Митохондрии связанных ER мембран (MAMS) и гликосфинголипид Обогащенный микродоменов (ГЭУ): Изоляция от мозга мыши

Резюме

Эта процедура показывает, как можно изолировать от мозга взрослого человека мышью митохондрий связанных ER мембран или MAMS и гликосфинголипид обогащенного микродоменной фракций из MAMS и митохондриальных препаратов.

Аннотация

Внутриклеточных органелл очень динамических структур с различной формой и составом, которые подвергаются клетки конкретных внутренних и внешних сигналов. Их мембраны часто сопоставляется в определенные контакты сайтов, которые становятся центрами для обмена сигнальными молекулами и мембранных компонентов ^1,2,3,4. Между органелл мембраны микродоменов, которые образуются между эндоплазматической сети (ER) и митохондрий на открытии IP3 чувствительные Са ^{2 +} каналов известны как митохондрии, связанный-ER мембран или MAMS ^4,5,6. Белка / липидного состава и биохимических свойств этих сайтов мембранных контактов были тщательно изучены особенности в отношении их роль в регуляции внутриклеточного Ca ^{2 + 4,5,6.} ER служит в качестве основного магазина внутриклеточного Ca ^{2 +,} и в этом качестве регулирует множество клеточных процессов вниз по течению от Ca ^{2 +} сигнализации, в т.ч.uding посттрансляционных складывающиеся белка и maturation7. Митохондрии, с другой стороны, поддерживать Ca ^{2 +} гомеостаз, путем буферизации цитозольной концентрации Са ^{2 +} предотвращая тем самым начало апоптоза вниз по течению от Ca ^{2 + 4,8} дисбаланса. Динамичный характер MAMS делает их идеальными сайтов препарировать основных клеточных механизмов, в том числе Ca ^{2 +} сигнализация и регулирование митохондриальных концентрации Са ^{2 +,} биосинтез липидов и транспорта, энергетического метаболизма и выживания клеток ^{4,9,10,11,12.} Несколько протоколов были описаны для очистки этих микродоменов из ткани печени и культивируемых клеток ^13,14.

Принимая ранее опубликованных методов во внимание, мы адаптировали протокол для выделения митохондрий и MAMS от взрослого мозга мыши. Для этой процедуры мы добавили дополнительный этап очистки, а именно добыча Triton X100, который электроннойnables изоляции гликосфинголипид обогащенного микродоменной (GEM) доля MAMS. Эти GEM препараты имеют ряд белковых компонентов с кавеол и липидного плоты, полученных от плазматической мембраны или других внутриклеточных мембран, и предложил работать как сборные пункты для кластеризации рецепторных белков и белок-белковых взаимодействий ^4,15.

протокол

Следующий протокол предназначен для выделения и очистки MAMS и драгоценных камней из мозга мыши

Решения необходимы для изоляции митохондрий, MAMS и драгоценных камней

Фракционирования для получения сырого митохондриальной подготовки:

Решение: 0,32 М сахарозы, 1 мМ NaHCO _3, 1 мМ MgCl _2, 0,5 мМ CaCl ₂ + Ингибиторы протеазы (добавить свежие, по мере необходимости)

Раствор Б: 0,32 М сахарозы, 1 мМ NaHCO ₃ + Ингибиторы протеазы (добавить свежие, по мере необходимости)

MAMS изоляции:

Изоляция среднего: 250 мм маннитол, 5 мМ HEPES рН 7,4, 0,5 мМ EGTA, 0,1% BSA

Градиент буфер: 225 мМ маннит, 25 мМ HEPES рН 7,5, 1 мМ EGTA, 0,1% BSA (конечная концентрация)

ГЭУ изоляции:

Содержание "> GEM буфере для экстракции: 25 мм HEPES рН 7,5, 0,15 М NaCl, 1% Triton X-100 + Ингибиторы протеазы (добавить свежие, по мере необходимости)

GEM солюбилизирующий буфер: 50 мМ Трис-HCl, рН 8,8, 5 мМ ЭДТА, 1% SDS + Ингибиторы протеазы (добавить свежий, по мере необходимости).

1. Первый шаг субклеточных Фракционирование: удаление ядра, Unlysed клеток и клеточных мусора

1. Усыпить мыши в CO ₂ камеры.
2. Немедленно снять головной мозг, вдвое, поместить в 2 мл пробирок на льду и взвесить.

Примечание: Следует мозга половины отдельной течение всей процедуры. Следующая информация относится к лечению одного 1/2 мозга.

3. Место 1/2 мозга в предварительно охлажденный 2 мл стекло Dounce ткани мясорубку, содержащий 1 мл холодной A. Решение однородный с 15 всего ударов большой пестик оформления.
4. Трансфер в 15 мл трубки сокола, на льду, и разбавитьгомогенатах до 10 объемов в / о, например, 0,225 г до 2,25 мл.
5. Центрифуга образца при 1400 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
6. Осторожно удалите супернатант и трансфер в 30 мл с круглым дном трубки центрифуги стекла, на льду. Убедитесь в том, чтобы не потревожить осадок.
7. Ресуспендируют осадок в том же 10 томов решений. Однородный в той же мясорубке, с 3-6 ударов небольшой зазор пестиком, 1 мл за один раз.
8. Переезд в новый 15 мл Сокол трубки и центрифуги при 710 х г в течение 10 мин при 4 ° C. Это приводит к гранулы ядер и клеточного мусора.
9. Осторожно удалите супернатант и бассейн с супернатант сохраненный на шаге 1.6.

2. Шаг второй: Сырая Митохондрии изоляции

1. Центрифуга супернатантов на 13800 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
2. Передача супернатант в Ultra-Clear трубы центрифуги Beckman, на льду
3. Ресуспендируют гранул в 10 Решение объемах. Однородный в той же мясорубке, с 3-6 ударов небольшой зазор пестиком, 1 мл за один раз.
4. Центрифуга, как шаг 2.1.
5. Повторите шаги 2.2-2.4.
6. Полученные гранулы является обогащенной фракции митохондрий. Бассейн супернатантов (цитозоль и ER), залить парафином и держать на льду.
7. Ресуспендируют гранул с 6 ударов небольшим пестиком оформления, в 4,8 мл / г (г относится к первоначальному весу мозга) раствора В, в свежих гомогенизатора.
8. Использование стеклянной пипетки Пастера, подготовить Разрывные градиентные сахарозы в Ultra-Clear трубы центрифуги Beckman, добавив, затем в нижней части трубки, как следует, тщательно, обеспечивая не образуются пузырьки:
   Resupended пеллетах (0,32 М сахарозы)
   3 мл 850 мм сахарозы (в 1 мМ NaHCO ₃₎
   3 мл 1 М сахарозы (в 1 мМ NaHCO ₃₎
   3 мл 1,2 М сахарозы (в 1 мМ NaHCO3)
9. Центрифуга на 82500 х г в течение 2 ч при 4 ° C. В результате разделения в конце градиента будет производить три полосы и гранул: 1) миелина и других загрязнений мембран (0,32 М - 0,85 м интерфейсом), 2) ER, Гольджи, плазматических мембран (0,85 M - 1 M-интерфейс); 3) синаптосомах (1 м - 1,2 м интерфейсом), 4) сырой митохондрий (гранулы), который используется для последующих стадий очистки

3. Выделение митохондрий связанных Мембрана ER, MAMS

1. Ресуспендируют свежевыделенных сырой митохондрии от одного мозга половины, в 2 мл изолированная среда, содержащая только что добавили ингибиторов протеазы.
2. Подготовить 30% Percoll градиент градиент буфера 8 мл на половину мозга, и место в Ultra-Clear трубы центрифуги Beckman.

* Примечание: Сделайте градиент буфера более концентрированные (1,43 раза), чтобы достичь правильной конечной концентрации после того, как гiluting Percoll до 30%.

3. Слой митохондриальной подвески на вершине подготовленных градиентов медленно, чтобы избежать пузырей.
4. Центрифуга на 95000 х г в течение 30 мин, 4 ° C.
5. 1. Снимите тяжелой фракции (нижняя полоса) ПЕРВЫЙ со стеклянной пипетки Пастера и перенести в свежую круглым дном стеклянной трубки, на льду.
   2. Снимите легкие фракции (верхняя полоса) ВТОРОЙ с другой стекло пипетки Пастера и перенести в отдельную свежие круглым дном стеклянной трубки, на льду.
6. Развести обеих фракций, собранных в шаге 3,5 с 10 мл Средний изоляции и центрифуге при 6300 мкг в течение 10 мин при 4 ° C.
7. Удалите супернатант из тяжелой фракции, полученной на стадии 3.6, ресуспендируют осадок с еще 10 средних изоляции мл и центрифугируют снова, как шаг 3,6. Полученный осадок будет чистой фракции митохондрий.
8. Передача супернатант от света Fracния, полученные в шаге от 3,6 до Ultra-Clear трубы центрифуги Beckman, на льду. Откажитесь от гранул.
9. Добавьте достаточное количество средних Изоляция супернатанта, полученного на стадии 3,8 до заполнения трубы и центрифуги при 100000 х г в течение 1 часа, 4 ° C. Полученный осадок будет MAMS фракции. Осторожно снимите и выбросьте супернатант.

Примечание: На данном этапе, вы также можете центрифуге при 100000 х г в течение 1 часа, 4 ° C супернатант сохранен на шаге 2.6. Осадок будет ER фракции супернатанта и цитозольной фракции.

4. Добыча гликосфинголипид обогащенного микродоменов, драгоценных камней

1. Lyse чистой митохондрий и / или MAM фракции в 500 мкл-1 мл экстракционного буфера в течение 20 минут на льду.
2. Центрифуга лизатов при 15300 х г в течение 2 мин при 4 ° C.
3. Сбор супернатантов (Triton X-100 растворимого материала) и вновь центрифуги гранулв течение 2 минут, чтобы удалить остатки растворимого материала. (Triton X-100 извлечены митохондрий и / или Тритон Х-100 извлечены MAMS).
4. Растворения гранул в солюбилизирующего буфера. Этот материал представляет собой растворяются GEM фракции и может быть использована для дальнейшего анализа.

Результаты

Основываясь на нашем опыте с использованием этого протокола мы можем смело рекомендовать его для выделения и очистки MAMS, драгоценных камней и митохондриальной фракции мозга мыши. Процедура, как описано очень воспроизводимые и последовательным. На рисунке 1 мы показываем пред...

Обсуждение

Места контакта между внутриклеточных мембран или между органелл и плазматической мембраны клетки представляют динамические сигнализации платформы для основных клеточных процессах. Точную характеристику их функции и состав под обоими физиологических и патологических условиях треб...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название Реагенты / Материал	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
			РЕАГЕНТЫ
			Фракционирование
Сахароза	Fisher Scientific	S5-500
Бикарбонат натрия	Sigma-Aldrich	S-5761
Хлорид магния, гексагидрат	Fisher Scientific	BP214-500
Хлорид кальция, дигидрат	Sigma-Aldrich	C-5080
			MAM
D-маннит	Sigma-Aldrich	M9546-250G
Hepes	Fisher Scientific	BP310-500
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378-250G
BSA, доля V, тепловой шок, Лиофилизат	Roche	03-116-964-001
Percoll	GE	17-0891-02
			GEM
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500 мл
Хлористый натрий	Fisher Scientific	S271-3
Tris базы	Roche	03-118-142-001
HCl	Fisher Scientific	A144S-500
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Додецилсульфата натрия (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500
			Общий
Ингибиторы протеазы Таблетки, полный ЭДТА бесплатно	Roche	11-873-580-001
			ОБОРУДОВАНИЕ
2 мл Douce All-стекла шлифовальные ткани	Кимбл Chase	885300-0002
15 мл полипропиленовые конические пробирки, BD Falcon	BD	352097
30 мл с круглым дном стеклянные трубки центрифуги	Кимбл Chase	45500-30
15 мл с круглым дном стекла CentriFuge трубы	Кимбл Chase	45500-15
Ультрацентрифуга трубки, Ultra-Clear, тонкостенных, 14x89 мм	Beckman-Coulter	344059
Parafilm	Cole-Parmer	PM996
Одноразовые боросиликатного стекла Пастера Пипец, 9 "	Fisher Scientific	13-678-20C