Modelos de ratón para Arteriosclerosis Graft

Resumen

Se describen protocolos para nuestros arteriosclerois de injerto de ratón (GA) modelos que implican la interposición de un segmento de vaso del ratón en un receptor de la misma cepa endogámica. Por retrocruzamiento de cambios genéticos adicionales en el recipiente de donante, el modelo se puede evaluar el efecto de los genes específicos en GA.

Resumen

Arteriosclerois injertados (GA), también llamados vasculopatía del injerto, es una lesión patológica que se desarrolla durante meses a años en los órganos trasplantados se caracterizan por la estenosis difusa, circunferencial de todo el árbol vascular del injerto. El componente más crítico de GA patogénesis es la proliferación de células de músculo liso como dentro de la íntima. Cuando un segmento de la arteria coronaria humana se interpone en la aorta infra-renal de ratones inmunodeficientes, las intimas podrían expandirse en respuesta a las células T humanas transferidas adoptivamente alogénico para el donante arteria o exógeno humano IFN-γ en ausencia de células T humanas. La interposición de una aorta de ratón a partir de una cepa a otra cepa de ratón receptor se limita como un modelo para el rechazo crónico en los seres humanos debido a la respuesta de rechazo celular agudo mediado en este modelo de ratón elimina por completo todas las células vasculares derivadas del donante del injerto dentro de dos-tres semana. Recientemente hemos desarrollado dos nuevos mOuse modelos para evitar estos problemas. El primer modelo consiste en la interposición de un segmento de vaso de un ratón macho en una hembra receptora de la misma cepa endogámica (C57BL/6J). El rechazo del injerto en este caso sólo se dirige contra antígenos menores de histocompatibilidad codificado por el cromosoma Y (presente en el macho, pero no la hembra) y la respuesta de rechazo que se produce es suficientemente indolente para conservar las células musculares lisas derivadas del donante durante varias semanas. El segundo modelo consiste en la interposición de un segmento de la arteria de un tipo salvaje C57BL/6J donante ratón en un ratón de acogida de la misma cepa y género que carece del receptor de IFN-γ seguido de la administración de ratón IFN-γ (entregado a través de la infección de ratón hígado con un vector adenoviral. No hay rechazo en este caso como donante y ratones receptores son de la misma cepa y género pero las células del músculo liso donantes proliferan en respuesta a la citoquina mientras que las células derivadas del huésped, que carecen del receptor deesta citocina, no responden. Por retrocruzamiento de cambios genéticos adicionales en el recipiente de donante, ambos modelos pueden ser utilizados para evaluar el efecto de los genes específicos en la progresión de GA. A continuación, se describen los protocolos detallados para nuestros modelos GA ratón.

Introducción

Arteriosclerois injertados (GA), también llamados vasculopatía del injerto, es una lesión patológica que se desarrolla durante meses a años en los órganos trasplantados se caracterizan por la estenosis difusa, circunferencial de todo el árbol vascular del injerto ^7. Las etapas iniciales pueden causar estenosis excéntricas y focal que son más evidentes en las arterias, por lo tanto se asemeja más estrechamente estenosis visto en la aterosclerosis convencional. La pérdida de lumen de los vasos de injerto resultados de la expansión la íntima debido a la infiltración de células T del huésped y de los macrófagos y, especialmente, a la acumulación de matriz extracelular y de músculo liso como las células se originó a partir del injerto, principal o con ambos ^{5, 13, 19,} que se compensa adecuadamente por el remodelado vascular hacia el exterior. En aloinjertos cardíacos, las lesiones clínicamente más significativos son los de las arterias coronarias epicárdicas y intramiocárdica. En última instancia, GA de las arterias coronarias se causar insuficiencia cardíaca isquémica. GA es la causa principal de la tarde gr cardiacapérdida de popa. Las estenosis de GA se detienen en las líneas de sutura, lo que implica fuertemente la respuesta del huésped a aloantígenos injerto en su patogenia y que nos lleva a clasificar GA como una forma de rechazo crónico ^3. Sin embargo, otras formas de lesión arterial pueden aumentar el riesgo de GA, ya sea mediante el aumento de la carga neta de la lesión o mediante la intensificación y / o modulación de la respuesta aloinmune. La célula (CE) revestimiento endotelial de las arterias del injerto se conserva en GA humana y las regiones más superficiales de la íntima adyacente al forro de CE es el sitio más fuertemente infiltrado por el anfitrión derivado de IFN-γ-la producción de células T y macrófagos ^11; en algunos pacientes GA se asocia con el desarrollo de aloanticuerpos donante-específicos que se unen a injerto CE ¹⁶ pero los vasos muestran poca evidencia de la necrosis fibrinoide que es característica de rechazo agudo mediado por anticuerpos ^11.

El componente más crítico de GA patogénesis es laproliferación de células de músculo liso, como en la íntima, y ​​si este proceso puede ser detenido, GA es poco probable que el progreso. Trabajos previos de nuestro grupo ha demostrado que intimas de segmentos de la arteria coronaria humana interpuestos en las aortas infra-renal de ratones inmunodeficientes se expanden en respuesta a transferidas adoptivamente células T humanas alogénicas para el donante arteria y que este proceso podría ser inhibida mediante la neutralización de IFN- γ ^18. Además exógena de IFN-γ humano podría causar la íntima (y medial) la proliferación de células del músculo liso (VSMC) vascular en estos injertos arteriales en la ausencia de células T humanas ^{15, 17.} (Es importante tener en cuenta que el ser humano y el ratón IFN-γ no se cruzan las especies, descartando los efectos indirectos en el host del ratón en este sistema experimental.) Estos modelos de ratón humanizado tienen el beneficio de recapitular humana de células T / interacciones de las células vasculares y la íntima Las lesiones se componen en gran parte de las células humanas (es decir injerto derivado),como se ha observado en muestras clínicas, pero no completamente recapitular la situación clínica porque ignoran el papel de los macrófagos de acogida y posiblemente otros tipos de células que intervienen en las lesiones de trasplantes clínicos. Un modelo de ratón convencional de este proceso podría teóricamente frente a este problema, como complemento de las limitaciones del modelo humanizado mediante la participación de un sistema inmune del huésped completa y proporcionar la ventaja adicional de permitir que el poder de enfoques genéticos de ratón para ser aplicado a GA. Los dos modelos de ratón más utilizados incluyen el trasplante heterotópico de corazón y la arteria trasplante ortotópico ^1. Las lesiones que se desarrollan en las arterias de los injertos de corazón heterotópico están mayoritariamente compuestas de células huésped, probablemente de origen de médula ósea, mientras que las células de la íntima de las arterias en los injertos de corazón humano son en su mayoría de origen injerto de ^{5, 13, 19.} Esta es una distinción importante que ha llevado a desarrollar modelos alternativos de ratón. Interposición deuna aorta de ratón a partir de una cepa a otra cepa de ratón receptor es aún más limitado como un modelo para el rechazo crónico en los seres humanos debido a la respuesta de rechazo mediado por células aguda en este modelo de ratón elimina por completo todas las células vasculares derivadas del donante del injerto dentro de dos-tres semana ^19. En consecuencia, los cambios subsiguientes visto en el segmento de vaso interpuesta son únicamente una respuesta de las células huésped que han repobladas la descelularizado recipiente de andamio, la creación de una situación altamente artefactual de importancia limitada como un modelo para los cambios en los vasos de injerto que se producen en la clínica. Hemos desarrollado recientemente dos nuevos modelos de ratón para eludir estos problemas ^21. El primer modelo consiste en la interposición de un segmento de vaso de un ratón macho en una hembra receptora de la misma cepa endogámica (C57BL/6J). El segundo modelo consiste en la interposición de un segmento de la arteria de un tipo salvaje C57BL/6J donante ratón en un ratón de acogida de la misma cepa y género que carece de la receptor de IFN-γ (IFN-γR-KO), seguido por la administración de IFN-γ de ratón (se entrega a través de la infección del hígado de ratón con un vector adenoviral. A continuación, describimos protocolos detallados y las ventajas de nuestros modelos GA ratón.

Protocolo

Ratón del injerto y modelo de trasplante de injerto singénico

Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y comités de uso de la Universidad de Yale. Para el modelo de aloinjerto, segmentos de aorta torácica de macho, 4-5 semanas de edad WT (C57BL/6J) o ratones IFN-γR-KO se interponen en la aorta abdominal de la hembra receptora, 8-12 semanas de edad WT utilizando un extremo a -end anastomosis microquirúrgica técnica (véase el siguiente para más detalles). Para el modelo de injerto singénico, los segmentos de la aorta torácica, 4-5 semanas de edad, los ratones WT macho se interponen en la aorta abdominal del macho, 8-12 semanas de edad IFN-γR1-KO con un extremo-a-extremo microquirúrgico técnica anastomótica. En 1 semana después de la cirugía, los animales fueron inoculados intravenosamente con Ad5.CMV-ratón IFN-γ o Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) a 1 x 10 ⁹ PFU. Suero de ratón IFN-γ niveles se midieron por ELISA (eBioscience) a 1 y 5 semanas después de la administración de adenovirus. Algunos animales recibieron BrdU(Sigma-Aldrich) a 100 mg / kg sc durante 2 semanas antes del sacrificio.

End-to-end anastomosis microquirúrgica técnica (Video se tomará para esta parte):

1. Procedimiento de Donantes

1. Anestesiar a los ratones donantes con inyecciones intraperitoneales de ketamina (50 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg).
2. Después de asegurarse de anestesia adecuada, colocar los ratones donantes bajo el microscopio de operación en X8-30 magnificación en una bandeja en una posición supina, y el uso de yodo cojín de la preparación y alcohol cojín de la preparación para la preparación de la pared torácica.
3. Una incisión en la pared anterior del tórax a través de las costillas y el diafragma para exponer el corazón.
4. Abra la aurícula derecha, inyectar 10 ml de heparina (100 U / ml) de solución salina en el ventrículo izquierdo para eliminar los ratones usando una jeringa de 10 ml con una aguja de calibre 25.
5. Resecar el corazón y los pulmones para exponer toda la longitud de la aorta torácica.
6. Disección de la aorta torácica con cuidado para minimizar el trauma directo, while identificar, ligar y dividir las ramas de madera con 11-0 sutura cerca de la aorta.
7. Una vez que la aorta torácica está libre de tejido circundante, especiales toda la aorta torácica para el trasplante.
8. Enjuague el extremo cortado de la aorta de donantes con heparinizada (100 U / ml) solución salina, y almacenarla en la misma solución en hielo (hasta 6 horas) hasta el trasplante.

2. Procedimiento destinatario

1. Inyectar los ratones receptores con ketoprofeno IP (5 mg / kg) para la analgesia, y thenanesthetize los ratones con ketamina IP (50 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). Los ratones receptores se anestesiaron profundamente dentro de los 10 minutos por una duración de 60 a 90 min. Durante la cirugía, el nivel de anestesia se evalúa cada 15 min por pellizcar la pared abdominal anterior o el pie usando fórceps. Si el animal reacciona a los estímulos nocivos en cualquier momento durante la cirugía, una dosis adicional de ketamina y xilazina (1/4 o 1/3 de la dosis inicial) será administrado por sc o im
2. Después de asegurarse de anestesia adecuada, rapó el pelo en la pared abdominal anterior con una máquina de afeitar eléctrica, limpie la piel con yodo Prep Pad y Alcohol Prep Pad, cubra los ojos con ungüento oftálmico. Durante la cirugía, las siguientes técnicas asépticas se utilizarán para las operaciones, incluyendo la limpieza de la mesa de operaciones con 10% de lejía, el uso de guantes estériles y el uso de instrumentos de microcirugía esterilizados (instrumentos de vapor-esterilizados para el inicio de la operación, a continuación, de vidrio caliente del grano-esterilizada instrumentos entre múltiples operaciones, etc.)
3. Coloque los ratones receptores bajo el microscopio de operación con un aumento de X8-30 en una bandeja en una posición supina.
4. Una incisión en la pared abdominal en la línea media de xifoides hasta el pubis, y la propagación de la pared abdominal, aparte utilizando un micro-retractor para exponer la cavidad abdominal.
5. Retirar el intestino superior y envolver con una gasa humedecida con solución salina. Los ratones receptores se congelan por la pérdida de la Ley de Educación Superiort externalizados a través de los intestinos. Es importante mantener el calor animal. Sin embargo, la placa de calefacción no se utiliza durante la cirugía como modesta hipotermia es de beneficio en la prevención de lesión de la médula durante la oclusión del flujo sanguíneo aórtico, así como no hay transferencia de calor ineficiente con el flujo sanguíneo ausente a la mitad inferior del cuerpo de los ratones.
6. Mueva los órganos reproductivos inferiormente, envuelva las áreas del abdomen de ratones receptores con una gasa con solución salina solución humedecido, y lo utilizan para retraer el recto hacia el lado derecho del abdomen. Los tejidos expuestos se riegan periódicamente con una solución salina durante el trasplante.
7. Diseccionar sin rodeos un segmento de la aorta infrarrenal entre el vaso renal proximal y distalmente bifurcación aórtica y separarse de la vena cava inferior (IVC) cuidadosamente.
8. Identificar y ligar todas las ramas pequeñas provenientes de este segmento de la aorta abdominal con sutura monofilamento de poliamida 11-0.
9. Pinzamiento del segmento aislado de unaaorta bdominal utilizando dos pinzas vasculares aproximadamente 5 mm aparte, uno en cada extremo.
10. Corte transversal de la aorta abdominal entre las pinzas afiladas utilizando micro-tijeras para crear los sitios de anastomosis.
11. Resecar un pequeño segmento de la aorta abdominal (hasta 0,4 mm de longitud) de un extremo de corte seccionado la aorta receptor para alojar el injerto aórtico donante.
12. Lave los segmentos de aorta entre las abrazaderas con solución salina heparinizada para eliminar la sangre residual. Los segmentos aórticos entre las abrazaderas y el donante de injerto aórtico se riegan periódicamente con heparinizada (100 U / ml) solución salina (hasta 40 ml / kg) durante la anastomosis.
13. Corte transversal de ambos lados de la aorta de donantes con micro-tijeras afiladas para crear un injerto de segmento de 2,5 mm de longitud para el trasplante.
14. Coloque el injerto aórtico donante en la posición ortotópica, anastomosis extremo proximal y distal del injerto del donante a la proximal y distal extremo cortado del destinatario de la aorta abdominal, respectivamente, con un extremo-tpatrón o de fondo utilizando 11-0 poliamida monofilamento de sutura.
15. Para las suturas continuas, coloque las suturas a los 3 y nueve posiciones en primer lugar. Entre dos suturas de sujeción a cada lado del injerto, se anastomosan ambos bordes de corte en 3-4 puntos de sutura usando las suturas continuas, y atan las suturas continuas para pasar suturas con un nudo doble. Dado que ambas capas de cierre son continuas, el riesgo de dehiscencia se incrementa. El injerto aórtico de donantes debe ser de longitud adecuada para conectar proximal y distal extremo cortado del destinatario de la aorta abdominal.
16. Para las suturas interrumpidas, la construcción de cuatro anastomosis en 3 y nueve posiciones en ambos lados del injerto en primer lugar, y anastomosis de ambos bordes de corte en 3-4 puntos de sutura entre dos suturas de sujeción a cada lado del injerto.
17. Suelte la pinza distal para permitir que el flujo retrógrado en injerto, identificar los sitios de sangrado y hacer puntos adicionales a los 3 minutos.
18. Después de comprobar la hemostasia satisfactoria, suelte la pinza proximal.
19. Confirmar la permeabilidad del injerto por la presencia de la pulsación vigorosa en el injerto y el segmento adyacente proximal de la aorta abdominal nativa, en particular en el segmento adyacente distal de la aorta abdominal y la arteria mesentérica inferior. Considere la posibilidad de trombosis en sitios anastomóticas si la pulsación disminuye en unos pocos minutos después de la restauración del flujo sanguíneo.
20. Volver los intestinos en la cavidad abdominal.
21. Sutura cerrar la pared abdominal con sutura de nylon 5-0 en la capa muscular y la capa de la piel, respectivamente.
22. Coloque los ratones receptores en una jaula limpia en la parte superior de una almohadilla de calefacción, y esperar 1-2 horas para los ratones para recuperar la conciencia y recuperarse de la anestesia. Es importante mantener el calor animal adecuada durante la recuperación. Mantener los ratones en la jaula cálido y seco antes de estela animales de la anestesia.
23. Evaluación de la función motora de las extremidades posteriores después de la recuperación ratones, y de nuevo en el segundo día. Será confirmado una cirugía de trasplante con éxito if sin disfunción de las extremidades posteriores se observó en ratones receptores en el segundo día.
24. Administrar los ratones receptores con ketoprofeno en el agua potable (5 mg / kg / d = 27 ug / ml en el agua potable) durante 48 horas. Si cualquier ratones receptores sufren de dolor no se alivia con los analgésicos postoperatorios como se evidencia por la pérdida de la movilidad, la ausencia de limpieza, agrupado postura anormal, etc, se practicó la eutanasia. Los animales se sacrificaron a los predefinidos puntos finales después de 1-60 días.

Análisis del injerto

Injertos de arteria de aloinjerto se adquirieron a las 4 semanas y de los injertos en el modelo de injerto singénico eran 6 semanas después de la operación (5 semanas después de la infección viral) y se analizaron mediante técnicas histológicas estándar para Gieson (EVG) tinción Elastica-furgoneta, hematoxilina y eosina (HE) tinción y la tinción de inmunofluorescencia. Las fotografías fueron tomadas con un sistema de microscopio de inmunofluorescencia (Zeiss). Recuento de células de núcleos rodeados por inmunotinción positiva era realizared con gran aumento y un promedio de 5 secciones para cada injerto. Las mediciones de área de injerto de la luz (en el endotelio), íntima (entre el endotelio y la lámina elástica interna, IEL), los medios de comunicación (entre el IEL y la lámina elástica externa, EEL), espesor de la pared (entre el endotelio y la lámina elástica externa) y el recipiente entero (dentro de la EEL) se calcula a partir de 5 secciones transversales de serie, 150 micras de distancia para cada injerto, utilizando el análisis de imagen asistido por ordenador y NIH Image 1.60 ( http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).

El análisis estadístico

Todos los datos se expresan como media ± SEM. Dos colas, pares de pruebas t y un análisis de dos vías ANOVA se realizaron con el programa de software Prism (GraphPad Software). Las diferencias con p <0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.

Resultados

Ratón modelo de aloinjerto de la arteriosclerosis (GA): En este modelo, una aorta macho donante se trasplanta en hembra receptora para que el host induce respuestas T alorreactivas aloinmunes mediadas por células contra un antígeno Y menor (el menor de histocompatibilidad HY antígeno específica de los machos) expresado en el injerto ^12, y a su vez de las células T produce IFN-γ-unidades de la proliferación de VSMC ²⁰ como se observa en otros modelos de trasplante de aloinje...

Discusión

Los protocolos descritos se centran en modelos de ratón GA. Los procedimientos se pueden aplicar a otros modelos de trasplante de injerto. Estos modelos incluyen xenoinjertos humanizado (es decir, los segmentos de las arterias coronarias humanas interponen a la aorta infra-renal de ratones inmunodeficientes), y el modelo GA mouse rechazo agudo (es decir, una aorta del ratón de una cepa genética en otro destinatario línea genética). Nuestros modelos de ratón descritos son más para cerrar lesiones...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664	Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks)
Ketamine Hydrochloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053	Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution	Lloyd Inc.	NADA# 139-236	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml)
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml)
Heparin Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400	Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml)
Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride)	CareFusion	AL4109
0.9% Sodium Chloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10	To prepare the anesthetic
Petrolatum Ophthalmic Ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Microscope	Leica	MZ95
Micro Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5693
Spring Scissors	F.S.T	15009-08	To transect the aorta of donor or recipient
Extra Narrow Scissors	F.S.T	14088-10
Needle Holder/Forceps	MICRINS	MI1542	To hold the needle
Fine Forceps	F.S.T	11254-20
Forceps	F.S.T	11251-35
Standard Pattern Forceps	F.S.T	11000-12
Forceps	F.S.T	13011-12
LANCASTER Eye Speculum	Zepf Medical Instruments	42-1209-07
Micro Vascular Clip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6472
Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5440
Black Polyamide Monofilament Suture	AROSurgical Instruments Corporation	Cat #T4A10Q07	10-0 suture, Needle=70 microns
Black Monofilament Nylon Suture	Syneture (Covidien)	SN-1956	6-0 suture
Non-Woven Songes	McKesson Corp.	Reorder No. 94442000
1 ml Syringe	BD	REF 309659
3 ml Syringe	BD	REF 309657
10 ml Syringe	BD	REF 309604
18G 1 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305196
25G 7/8, Hypodermic Needle	BD	REF 305124
27G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305109
30G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305106
Hearting Pad	Sunbeam	Z-1228-001
Trimmer	Wahl	9854-500
Table 2. Specific reagents and equipment.