미토콘드리아 - 관련 ER의 멤브레인 (MAMs)와 Glycosphingolipid 강화 Microdomains (보석) : 마우스 뇌에서 절연

요약

이 절차는 성인 마우스 뇌 미토콘드리아 - 관련 ER의 멤브레인 또는 MAMs 및 MAMs과 mitochondrial 준비에서 glycosphingolipid 강화 microdomain 분수에서 분리하는 방법을 보여줍니다.

초록

세포 세포 소기관은 모양과 셀 별 고유 및 외부 신호를 받게 아르 구성을 변화와 고도의 동적 구조입니다. 그들의 멤브레인은 종종 신호 분자와 막 구성 요소 ^1,2,3,4의 교환을위한 허브가 정의 연락처 사이트에서 juxtaposed 있습니다. endoplasmic 소포체 (ER)와 ⁺ 채널이 미토콘드리아 관련-ER 멤브레인 또는 MAMs ^4,5,6로 알려져 있습니다 IP3에 민감한 칼슘 ² 개구에서 미토콘드리아 사이에 형성되는 간 organellar 막 microdomains. 단백질 / 지질 조성과 이러한 멤브레인 연락처 사이트의 생화학 특성을 광범위하게 특히 세포 내 칼슘 ^{2 + 4,5,6을} 조절에서의 역할과 관련하여 연구되었습니다. ER은 ^+,이 용량에서 ^칼슘이 세포의 하류 공정의 무수한을 조절 세포 칼슘 ^(2)의 기본 저장소 역할을 ⁺ 신호, incl포스트 병진 단백질 접힘, 단백질 maturation7을 uding. 미토콘드리아, 다른 한편으로,이를 통해 하류 칼슘 ^{2 +} 불균형 ^4,8의 apoptotic 경로의 개시를 방지 cytosolic 칼슘 ^{2 +} 농도를 버퍼링하여 칼슘 ^{2 +} 항상성을 유지하고 있습니다. MAMs의 동적 특성은 그들에게 이상적인 사이트는 칼슘 ^{2 +} 신호와 mitochondrial 칼슘 ^{2 +} 농도, 지질 생합성 및 수송, 에너지 신진 대사와 세포 생존 ^4,9,10,11,12 규제 등의 기본적인 세포 메커니즘을 해부 할 수 있습니다. 여러 프로토콜은 간 조직 및 배양 세포 ^13,14에서 이러한 microdomains의 정화에 대한 설명되었습니다.

계정에 이전에 다음 ID로 출판 방법을 복용, 우리는 성인 마우스의 뇌에서 미토콘드리아와 MAMs의 절연을위한 프로토콜을 적응하고 있습니다. 이 절차에 우리는 추가 정화 단계, 즉 트리톤의 X100 추출을 추가하는 전자nables MAMs의 glycosphingolipid 강화 microdomain (GEM) 분수의 고립. 이러한 GEM의 준비가 플라즈마 막 나 다른 세포 세포막에서 유래 caveolae과 지질 보트와 여러 단백질 구성 요소를 공유하고 수용체 단백질의 클러스터링에 대한 포인트를 수집처럼 단백질 단백질 상호 작용 ^4,15에 대한 작동하도록 제안하고 있습니다.

프로토콜

다음 프로토콜은 마우스 뇌에서 MAMs과 보석의 절연 및 정화를위한 것입니다

솔루션은 미토콘드리아, MAMs와 보석의 절연이 필요

분류 원유 mitochondrial 준비를 얻기 위해 :

솔루션 A : 0.32 M의 자당, 1 MM NaHCO _3, 1 MM MgCl _2, 0.5 MM CaCl ₂ + 프로테아제 저해제 (필요에 따라, 신선한 추가)

솔루션 B : 0.32 M의 자당, 1 MM NaHCO ₃ + 프로테아제 저해제 (필요에 따라, 신선한 추가)

MAMs 절연 :

절연 매체 : 250 MM 마니 톨, 5 밀리미터 HEPES의 산도 7.4, 0.5 MM EGTA, 0.1 % BSA

그라디언트 버퍼 : 225 MM 마니 톨, 25 밀리미터 HEPES의 산도 7.5, 1 ㎜ EGTA, 0.1 % BSA (최종 농도)

보석 절연 :

내용 "> GEM 추출 버퍼 : 25 MM HEPES 산도 7.5, 0.15 M NaCl, 1 % 트리톤 X-100 + 프로테아제 저해제 (필요한 경우, 신선한 추가)

GEM Solubilising 버퍼 : 50 MM 트리스 - HCL, pH를 8.8, 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % SDS + 프로테아제 저해제 (필요에 따라, 신선한 추가).

1. 첫 번째 단계 Subcellular 분류 : 핵의 제거, Unlysed 세포와 세포 파편

1. CO ₂ 챔버에 마우스를 안락사시켜야.
2. 즉시 뇌를 제거 절반, 얼음에서 2 ML 튜브에 넣고 무게.

참고 : 전체 절차를 통해 뇌 절반은 별도의 유지. 다음은 하나의 뇌의 절반의 치료에 적용됩니다.

3. 한 ML 차가운 솔루션 A.이 큰 통관 유봉의 15 총 스트로크와 균질화가 포함 된 사전 차가운 두 ML 유리 다운스 호 모지 조직 분쇄기의 장소 반 뇌.
4. 얼음에 15 ML 팔콘 튜브에 전송하고 희석10 권 w / V, 예를 들어 0.225 g에 2.25 ML까지 homogenates.
5. 4에 10 분에 1,400 XG에서 샘플을 원심 분리기 ° C.
6. 조심스럽게 얼음에 표면에 뜨는과 30 ML 둥근 바닥 유리 원심 분리기 튜브로 전송을 제거합니다. 펠렛을 방해하지 않도록하십시오.
7. 솔루션 같은 10 권의 펠렛을 Resuspend. 작은 통관 유봉, 한 번에 1 ML의 3-6 뇌졸중과 같은 그라인더에 균질화.
8. 4에 10 분 ° C.에 710 XG에 신선한 15 ML 팔콘 튜브와 원심 분리기로 전송 핵 및 세포 파편의 펠렛에있는이 결과.
9. 주의 단계 1.6에서 저장 한 표면에 뜨는있는 표면에 뜨는과 수영장을 제거합니다.

2. 두 번째 단계 : 조잡 미토콘드리아 절연

1. 4에 10 분에 13,800 XG에서 supernatants을 원심 분리기 ° C.
2. 얼음에 울트라 클리어 Beckman의 원심 분리기 튜브를 표면에 뜨는 전송
3. Resuspend 펠릿 10 권 솔루션에. 작은 통관 유봉, 한 번에 1 ML의 3-6 뇌졸중과 같은 그라인더에 균질화.
4. 단계 2.1로 원심 분리기.
5. 단계 2.2-2.4를 반복합니다.
6. 그 결과 펠렛은 풍부한 mitochondrial 분수입니다. 풀 supernatants (세포 기질 및 ER), parafilm으로 커버하고 얼음 계속.
7. 작은 통관 유봉 6 획으로 펠렛을 Resuspend, 4.8에 ML / g는 신선한 homogeniser에 솔루션 B의 (g는 원래 뇌의 무게라고합니다).
8. 유리 파스퇴르 피펫 사용하여, 신중하게 다음과 같이 관의 맨 ​​아래에이어서 추가 더 거품이 형성되지 않습니다 보장 울트라 클리어 Beckman의 원심 분리기 튜브에서 불연속 자당의 그라디언트를 준비 :
   Resupended 펠렛 (0.32 M의 자당)
   3 ML 850 밀리미터 자당 (1 MM NaHCO ₃₎
   3 ML 1 M의 자당 (1 MM NaHCO ₃₎
   3 ML 1.2 M의 자당 (1 MM NaHCO에서3)
9. 4 ° C.에서 2 시간에 82,500 XG에 원심 분리기 그라디언트의 끝에서 그 결과 분리는 세 밴드와 펠렛 생산합니다 : - 2) ER, Golgi, 플라즈마 멤브레인 (0.85 M - 1 M 인터페이스) 0.85 M 인터페이스) 1) myelin 및 기타 막 오염 물질을 (0.32 M, 3) synaptosomes (1 M - 1.2 M 인터페이스), 4) 미토콘드리아 원유 (펠렛) 이후 정화 단계에 사용되는

3. 미토콘드리아 - 관련 ER 막의 절연, MAMs

1. 갓 추가 단백 분해 효소 억제제를 포함하는 두 ML 절연 매체에 하나의 뇌 절반에서 미토콘드리아 갓 고립 된 원유를 Resuspend.
2. 그라데이션 버퍼 8 이분의 일 뇌 당 ML, 그리고 울트라 클리어 Beckman의 원심 분리기 튜브의 장소와 30 % Percoll 기울기를 준비합니다.

* 참고 : D 후 정확한 최종 농도를 달성하기 위해 (1.43 배) 기울기 버퍼가 더 집중하기30 % Percoll을 iluting.

3. 준비된 기울기 상단에 레이어 mitochondrial 정지는 천천히 모든 거품을 방지합니다.
4. 30 분, 4 ° C.에 95,000 XG에 원심 분리기
5. 1. 유리 파스퇴르 피펫으로 FIRST 중공업 비율 (낮은 밴드)를 제거하고 신선한 왕복 아래 유리관에 전송, 얼음.
   2. 또 다른 유리 파스퇴르 피펫 두 번째는 빛 분수 (위 밴드)를 제거하고 얼음에 별도의 신선한 왕복 아래 유리관에 전송할 수 있습니다.
6. 4에 10 분에 6,300 XG에서 10 ML 절연 매체와 원심 분리기와 단계 3.5 수집 된 두 분수 ° C.를 희석
7. 단계 3.6에서 얻어진 중공업 비율의 표면에 뜨는 폐기하십시오 다른 10 ML 절연 매체로 펠렛을 resuspend과 단계 3.6로, 다시 원심 분리기. 그 결과 펠렛은 순수 mitochondrial 분율 될 것입니다.
8. 빛 Frac에서 표면에 뜨는을 전송기가 얼음에 울트라 클리어 Beckman의 원심 분리기 튜브에 단계 3.6에서 얻은. 펠렛을 폐기하십시오.
9. 1 시간, 4 ° C.에 100,000 XG의 튜브와 원심 분리기를 작성 단계 3.8에서 얻어진 표면에 뜨는에 충분한 절연 매체를 추가 그 결과 펠렛은 MAMs 분수됩니다. 조심스럽게 표면에 뜨는을 제거하고 폐기합니다.

참고 :이 단계에서, 여러분은 또한 1 시간, 4 십만 XG에 원심 분리기 수 있습니다 ° C 단계 2.6에서 저장 한 표면에 뜨는. 펠렛은 ER 분수이어야하며 Cytosolic 일부를 표면에 뜨는 것입니다.

4. Glycosphingolipid 강화 Microdomains, 보석 추출

1. 얼음에 20 분에 추출 버퍼 500 μl-1 ML에 순수 미토콘드리아 및 / 또는 이맘 분수를 Lyse.
2. 4에서 2 분에 15,300 XG에 lysates을 원심 분리기 ° C.
3. supernatants (트리톤 X-100 수용성 물질)와 다시 원심 분리기 알약을 수집2 분에 용해 물질을 남아 제거합니다. (트리톤 X-100은 미토콘드리아 추출 및 / 또는 트라이 튼 X-100 추출 MAMs).
4. 버퍼 Solubilising에서 알약을 Solubilize. 이 solubilized 자료는 GEM의 분수를 상징하며 추가적인 분석을 위해 사용할 수 있습니다.

결과

우리가 안전하게 MAMs, 보석 및 마우스의 뇌에서 mitochondrial 분수의 절연 및 정화를 위해 추천 할 수 있습니다이 프로토콜을 사용하여와의 경험을 바탕으로. 명시된 절차는 매우 재현과 일치합니다. 그림 1에서 우리는 Percoll 기울기 (단계 3.4)의 방법으로 순수 미토콘드리아와 MAMs 층의 대표 이미지를 보여줍니다. 이맘 분율은 미토콘드리아 위의 확산과 폭 넓은 대역을 구성하는 동안 포?...

토론

세포 멤브레인 간 또는 세포 소기관과 세포의 플라즈마 막 사이의 접촉의 사이트는 기본 세포 프로세스에 동적 신호 플랫폼을 나타냅니다. 생리학 및 병리학 조건 모두에 따라 자신의 기능과 구성의 정확한 특성은 안정적이고 재현 정화 프로토콜이 필요합니다. 여기에 설명 된 방법은 특별히 성인 마우스의 뇌에서 MAMs와 해당 보석의 절연 및 정화를 위해 우리 실험실에서 최적화되었습니다. 이 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약 / 재료의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
			시약
			분류
자당	피셔 과학	S5-500
나트륨 중탄산염	시그마 - 알드리치	S-5761
염화 마그네슘, Hexahydrate	피셔 과학	BP214-500
칼슘 염화물, 이수화	시그마 - 알드리치	C-5080
			이맘
D-마니 톨	시그마 - 알드리치	M9546-250G
Hepes	피셔 과학	BP310-500
EGTA	시그마 - 알드리치	E4378-250G
BSA, 분수 V, 열 충격은 Lyophilizate	로슈	03-116-964-001
Percoll	GE	17-0891-02
			GEM
트리톤 X-100	시그마 - 알드리치	T9284-500 ML
나트륨 염화물	피셔 과학	S271-3
트리스베이스	로슈	03-118-142-001
HCL	피셔 과학	A144S-500
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)	피셔 과학	BP120-500
나트륨 Dodecyl의 황산 (SDS)	피셔 과학	BP166-500
			공통의
전체 단백 분해 효소 저해제의 태블릿, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료	로슈	11-873-580-001
			장비
2 ML 조용한 전체가 유리로 조직 분쇄기	킴블 체이스	885300-0002
15 ML의 폴리 프로필렌 원뿔형 원심 분리기 튜브, BD 매	BD	352097
30 ML 라운드 - 하단 유리 원심 분리기 튜브	킴블 체이스	45500-30
15 ML 라운드 - 하단 유리 Centrifuge 튜브	킴블 체이스	45500-15
Ultracentrifuge 튜브, 울트라 클리어, Thinwall, 14x89 mm	Beckman - 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날	344059
Parafilm	콜 - Parmer	PM996
일회용 붕규산 유리 파스퇴르 (Pasteur) Pipets, 9 "	피셔 과학	13-678 - 20C