In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

Summary

שינויים מולקולריים חוויה תלויה בתאי עצב חיוניים ליכולתו של המוח להסתגל בתגובה לאתגרים התנהגותיים. In vivo שני פוטונים מתוארת כאן, המאפשרת מעקב אחר שינויים מולקולריים כאלה בנוירונים בקליפת המוח בודדים באמצעות כתבים מקודדים גנטי.

Abstract

יכולתו של המוח להשתנות בתגובה לניסיון חיונית לתפקוד המוח בריא, והליקויים בתהליך זה תורמים למגוון של הפרעות ^1,2 המוח. כדי להבין טובים יותר את המנגנונים שבאמצעותם מעגלים חשמליים במוח מגיבים לניסיון של בעל חיים דורש את היכולת לעקוב אחר השינויים המולקולריים חוויה התלויה במערך נתון של נוירונים, על פני תקופה ממושכת של זמן, בחי. למרות הניסיון והפעילות עצבית המשויך לו ידוע לגרום לשינויים בביטוי גני נוירונים ^1,2, רוב השיטות כדי לזהות שינויים כאלה אינם מאפשרים התבוננות חוזרת ונשנית של אותם נוירונים מעל ימים מרובים או אין לך רזולוציה מספיקה להתבונן נוירונים בודדים ^{3 , 4.} כאן, אנו מתארים שיטה שמשלבת בvivo מיקרוסקופ שני פוטונים עם כתב ניאון מקודד גנטי כדי לעקוב אחר שינויי ביטוי גני חוויה תלויות בנוירונים בקליפת המוח בודדים מעל במהלך ניסיוני היום יום.

אחד מהגנים ומבוססי ניסיון התלויים הוא חלבון פעילות מוסדרת cytoskeletal המשויך (ארק) ^5,6. התעתיק של Arc הוא במהירות וביותר הנגרם על ידי פעילות עצבית מוגברת ^3, והמוצר שלה החלבון מסדיר אנדוציטוזה של קולטני גלוטמט ופלסטיות ארוכת טווח הסינפטי ^7. הביטוי 'ארק כבר בשימוש נרחב כסמן מולקולרי למיפוי מעגלים עצביים מעורבים בהתנהגויות ספציפיות ^3. במרבית המחקרים אלה, ביטוי ארק זוהה על ידי כלאה באתרו או אימונוהיסטוכימיה בחלקי מוח קבועים. למרות השיטות האלה גילו כי הביטוי 'ארק היה מקומי לקבוצת משנה של הנוירונים מעוררים לאחר ניסיון התנהגותי, איך את הדפוסים הסלולר של ביטוי ארק עשויים להשתנות עם אפיזודות מרובות של חוויות חוזרות או ייחודיות מעל ימים לא נחקר. ntent "> בחי מיקרוסקופ שני פוטונים מציע דרך רבה עצמה כדי לבחון שינויים תאיים חוויה תלויה במוח החי ^8,9. כדי לאפשר בחינה של ביטוי ארק נוירונים בחיים על ידי מיקרוסקופ שני פוטונים, יצרו דפיקה בעבר בתור עכבר שבכתב GFP מוצב תחת השליטה של אמרגן ארק אנדוגני ^10. פרוטוקול זה מתאר את הכנות כירורגיות ונהלי הדמיה למעקב אחר דפוסי ביטוי Arc-GFP חוויה תלוי בהרכבים עצביים בחי. בשיטה זו , חלונות גולגולת כרוניים היו מושתלים הראשון בעכברי Arc-GFP מעל אזורי קליפת הריבית. אלה חיות אז צלמו שוב ושוב על ידי מיקרוסקופ שני פוטונים לאחר פרדיגמות התנהגות רצויה במשך כמה ימים. שיטה זו עשויה להיות רלוונטית לכלל בעלי חי נושאים כתבי ניאון אחרים של שינויים מולקולריים ניסיון תלויים ^4.

Protocol

הפרוצדורות המתוארות להלן אושרו על ידי המכון הלאומי לבריאות נפש ובריאות בעלי חי ועדת שימוש והיו בהתאם למכונים הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. הכנה לפני הניתוח

1. נקה את כל הכלים במעקר חרוז חם לפני הניתוח מזוהם, לנקות את אתר הניתוח עם אתנול 70%, והניח את כיסוי בד נקי. ללבוש כפפות סטריליות. הרדם את החיה עם 1.2% פתרון מוכן טרי Avertin, בהתחשב ב0.02 מ"ל / גרם, intraperitonially. לחלופין, להרדים בגז isoflurane דרך חרטום, 5% לזירוז, 1.5% לתחזוקה, עם מעגל נבלות פסיבית. בדקו את רמת ההרדמה באמצעות צובט זנב או בוהן כדי להבטיח הרגעה מלאה.
2. כסה את עיניו של בעלי החיים עם משחת עיניים סטרילי, ולהזריק dexamethasone המוכן טרי (0.2 מ"ג / ק"ג) וcarprofen (5 מ"ג / ק"ג) subcutaneously כדי למנוע נפיחות ודלקת מוח ^11. לגלח את השיער מעל הגולגולת בין האוזניים, ולחטא את העור עם שיחי פולידין ושלוש ספוגיות מתחלפות של אתנול 70%.
3. הר החיה בשלב ניתוח stereotaxic עם earbars, עם כרית חימום זרימת מים מתחת לקבוצת בעלי החיים ב 37 ° C. בדוק באופן סדיר רמות ההרדמה של בעלי החיים, ולהשלים את מינון חומר ההרדמה המקורי כנדרשים.
4. להזריק 200 μl של Marcaine 0.5% מתחת לעור הקרקפת כדי להרדים את האזור. חתוך העור ולהסיר את דש העור מעל הגולגולת. הסר את קרום העצם ולייבש את האזור עם ספוגיות כותנה נקיות.

2. כירורגיה חלון גולגולת כרונית

1. השתמש תרגיל שיניים במהירות גבוהה עם 0.5 מ"מ Burr עדינות להתוות עיגול בקוטר מ"מ 3-5 מעל האזור במוח של עניין. מעת לעת להרטיב את הקידוח עם 0.9% אבק מלוח וברור משם עקר עצם עם ספוגיות כותנה נקיות. אם דימומי העצם, השתמש גרמתיelfoam presoaked עם סליין סטרילי כדי לספוג את הדימום ולחכות שזה ייפסק.
2. כאשר שכבת העצם האחרונה הוא הגיע, להרים ולהסיר את אי העצם עם מלקחיים עדינים בקצוות. קבצים מצורפים דורה למדף התחתון של העצם עשויים להיתקל אם החלון חוצה תפר עצם. אלה יש להסיר בעדינות כדש העצם הרים.
3. רול טבול קצף ג'ל עדינות מעל הדורה נחשפה לניקוי פני השטח שלו ולחכות לדימום dural לעצור צעד קריטי:. לא להמשיך עד שכל דימום dural הפסיק. דם שהופך לכוד בתוך החלון גולגולתי בדרך כלל מוביל לחלון אטום.
4. אם האזור של עניין הוא במיקום שבו הדורה היא עבה במיוחד, הסרת הדורה לעיל זה עשוי להיות נחוץ. אם זה מקרה, בעדינות להפריד את הדורה מפיא למטה עם מלקחיים עדינים מאוד, לעשות חתך קטן בדורה הרימה עם עוד זוג מלקחיים עדינים, ואז לתפוס את הקצוות החתוכים ובעדינותלפצל את הדורה. הדורה היא דקה אבל חזקה, אז ייזהר לא לחתוך את המוח עם הקצוות השלמים של הדורה.
5. שטוף את האזור עם ACSF סטרילית או תמיסת מלח סטרילית.
6. שכבתי coverslip זכוכית סטרילית (3-5 מ"מ) מעל הדורה או פחז צעד קריטי:. עיקולי הגולגולת מסביב משמעותי אם, השתמש ¹² דבק Kwiksil כדי למלא את החללים שבי הדורה או הפחז לא ליצור קשר קרוב עם coverslip באזורים שלא צלם.
7. השתמש בג'ל cyanoacrylate לכסות דבק אלסטומר ואת הקצוות של coverslip הזכוכית. כיסוי כל הגולגולת החשופה עם ג'ל cyanoacrylate, או בתערובת מלט וkrazyglue שיני צעד קריטי:. אל תאפשרו לאף ג'ל cyanoacrylate כדי לגעת במשטח המוח.
8. שבץ בר מחוייט מתכת ראש קיבוע בקצה השני של הגולגולת.
9. להחזיר את החיה לחדר התאוששות חם, לאחר הזרקת intraperitonial של ketoprofen, 5 מ"ג / ק"ג, חצניהול כאב r. המשך משכך כאבים לעוד ימים שלאחר ניתוח.
10. אחרי שבועות של החלמה שלאחר הניתוח, להרדים את החיה עם isoflurane (5% לזירוז, 1.5% לתחזוקה), להרכיב אותה בשלב מיקרוסקופ מחוייט עם מסגרת ראש קיבעון, ובדוק את החלון גולגולתי לבהירות אופטית תחת תאורה עם אור כחול. בהירות כלי דם משטח המוח מעידה מאוד של איכות חלון גולגולתי. אם את קצות כלי הדם מוגדרים בחדות, החלון עשוי להיות שמיש. זמן ההחלמה לאחר הניתוח של השבועות מומלץ לאפשר מספיק זמן לחיה כדי להתאושש מניתוח. חלונות גולגולת בדרך כלל לנקות ולשפר בזמן הזה, ולהישאר שקוף אופטי לשבועות נוספים לחודשים, עד לצמיחה מחודשת של גולגולת או עיבוי של הדורה מדרדרת איכות חלון.

3. פרוטוקול וליזר התנהגות סריקה מיקרוסקופי שני פוטונים

1. חיות עם ג הברורחלונות ranial יהיו חשופים לגירוי סביבתי או נתון לאימון התנהגותי, ולאחר מכן צלמו לאחר מכן בעת ​​הביטוי מקסימאלי Arc-GFP. לפני תחילת פרוטוקול התנהגותי, בעלי החיים צריכים להיות כל זמן בסביבת כלוב הביתה עקבית למזער וריאציה מהיום ליום ברמות ביטוי Arc-GFP בנקודת ההתחלה.
2. בגין אימון התנהגותי או פרדיגמות גירוי סביבתיות, בהתאם לאזור במוח של עניין. לדוגמה, בעלי חיים יכולים להיות חשופים לסביבה חזותית שונה על פני ימים רצופים, וצלמו בכל יום לאחר גירוי חזותי כדי לזהות תגובות לגירוי ספציפיים בקליפת המוח הראייתית ^10.
3. Arc-GFP פלואורסצנטי בנוירונים בדרך כלל יגיע לרמת שיא שעות לאחר גירוי. ציר הזמן הניסיוני עשוי להיות מותאם כדי להקל על זיהוי של ביטוי Arc-GFP בתאי עצב ברמות קרינת השיא שלהם.
4. לאחר אימון התנהגותי או environmentaגירוי l הושלם, להרדים את החיה עם isoflurane (5% לזירוז, 1.5% לתחזוקה) ולצאת לחיים בשלב מיקרוסקופ מחוייט עם מסגרת ראש קיבעון מתחת למיקרוסקופ שני פוטונים.
5. תנוחת הראש של החיה קבועה למסגרת ראש הקיבוע שמתחבר ישירות לבמה, תוך שימוש בסרגל המתכת המושתלת בגולגולת. Isoflurane וחמצן מסופקים ברציפות לעכבר בחרטום. טמפרטורת גוף נשמרת באמצעות כרית חימום.
6. ודא כי גלאי מיקרוסקופ מוגנים מפני אור הסביבה על ידי ביצוע סריקת ליזר שני פוטון בחדר חשוך. השתמש 20x או 25x (1.05 צמצם מספרי) עדשת טבילה במים להדמיה. ראשית, תחת תאורה עלית פלואורסצנטי, לרכוש תמונה של דפוסי כלי הדם על פני השטח מעל האזור במוח עניינים עם מצלמת CCD ליישור תמונת עתיד.
7. התחל ליזר שני פוטוני סריקה לרכוש מחסנית תמונה 3-D. אולימפוס FV1000מיקרוסקופ רב פוטון MPE משמש בהגדרה שלנו. גל באורך העירור של ליזר שני הפוטונים מוגדר בננומטר 920, ואת כוחו של הליזר המופק ממטרה מוגדר בכ 50 mW. פלואורסצנטי נפלט הוא זוהה במקביל בערוצים ירוקים ואדום (ראי Dichroic ב570 ננומטר, מסנני מכשול ב495-540 ננומטר ו570-625 ננומטר), תוך שימוש במערכת חיצונית שני ערוצי photomutiplier זיהוי הממוקם קרוב לדגימה. Arc-GFP פלואורסצנטי מופיע רק במסלול הירוק, ואילו רקמות האוטומטיות פלואורסצנטי מופיעה בשני ערוצים ^{13, 14.}
8. ערימות תמונה אופייניות בממדים של כ 320x320x100 מיקרומטר (רוחב x אורך x עומק), ברזולוציה אופקית של 0.5 מיקרומטר / פיקסלים וברזולוציה אנכית של 3 מיקרומטר / פיקסל.
9. לאחר שרכש את מחסנית התמונה, להחזיר את בעל חיים לכלוב בבית שלה. אל תפריעו לחיים עד התנהגותית הבאים ומפגש הדמיה. חזור על ההתנהגות והליך הדמיה פני ימים כדסירed. השתמש בתמונה רכשה בעבר במוח פני השטח של כלי הדם כדי לכוון חזרה לאותו מיקום הדמיה.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר שיטה למעקב אחר שינויים מולקולריים חוויה תלויה בנוירונים בקליפת מוח בודדים בבעלי חיים. חלון גולגולתי כרוני נוצר לראשונה מעל אזור קליפת מוח של עניין בעכבר נושא כתב ניאון של ביטוי גנים. מיקרוסקופ שני פוטונים אז יכול להיות בשילוב עם פרדיגמות התנהגות...

Discussion

בשיטת הדמית vivo המתוארת כאן מאפשר בדיקה חוזרת של שינויי ביטוי גני Arc באותם סטים של תאי עצב מעל ימים מרובים בחי. זה הוא שיטה יעילה ותכליתית כדי להשיג מידע על דינמיקה מולקולרית הקשורים לפלסטיות עצבית בנוירונים בודדים בתגובה לחוויות התנהגותיות שונות. שיטות סטנ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם הציוד	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
FV1000 מיקרוסקופ סריקת ליזר רב פוטון	אולימפוס	FV1000MPE	הדמיה
מיקרוסקופ נתיחה	Omano	555V107	כירורגיה
שלב הניתוח Stereotaxis לעכברים	הרווארד Apparatus	726335	כירורגיה
20X או מטרת טבילה במי 25X	אולימפוס	XLPL25XWMP	הדמיה
שלב מיקרוסקופ עם מסגרת ראש קיבעון	Custom made	N /	הדמיה
מלקחי פיין	כלי מדע פיין	11251-20	כירורגיה
שיני תרגיל זמזום טורדני	כלי מדע פיין	19007-05	כירורגיה
מצלמת CCD	QImaging	QICAM 12-bit	הדמיה