I mitocondri associati Membrane ER (MAMs) e glicosfingolipidi microdomini arricchiti (GEM): Isolamento dal cervello di topo

Riepilogo

Questa procedura illustra come isolare dal cervello di topo adulto i mitocondri associate membrane ER o MAMS e glicosfingolipidi-arricchiti frazioni microdomini di MAMs e preparati mitocondriali.

Abstract

Organelli intracellulari sono strutture altamente dinamiche con diversa forma e composizione, che sono sottoposti a stimoli intrinseci ed estrinseci delle cellule-specifiche. Le loro membrane sono spesso giustapposti a siti di contatto definiti, che diventano centri per lo scambio di molecole di segnalazione e dei componenti della membrana ^1,2,3,4. Le inter-organelli microdomini di membrana che si formano tra il reticolo endoplasmatico (ER) ei mitocondri all'apertura del IP3-sensibili Ca ^{2 +} sono noti canali come i mitocondri associato-ER membrane o MAMS ^4,5,6. La proteina / lipide composizione e le proprietà biochimiche di questi siti di contatto di membrana sono stati ampiamente studiati in particolare in relazione al loro ruolo nella regolazione intracellulare Ca ^{2 + 4,5,6.} La ER serve come fonte principale di Ca ^{2 +} intracellulare, e in questa capacità regola una miriade di processi cellulari a valle di Ca ^{2 +} segnalazione, including post-traduzionale folding delle proteine ​​e proteine ​​maturation7. Mitocondri, invece, mantenere l'omeostasi Ca ^{2 +,} tamponando citosolico Ca ^{2 +} concentrazione impedendo così l'apertura di percorsi apoptotici a valle di Ca ^{2 +} squilibrio ^4,8. La natura dinamica delle MAMs li rende luoghi ideali di base per analizzare i meccanismi cellulari, tra cui Ca ^{2 +} di segnalazione e regolazione di mitocondriale Ca ^{2 +} sopravvivenza concentrazione, la biosintesi dei lipidi e dei trasporti, il metabolismo energetico cellulare e ^{4,9,10,11,12.} Diversi protocolli sono stati descritti per la purificazione di questi microdomini di tessuto epatico e cellule coltivate ^13,14.

Assunzione di metodi precedentemente pubblicati in considerazione, abbiamo adattato un protocollo per l'isolamento dei mitocondri e MAMs dal cervello di topo adulto. Per questa procedura, abbiamo aggiunto un ulteriore passaggio di purificazione, cioè un estrazione Triton X100, che enables l'isolamento del glicosfingolipide arricchito microdomini (GEM), frazione dei MAMs. Queste preparazioni GEM condividere componenti proteiche diverse con zattere caveolae e lipidi, derivati ​​dalla membrana plasmatica o altre membrane intracellulari, e si propone di funzionare come la raccolta punti per il raggruppamento delle proteine ​​recettori e per interazioni proteina-proteina ^4,15.

Protocollo

Il seguente protocollo è stato progettato per l'isolamento e la purificazione di MAMs e gemme da cervello di topo

Soluzioni richiesto per l'isolamento di mitocondri, MAMs e gemme

Frazionamento per ottenere greggio preparazione mitocondriale:

Soluzione A: 0,32 M saccarosio, 1 mM NaHCO _3, 1 mM MgCl _2, 0.5 mM CaCl ₂ + inibitori delle proteasi (aggiungere fresco, se necessario)

Soluzione B: 0.32 M saccarosio, 1 mM _NaHCO3 + inibitori della proteasi (aggiungere fresco, se necessario)

MAMs Isolamento:

Isolation Medio: 250 mM Mannitolo, 5 mM HEPES pH 7,4, 0,5 mM EGTA, 0,1% BSA

Gradiente Buffer: 225 mM mannitolo, 25 mM HEPES pH 7,5, 1 mM EGTA, 0,1% BSA (concentrazione finale)

GEM di isolamento:

contenuto "> GEM tampone di estrazione: 25 mM HEPES pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1% Triton X-100 + inibitori delle proteasi (aggiungere fresco, se necessario)

GEM Buffer solubilizzante: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5 mM EDTA, 1% SDS + Inibitori della proteasi (aggiungere fresco, se necessario).

1. Passo Frazionamento subcellulare Primo: Celle rimozione dei Nuclei, non lisate e detriti cellulari

1. Eutanasia mouse nella camera di CO _2.
2. Rimuovere immediatamente il cervello, dimezzare, mettere in 2 ml provette in ghiaccio e pesare.

Nota: Tenere le metà del cervello separato durante tutta la procedura. Quanto segue si applica al trattamento di un mezzo unico cervello.

3. Luogo cervello metà in pre-refrigerati 2 smerigliatrice di vetro tessuto Dounce ml contenente 1 ml di soluzione fredda A. Omogeneizzare con 15 colpi totali di un pestello spazio di grandi dimensioni.
4. Trasferire in una provetta da 15 ml falcon, su ghiaccio, e diluireomogenati fino a 10 volumi w / v, ad esempio 0,225 g di 2,25 ml.
5. Centrifugare campione a 1400 xg per 10 min a 4 ° C.
6. Rimuovere con attenzione il supernatante e trasferirlo in una 30 ml a fondo rotondo tubo di vetro, sul ghiaccio. Fare attenzione a non disturbare il pellet.
7. Risospendere il precipitato in stessi 10 volumi di soluzione A. Omogeneizzare nel macinacaffè stesso, con 3-6 colpi di un pestello piccolo gioco, 1 ml per volta.
8. Trasferire in una nuova provetta 15 ml falcon e centrifugare a 710 xg per 10 min a 4 ° C. Ciò si traduce in un pellet di nuclei e detriti cellulari.
9. Rimuovere con attenzione il surnatante e piscina con il surnatante salvato nel passaggio 1.6.

2. Secondo passo: Crude Isolamento mitocondri

1. Centrifugare supernatanti a 13800 xg per 10 min a 4 ° C.
2. Trasferire il surnatante in un Ultra-Clear provetta da centrifuga Beckman, su ghiaccio
3. Risospendere il pellet in 10 volumi di soluzione A. Omogeneizzare nel macinacaffè stesso, con 3-6 colpi di un pestello piccolo gioco, 1 ml per volta.
4. Centrifugare come punto 2.1.
5. Ripetere i passaggi 2,2-2,4.
6. Il pellet risultante è una frazione arricchita mitocondriale. I supernatanti (citosol e ER), coprire con parafilm e tenere in ghiaccio.
7. Risospendere il pellet con 6 colpi di un pestello piccolo gioco, in 4,8 ml / g (g è riferito al peso del cervello originale) di soluzione B, in un omogeneizzatore fresco.
8. Usando pipette Pasteur in vetro, preparare un gradiente discontinuo di saccarosio in un Ultra-Clear provetta da centrifuga Beckman, aggiungendo successivamente al fondo della provetta come segue, con attenzione, assicurando bolle si formano:
   Resupended pellet (0,32 M saccarosio)
   3 ml 850 mM saccarosio (in 1 mM _NaHCO3)
   3 ml 1 M Saccarosio (in 1 mM NaHCO ₃₎
   3 ml di 1,2 M saccarosio (in 1 mM NaHCO3)
9. Centrifugare a 82500 xg per 2 ore a 4 ° C. La separazione risultante alla fine del gradiente produrrà tre bande e un pellet: 1) mielina e altri contaminanti membrana (0,32 M - 0,85 M di interfaccia), 2) ER, Golgi, membrane plasmatiche (0,85 M - 1 M di interfaccia); 3) sinaptosomi (1 M - 1,2 M di interfaccia), 4) grezzo mitocondri (pellet) che viene utilizzato per le successive fasi di purificazione

3. Isolamento dei mitocondri associata a membrana ER, MAMs

1. Risospendere il greggio appena mitocondri isolati da una metà del cervello, in 2 ml di terreno di isolamento contenenti inibitori della proteasi appena aggiunti.
2. Preparazione di un gradiente Percoll 30% con il tampone di gradiente da 8 ml per metà del cervello, e il luogo in un Ultra-Clear provetta da centrifuga Beckman.

* Nota: Assicurarsi tampone gradiente più concentrato (1,43 volte) per ottenere corretta concentrazione finale dopo diluting Percoll al 30%.

3. Sospensione livello mitocondriale in cima gradiente preparato lentamente per evitare eventuali bolle.
4. Centrifugare a 95.000 xg per 30 min a 4 ° C.
5. 1. Rimuovere la frazione pesante (fascia inferiore) prima con una pipetta Pasteur di vetro e versare in un nuovo fondo rotondo tubo di vetro, su ghiaccio.
   2. Rimuovere la frazione leggera (banda superiore) con un altro SECONDO Pasteur pipetta di vetro e versare in un separato fresco a fondo rotondo tubo di vetro, su ghiaccio.
6. Diluire entrambe frazioni raccolte nel passaggio 3,5 con 10 ml di mezzo di isolamento e centrifugare a 6300 xg per 10 min a 4 ° C.
7. Scartare il sopranatante della frazione pesante ottenuta nella fase 3.6, risospendere il pellet con un altro supporto 10 ml Isolamento e centrifugare nuovamente, come passo 3,6. Il pellet risultante sarà la frazione pura mitocondriale.
8. Trasferire il surnatante dal Frac Lucezione ottenuta nello stadio da 3,6 a un Ultra-Clear provetta da centrifuga Beckman, sul ghiaccio. Eliminare il pellet.
9. Aggiungere mezzo di isolamento al supernatante ottenuto nel passaggio 3,8 per riempire il tubo e centrifugare a 100.000 xg per 1 ora, 4 ° C. Il pellet risultante sarà la frazione MAMs. Rimuovere con attenzione ed eliminare il surnatante.

Nota: A questo punto, si può anche centrifugare a 100.000 xg per 1 ora, 4 ° C, il surnatante salvato nella fase 2.6. Il pellet sarà la frazione ER e supernatante la frazione citosolica.

4. Estrazione di glicosfingolipidi-microdomini arricchiti, GEM

1. Lyse puri frazioni mitocondri e / o MAM in 500 pl-1 ml di tampone di estrazione per 20 min in ghiaccio.
2. Centrifugare a 15300 lisati xg per 2 minuti a 4 ° C.
3. Raccogliere surnatanti (Triton X-100 materiale solubile) e ri-centrifuga pelletsper 2 minuti per rimuovere restante materiale solubile. (Triton X-100 mitocondri estratti e / o Triton X-100 MAMs estratti).
4. Solubilizzare pellet in solubilizzanti tampone. Questo materiale solubilizzato rappresenta le frazioni GEM e può essere utilizzato per ulteriori analisi.

Risultati

Sulla base della nostra esperienza con l'utilizzo di questo protocollo possiamo tranquillamente lo consiglio per l'isolamento e la purificazione di MAMs, gemme e frazioni mitocondriali di cervello di topo. La procedura indicata è altamente riproducibile e coerente. In figura 1 si mostra una immagine rappresentativa dello strato modo puro mitocondri e MAMs su un gradiente Percoll (passo 3.4). A definito, banda lattiginoso contenente purificata mitocondri (Mito-P) segrega al fondo del tubo ultrac...

Discussione

I siti di contatto tra membrane intracellulari o tra organelli e la membrana plasmatica di cellule rappresentano dinamiche piattaforme di segnalazione per processi cellulari di base. La caratterizzazione accurata della loro funzione e la composizione sia in condizioni fisiologiche e patologiche richiede protocolli di purificazione affidabili e riproducibili. I metodi qui descritti sono stati specificamente ottimizzate dal nostro laboratorio per l'isolamento e la purificazione dei MAMs e loro gemme corrispondenti del...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente / materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
			REAGENTI
			Frazionamento
Saccarosio	Fisher Scientific	S5-500
Bicarbonato di Sodio	Sigma-Aldrich	S-5761
Cloruro di magnesio, esaidrato	Fisher Scientific	BP214-500
Cloruro di calcio, diidrato	Sigma-Aldrich	C-5080
			MAM
D-mannitolo	Sigma-Aldrich	M9546-250G
Hepes	Fisher Scientific	BP310-500
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378-250G
BSA, Frazione V, shock termico, liofilizzato	Roche	03-116-964-001
Percoll	GE	17-0891-02
			GEM
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500 ml
Cloruro di sodio	Fisher Scientific	S271-3
Tris Base	Roche	03-118-142-001
HCl	Fisher Scientific	A144S-500
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Di sodio dodecil solfato (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500
			Comune
Compresse inibitori della proteasi, completi EDTA-free	Roche	11-873-580-001
			ATTREZZATURE
2 ml Douce All-Glass tessuto Grinders	Kimble Chase	885300-0002
15 ml in polipropilene Tubi per centrifuga coniche, BD Falcon	BD	352097
30 ml a fondo rotondo in vetro da centrifuga Tubi	Kimble Chase	45500-30
15 ml a fondo rotondo in vetro CentriFuge Tubi	Kimble Chase	45500-15
Tubi ultracentrifuga, Ultra-Clear, pareti sottili, mm 14x89	Beckman-Coulter	344059
Parafilm	Cole-Parmer	PM996
Monouso in vetro borosilicato Pasteur Pipette, 9 "	Fisher Scientific	13-678-20C