen Arc-GFP-Expression abgebildet. Vor Beginn eines Verhaltensmodells Protokoll, sollte das Tier in einer konsistenten Heimkäfig Umwelt zu Tag zu Tag Variation Basislinie Arc-GFP Expressionsniveaus minimieren gehalten werden.
2. Beginnen Verhaltenstraining oder Umweltreize Paradigmen, abhängig von der Hirnregion des Interesses. Beispielsweise können Tiere auf unterschiedliche visuelle Umgebungen über aufeinanderfolgende Tage ausgesetzt werden und abgebildet jeden Tag nach visueller Stimulation zu Stimulus-spezifische Antworten in der Sehrinde ^{10 zu} identifizieren.
3. Arc-GFP-Fluoreszenz in den Neuronen in der Regel ihren Höhepunkt erreicht Stufe zwei Stunden nach der Stimulation. Die experimentelle Zeitachse kann optimiert werden, um den Nachweis von Arc-GFP-Expression in Neuronen an ihrer Spitze Fluoreszenzwerte erleichtern.
4. Nach einer Verhaltenstherapie Training oder environmental Stimulation abgeschlossen ist, betäuben das Tier mit Isofluran (5% für Induktion, 1,5% für die Wartung) und montieren das Tier in der maßgeschneiderten Mikroskoptisch mit Kopf-Fixierung Rahmen unter der Zwei-Photonen-Mikroskop.
5. Der Kopf des Tieres Position mit dem Kopf-Fixierungsrahmenplatte, der direkt an der Bühne unter Verwendung des implantierten Metallstange am Schädel befestigt. Isofluran und Sauerstoff kontinuierlich an der Maus durch ein Nasenkonus zugeführt. Die Körpertemperatur wird beibehalten mit einem Heizkissen.
6. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop Detektoren von Umgebungslicht werden durch die Durchführung der Zwei-Photonen-Laser-Scanning in einem dunklen Raum geschützt. Verwenden Sie ein 20x oder 25x (1,05 numerische Apertur) Wasser Immersionslinse für die Bildgebung. Zunächst unter Auflicht-Fluoreszenz Beleuchtung, zu erwerben ein Bild der Oberfläche Blutgefäß Muster über das Gehirn interessierenden Region mit einer CCD-Kamera für zukünftige Bildausrichtung.
7. Starten Zwei-Photonen-Laser-Scanning-, ein 3-D-Bild-Stapels erfassen. Ein Olympus FV1000MPE Multi-Photonen-Mikroskop wird in unserem Setup verwendet. Die Anregungswellenlänge des Zwei-Photonen-Laser bei 920 nm festgelegt, und die Leistung des Lasers aus dem Ziel emittiert wird bei ungefähr 50 mW eingestellt. Emittierten Fluoreszenz wird gleichzeitig in grünen und roten Kanälen (dichroitischen Spiegel bei 570 nm, bei Sperrfiltern 495-540 nm und 570-625 nm) unter Verwendung einer externen zweikanaligen photomutiplier Detektionssystem nahe der Probe platziert detektiert. Arc-GFP-Fluoreszenz erscheint nur in den grünen Kanal, während Gewebe Autofluoreszenz erscheint in beiden Kanälen ^{13, 14.}
8. Typische Bildstapeln haben Abmessungen von ca. 320x320x100 um (Breite x Länge x Tiefe), eine horizontale Auflösung von 0,5 &mgr; m / Pixel, und eine vertikale Auflösung von 3 pm / Pixel.
9. Nach dem Erwerb der Bildstapel, wieder das Tier in das Haus Käfig. Bitte nicht stören das Tier bis zur nächsten Verhaltens-und Imaging-Sitzung. Wiederholen Sie das Verhalten und die bildgebenden Verfahren über Tage als wünschenswerted.. Verwenden Sie die zuvor erworbenen Hirnoberfläche Blutgefäß Bild zu orientieren zurück zu der gleichen bildgebenden Lage.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Erfahrungen abhängigen molekularen Veränderungen in den einzelnen kortikalen Neuronen in lebenden Tieren zu verfolgen. Eine chronische kranialen Fenster als einem kortikalen Bereich von Interesse in einer Maus, die ein fluoreszierendes Reporterprotein der Genexpression erstellt. Zweiphotonenmikroskopie können dann mit verschiedenen Verhaltensparadigmen gekoppelt werden, um verhaltensrelevante induzierte molekulare Veränderungen einzelner Neuronen beobachten und zu v...

Diskussion

Die in-vivo-Bildgebung hier beschriebene Methode ermöglicht die wiederholte Untersuchung des Arc Veränderungen der Genexpression in den gleichen Gruppen von Neuronen über mehrere Tage im lebenden Tier. Es ist eine effiziente und vielseitige Methode, um Informationen über neuronale Plastizität verwandte molekulare Dynamik in einzelnen Neuronen in Reaktion auf verschiedene Verhaltensweisen Erfahrungen zu erhalten. Standard histochemische Verfahren wie in situ Hybridisierung und Immunfärbung kann ei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name der Einrichtung	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
FV1000 Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop	Olymp	FV1000MPE	Imaging
Dissektionsmikroskop	Omano	555V107	Chirurgie
Stereotaxis Chirurgie Bühne für Mäuse	Harvard Apparatus	726335	Chirurgie
20X oder 25X Wasser Immersionsobjektiv	Olymp	XLPL25XWMP	Imaging
Mikroskoptisch mit Kopf-Befestigungsrahmen	Maßgeschneiderte	N / A	Imaging
Feinen Pinzette	Fine Science Tools	11251-20	Chirurgie
Dentalbohrmaschinen Grat	Fine Science Tools	19007-05	Chirurgie
CCD-Kamera	QImaging	QICAM 12-Bit	Imaging