ממברנות המיטוכונדריה הקשורים ER (MAMs) וMicrodomains Glycosphingolipid המועשר (אובניים חן): בידוד ממוח עכבר

Summary

הליך זה מדגים כיצד לבודד מהמוח המבוגר עכבר קרומי המיטוכונדריה או MAMs הקשורים ER וmicrodomain המועשרים glycosphingolipid השברים מMAMs ותכשירי המיטוכונדריה.

Abstract

האברונים תאיים הם מבנים דינמיים מאוד עם צורות שונות ובהרכב, שכפופים לרמזים פנימיים וחיצוניים של תאים ספציפיים. הקרומים שלהם לעתים קרובות באתרי juxtaposed מגע מוגדר, אשר הופכים לרכזות חילופי מולקולות איתות ורכיבי קרום ^1,2,3,4. את microdomains הקרום בין organellar שנוצרו בין reticulum endoplasmic (ER) ואת המיטוכונדריה בפתיחת Ca IP3 הרגיש ^{2 +} ערוץ ידוע כמו קרומים קשורים-ER מיטוכונדריה או MAMs ^4,5,6. רכב חלבונים / שומנים והתכונות הביוכימיות של אתרי מגע קרום אלה נחקרו רבים בעיקר בהקשר לתפקידם בוויסות התאי Ca ^{2 + 4,5,6.} ER משמש כחנות העיקרית של Ca ^{2 +} התאי, ובמסגרת זו מווסתת מספר עצום של תהליכים תאיים במורד זרם של Ca ^{2 +} איתות, כוללuding מתקפל וחלבון maturation7 חלבון שלאחר translational. המיטוכונדריה, לעומת זאת, לשמור על Ca ^{2 +} הומאוסטזיס, על ידי אגירת cytosolic Ca ^{2 +} ריכוז ובכך למנוע את החניכה של מסלולים אפופטוטיים במורד הזרם של Ca ^{2 +} איזון ^4,8. האופי הדינמי של MAMs הופך אותם אידיאליים אתרים לנתח מנגנונים תאיים בסיסיים, כולל Ca ^{2 +} איתות ובקרה של המיטוכונדריה Ca ^{2 +} ריכוז, ביוסינתזה שומנים ותחבורה, חילוף חומרים של אנרגיה ותא הישרדות ^{4,9,10,11,12.} כמה פרוטוקולים שתארו לטיהור microdomains אלה מרקמת כבד ותאים בתרבית ^13,14.

לוקח שיטות שפורסמו בעבר בחשבון, יש לנו מותאם פרוטוקול לבידוד של המיטוכונדריה וMAMs ממוח העכבר הבוגר. להליך זה יש לנו הוספתי שלב נוסף טיהור, כלומר מיצוי x100 טריטון, שדוארnables הבידוד של שבריר glycosphingolipid המועשר microdomain (GEM) של MAMs. הכנות GEM אלה חולקים מספר מרכיבי חלבון עם רפסודות caveolae ושומנים בדם, הנגזרות מקרום הפלזמה או קרומים תאיים אחרים, והציעו לשמש איסוף נקודות עבור האשכולות של חלבוני הקולטן ולאינטראקציות בין חלבונים ^4,15.

Protocol

הפרוטוקול הבא מיועד לבידוד והטיהור של MAMs ופנינים ממוח העכבר

פתרונות הנדרשים לבידוד, MAMs ופניני מיטוכונדריה

חלוקה להשיג הכנת המיטוכונדריה גולמית:

פתרון: סוכרוז 0.32 מ ', 1 המ"מ ₃ NaHCO, 1 המ"מ MgCl _2, 0.5 מ"מ CaCl ₂ + מעכבים פרוטאז (להוסיף טרי, לפי צורך)

פתרון ב ': סוכרוז 0.32 מ', 1 המ"מ NaHCO ₃ + מעכבי פרוטאז (להוסיף טרי, לפי צורך)

בידוד MAMs:

בידוד בינוני: 250 המ"מ מניטול, pH 5 המ"מ HEPES 7.4, 0.5 המ"מ EGTA, 0.1% BSA

מאגר השיפוע: 225 המ"מ מניטול, pH 25 המ"מ HEPES 7.5, 1 המ"מ EGTA, 0.1% BSA (ריכוז סופי)

בידוד פנינים:

תוכן "> הצפת חילוץ GEM: 25 HEPES mM pH 7.5, 0.15 מ 'NaCl, 1% Triton X-100 + מעכבי פרוטאז (להוסיף טרי, לפי צורך)

מאגר GEM Solubilising: 50 mM טריס-HCl, 8.8 pH, 5 המ"מ EDTA, 1% SDS + מעכבי פרוטאז (להוסיף טרי, לפי צורך).

1. היפוך חלוק ראשון שלב subcellular: הסרה של גרעינים, תאי Unlysed ופסולת ניידת

1. להרדים את העכבר בתא ₂ CO.
2. מייד להסיר מוח, לחצות, להניח ב2 צינורות מ"ל על קרח ולשקול.

שים לב: שמור על חצי מוח נפרד לאורך כל ההליך. להלן חל על הטיפול בחצי מוח אחד.

3. מוח מניח מחצית במטחנה מראש מצוננת 2 מיליליטר זכוכית Dounce רקמות המכילה א פתרון 1 מ"ל הקר הומוגני עם 15 משייכות כוללות של עלי פינוי גדול.
4. העברה לצינור 15 מ"ל בז, על קרח, ולדללhomogenates עד 10 כרכים w / v, למשל 0.225 גרם לרמה של 2.25 מ"ל.
5. צנטריפוגה מדגם ב 1400 XG עבור 10 דקות ב 4 ° C.
6. הסר בזהירות את supernatant והעברה לצינור צנטריפוגה זכוכית עגולה עם תחתית 30 מ"ל, על קרח. הקפד לא להפריע לגלולה.
7. Resuspend הגלולה באותן 10 כרכים של פתרון. הומוגני באותה המטחנה, עם 3-6 משייכות של עלי סיקול קטן, 1 מ"ל בכל פעם.
8. העברה לצינור טרי 15 מ"ל בז וצנטריפוגה XG ב 710 עבור 10 דקות ב 4 ° C. התוצאה היא גלולה של גרעינים ופסולת של תאים.
9. הסר בזהירות את supernatant וברכה עם supernatant שמר בשלב 1.6.

2. שלב שנייה: בידוד המיטוכונדריה גולמי

1. צנטריפוגה supernatants ב13800 XG עבור 10 דקות ב 4 ° C.
2. העברת supernatant לצינור צנטריפוגה Beckman-Ultra Clear, על קרח
3. Resuspend גלול ב 10 כרכי פתרון. הומוגני באותה המטחנה, עם 3-6 משייכות של עלי סיקול קטן, 1 מ"ל בכל פעם.
4. צנטריפוגה כצעד 2.1.
5. חזור על שלבים 2.2-2.4.
6. הגלולה המתקבלת היא שבריר המיטוכונדריה מועשרת. ברכה את supernatants (cytosol ומיון), מכסה בparafilm ולשמור על קרח.
7. Resuspend הגלולה עם 6 משייכות של עלי סיקול קטן, ב4.8 המ"ל / גרם (ז נקרא משקל המוח המקורי) של הפתרון של B, בhomogeniser טרי.
8. שימוש pipettes הזכוכית פסטר, להכין Gradient סוכרוז רציף בצינורות צנטריפוגה Beckman-Ultra Clear, והוסיף מאוחר יותר לחלק התחתון של הצינור כדלקמן, בזהירות, להבטיח ללא בועות נוצרות:
   Resupended הגלולה (0.32 סוכרוז M)
   3 המ"ל סוכרוז 850 מ"מ (במ"מ ₃ NaHCO 1)
   3 סוכרוז מ"ל 1 M (במ"מ ₃ NaHCO 1)
   3 1.2 המ"ל סוכרוז M (במ"מ NaHCO 13)
9. צנטריפוגה ב XG 82500 ל2 שעות ב 4 ° C. הפרדת התוצאה בסוף השיפוע תהיה לייצר שלוש להקות וגלולות: 1) המיאלין ומזהמים אחרים בממברנה (0.32 מ - 0.85 ממשק M), 2) ER, Golgi, קרום פלזמה (0.85 מ '- 1 ז ממשק); 3) synaptosomes (1 מ - 1.2 מ 'ממשק): 4) גולמי המיטוכונדריה (גלולה) המשמש לטיהור הצעדים הבאים

3. בידוד של ממברנה ER-המיטוכונדריה משויכת, MAMs

1. Resuspend גולמי מיטוכונדריה המבודדת טרי מהחצי מוח אחד, בבידוד בינוני מ"ל 2 המכילים מעכבי פרוטאז הוסיפו טרי.
2. הכן 30% שיפוע עם Percoll מיליליטר Gradient המאגר 8 לכל חצי מהמוח, ומקום בTube צנטריפוגה Beckman-Ultra Clear.

* הערה: ודא חיץ שיפוע מרוכז יותר (1.43 ימים) כדי להשיג ריכוז סופי נכון אחרי דiluting Percoll עד 30%.

3. השעית המיטוכונדריה שכבה על גבי שיפוע מוכן לאט, כדי למנוע בועות.
4. צנטריפוגה ב XG 95000 למשך 30 דקות, 4 ° C.
5. 1. הסר את הבר הכבד (רצועה תחתונה) הראשון עם זכוכית פיפטה פסטר ולהעביר לצינור זכוכית עגולה בתחתית טרי, על קרח.
   2. הסר את בר האור (רצועה העליונה) השני עם זכוכית פיפטה פסטר אחר ולהעביר לשפופרת זכוכית נפרדת טריה ישבן עגול, על קרח.
6. למהול שני השברים שנאספו בשלב 3.5 עם 10 מ"ל בינוני בידוד וצנטריפוגה XG ב 6300 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
7. השליכו את supernatant מהבר הכבד הושג בשלב 3.6, resuspend הגלולה עם בידוד בינוני עוד 10 מ"ל וסרכזת שוב, כצעד 3.6. הגלולה שתתקבל תהיה חלק המיטוכונדרי הטהור.
8. העברת supernatant מfrac האורtion הושג בשלב 3.6 ל Tube צנטריפוגה Beckman-Ultra Clear, על קרח. השלך את הגלולה.
9. הוסף בינוני בידוד מספיק כדי supernatant הושג בשלב 3.8 למלא את הצינורית וצנטריפוגה XG ב 100.000 ל1 שעות, 4 ° C. הגלולה שתתקבל תהיה שבריר MAMs. מוציא בזהירות ולהשליך supernatant.

הערה: בשלב זה, ייתכן שגם חובצה ב -100,000 XG ל1 שעות, 4 ° C supernatant הציל בשלב 2.6. הגלולה תהיה שבריר ER וsupernatant שבריר cytosolic.

4. הפקת Glycosphingolipid מועשר-Microdomains, אובניים החן

1. Lyse שברי מיטוכונדריה ו / או MAM טהורים ב500 מ"ל μl-1 של הצפת חילוץ עבור 20 דקות על קרח.
2. צנטריפוגה lysates ב15300 XG עבור 2 דקות ב 4 ° C.
3. איסוף supernatants (X-100 חומרי טריטון מסיסים) וגלולות מחדש צנטריפוגותעבור 2 דקות שנותר כדי להסיר חומרים מסיסים. (טריטון X-100 חולץ המיטוכונדריה ו / או טריטון X-100 MAMs חולץ).
4. Solubilize כדורים בSolubilising מאגר. חומרי solubilized זה מייצג את שברי GEM ויכולים לשמש לניתוח נוסף.

תוצאות

בהתבסס על הניסיון שלנו בשימוש בפרוטוקול זה אנו יכולים בבטחה ממליצים עליו לבידוד והטיהור של MAMs, אובניים חן ופיצולי המיטוכונדריה ממוח עכבר. ההליך כפי שמתואר הוא שחזור ומתואם היטב. באיור 1 אנו מראים תמונה מייצגת של דרך שכבת המיטוכונדריה וMAMs הטהורה בשיפוע Percoll (?...

Discussion

האתרים של מגע בין קרומים תאיים או בין האברונים וקרום הפלזמה של תאים מייצגים פלטפורמות איתות דינמיות לתהליכים תאיים בסיסיים. האפיון המדויק של התפקוד ובהרכב שלהם תחת שני תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים דורש פרוטוקולי טיהור אמינות ושחזור. השיטות, כמפורט כאן כבר מותאמות ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב / חומרים	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
			ריאגנטים
			חלוקה
סוכרוז	הפישר סיינטיפיק	S5-500
סודיום ביקרבונט	סיגמה אולדריץ	S-5761
מגנזיום כלוריד, Hexahydrate	הפישר סיינטיפיק	BP214-500
כלוריד סידן, dihydrate	סיגמה אולדריץ	C-5080
			MAM
D-מניטול	סיגמה אולדריץ	M9546-250
Hepes	הפישר סיינטיפיק	BP310-500
EGTA	סיגמה אולדריץ	E4378-250
BSA, V בר, הלם חום, Lyophilizate	רוש	03-116-964-001
Percoll	GE	17-0891-02
			פנינה
טריטון X-100	סיגמה אולדריץ	T9284-500 מ"ל
כלוריד הנתרן	הפישר סיינטיפיק	S271-3
טריס בסיס	רוש	03-118-142-001
HCl	הפישר סיינטיפיק	A144S-500
EDTA	הפישר סיינטיפיק	BP120-500
סולפט Dodecyl נתרן (SDS)	הפישר סיינטיפיק	BP166-500
			משותף
טבליות מעכבי פרוטאז, שלמות EDTA חינם	רוש	11-873-580-001
			ציוד
2 מטחנות רקמות מ"ל Douce כל הזכוכית	קימבל צ'ייס	885300-0002
15 צינורות מ"ל פוליפרופילן חרוטי צנטריפוגות, BD פלקון	BD	352097
30 צינורות זכוכית צנטריפוגות ישבן עגול מ"ל	קימבל צ'ייס	45500-30
15 ישבן עגול הזכוכית Centri מ"לצינורות fuge	קימבל צ'ייס	45500-15
צינורות Ultracentrifuge, Ultra-ברור, Thinwall, מ"מ 14x89	Beckman-קולטר	344059
Parafilm	קולמן לבן זוג	PM996
פנוי ורוסיליקט זכוכית פסטר Pipets, 9 "	הפישר סיינטיפיק	13-678-20C