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Method Article
* Estos autores han contribuido por igual
Este procedimiento muestra cómo aislar del cerebro del ratón adulto las membranas de las mitocondrias ER-asociados o mams y los glucoesfingolípidos fracciones enriquecidas microdominio de MAM y preparaciones mitocondriales.
Orgánulos intracelulares son estructuras altamente dinámicas con diferentes forma y composición, que son sometidos a células específicas de señales intrínsecas y extrínsecas. Sus membranas son a menudo yuxtapuestos en sitios de contacto definidas, que se convierten en los cubos para el intercambio de moléculas de señalización y los componentes de membrana 1,2,3,4. Los inter-organellar microdominios de membrana que se forman entre el retículo endoplasmático (ER) y la mitocondria en la apertura de la Ca IP3-2 sensible son conocidos canal + como las mitocondrias asociado-ER membranas o MAMS 4,5,6. La composición de proteína / lípido y propiedades bioquímicas de estos sitios de membrana de contacto han sido ampliamente estudiados en particular en relación con su papel en la regulación intracelular de Ca 2 + 4,5,6. El ER sirve como el almacén principal de la concentración de Ca 2 +, y en esta capacidad regula una gran variedad de procesos celulares aguas abajo de Ca 2 + señalización, including post-traduccional plegamiento de la proteína y proteína maturation7. Las mitocondrias, por otra parte, mantener la homeostasis del Ca 2 +, por la precarga de concentración citosólica de Ca 2 + evitando de este modo la iniciación de las vías de apoptosis aguas abajo de Ca 2 + desequilibrio 4,8. La naturaleza dinámica de los mames hace sitios ideales para diseccionar los mecanismos básicos celulares, incluyendo Ca 2 + señalización y regulación mitocondrial de Ca 2 + concentración supervivencia, la biosíntesis de lípidos y el transporte, la energía y el metabolismo celular 4,9,10,11,12. Varios protocolos se han descrito para la purificación de estos microdominios de tejido hepático y células cultivadas 13,14.
Tomando los métodos publicados anteriormente en cuenta, se ha adaptado un protocolo para el aislamiento de las mitocondrias y MAM desde el cerebro de ratón adulto. Para este procedimiento se ha agregado una etapa de purificación adicional, a saber, una extracción de Triton X100, que enables el aislamiento de la glicoesfingolípido enriquecido microdominio (GEM) de la fracción de los mames. Estas preparaciones GEM comparten varios componentes de proteínas con balsas caveolas y lípidos, derivados de la membrana de plasma u otras membranas intracelulares, y se proponen para funcionar como puntos de encuentro para el agrupamiento de proteínas receptoras y para las interacciones proteína-proteína 4,15.
El siguiente protocolo está diseñado para el aislamiento y purificación de MAM y gemas de cerebro de ratón
Soluciones necesario para el aislamiento de las mitocondrias, MAM y gemas
Fraccionamiento de obtener preparación mitocondrial crudo:
Solución A: 0,32 M sacarosa, 1 mM NaHCO 3, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl 2 + Inhibidores de la proteasa (añada fresca, según sea necesario)
Solución B: 0,32 M de sacarosa, 1 mM NaHCO 3 + Inhibidores de la Proteasa (agregar fresco, según sea necesario)
MAM aislamiento:
Medio de aislamiento: 250 mM de manitol, 5 mM de HEPES, pH 7,4, 0,5 mM EGTA, 0,1% BSA
Tampón de gradiente: 225 mM de manitol, 25 mM de HEPES, pH 7,5, 1 mM EGTA, 0,1% BSA (concentración final)
GEMs aislamiento:
contenido "> GEM tampón de extracción: 25 mM HEPES pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1% de Triton X-100 + Inhibidores de la Proteasa (agregar fresco, según sea necesario)GEM solubilizantes Tampón: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5 mM EDTA, 1% SDS + inhibidores de proteasa (agregar fresco, según sea necesario).
1. Fraccionamiento subcelular Primer Paso: Las células de eliminación de los núcleos, no lisadas y restos celulares
Nota: Mantenga mitades del cerebro separado a lo largo de todo el procedimiento. Lo siguiente se aplica para el tratamiento de un medio único cerebro.
2. Segundo Paso: Aislamiento mitocondrias crudo
3. Aislamiento de mitocondrias asociada a la membrana ER, MAM
* Nota: Asegúrese de tampón de gradiente más concentrado (1,43 veces) para lograr la correcta concentración final después diluting Percoll al 30%.
Nota: En este paso, es posible que también se centrifuga a 100.000 xg durante 1 hora a 4 º C, el sobrenadante guardado en el paso 2.6. El sedimento será la fracción de ER y el sobrenadante de la fracción citosólica.
4. Extracción de glicoesfingolípidos-microdominios enriquecidos, gemas
Basándonos en nuestra experiencia con el uso de este protocolo con seguridad puedo recomendar para el aislamiento y purificación de MAM, gemas y fracciones mitocondriales de cerebro de ratón. El procedimiento presentado es altamente reproducible y consistente. En la Figura 1 se muestra una imagen representativa de la forma pura capa de mitocondrias y MAM en un gradiente de Percoll (paso 3,4). De una banda definida, lechoso que contiene purificó mitocondrias (Mito-P) se segrega en la parte inferior d...
Los sitios de contacto entre las membranas intracelulares o entre orgánulos y la membrana plasmática de las células dinámicas representan plataformas de señalización para los procesos celulares básicos. La caracterización exacta de su función y composición, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas requiere protocolos de purificación fiables y reproducibles. Los métodos detallados aquí han sido específicamente optimizada por nuestro laboratorio para el aislamiento y purificación de los MAM y su...
Ninguno de los autores tiene conflicto de intereses que declarar.
Reconocemos la contribución de Renata Sano en la concepción del protocolo inicial. Ad'A. contiene los joyeros de la Infancia (JFC) Cátedra de Genética y Terapia Génica. Este trabajo fue financiado en parte por el NIH subvenciones GM60905, DK52025 y CA021764, y los americanos libaneses Caridades sirios asociados (ALSAC).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nombre del reactivo / material | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
REACTIVOS | |||
Fraccionamiento | |||
Sacarosa | Fisher Scientific | S5-500 | |
Bicarbonato de Sodio | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
Cloruro de magnesio, hexahidratado | Fisher Scientific | BP214-500 | |
Cloruro de calcio, dihidrato | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
MAM | |||
D-Manitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
BSA, fracción V, choque térmico, liofilizado | Roche | 03-116-964-001 | |
Percoll | GE | 17-0891-02 | |
GEM | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
Cloruro de Sodio | Fisher Scientific | S271-3 | |
Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
Dodecil sulfato de sodio (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
Común | |||
Inhibidores de Proteasa Tablets, Complete EDTA libre | Roche | 11-873-580-001 | |
EQUIPO | |||
2 ml Douce All-Glass Grinders tejido | Kimble Chase | 885300-0002 | |
15 ml tubos de polipropileno cónicos de centrífuga, BD Falcon | BD | 352097 | |
30 ml de fondo redondo de vidrio Tubos centrífuga | Kimble Chase | 45500-30 | |
15 ml de fondo redondo de vidrio CentriTubos Fuge | Kimble Chase | 45500-15 | |
Tubos de ultracentrífuga, con claridad, espesores, mm 14x89 | Beckman-Coulter | 344059 | |
Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
Disposable vidrio borosilicato Pipetas Pasteur, 9 " | Fisher Scientific | 13-678-20C |
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