Мышиные модели для взяток Атеросклероз

Резюме

Мы описываем наши протоколы для мыши трансплантата arteriosclerois (GA) моделей, которые включают вмешательство сегменте судна мышь в получателем же инбредной линии. По обратным скрещиванием дополнительных генетических изменений в сосуд донора, модель может оценить влияние специфических генов в GA.

Аннотация

Привитые arteriosclerois (GA), также называемый аллотрансплантата васкулопатию, это патологическое поражение, которое развивается в течение месяцев и даже лет в пересаженных органов характеризуется диффузной, окружные стеноз всего дерева сосудистого трансплантата. Наиболее важным компонентом патогенеза GA является распространение гладких мышц-подобных клеток в интиме. Когда человек сегментов коронарных артерий вставлен в инфра-почечной аорты иммунодефицитных мышей, интим может расширяться в ответ на восприимчиво переданы Т-клетки человека аллогенной к донорской артерии или экзогенный человеческого IFN-γ в отсутствие Т-клетках человека. Взаиморасположение мышь аорты от одного штамма в другой штамма-реципиента мышь ограничена в качестве модели хронического отторжения в организме человека, так как острый клеточный ответ об отклонении в этой модели мыши полностью устраняет все доноров полученные клетки сосудов из привитого течение двух-трех недель. Недавно мы разработали два новых мУз модели, чтобы обойти эти проблемы. Первая модель предполагает вмешательство судна сегмент от самца мыши в женский получателем же инбредной линии (C57BL/6J). Отторжения трансплантата в этом случае направлено только против минорных антигенов гистосовместимости, кодируемый хромосомой Y (в настоящее время в мужской, но не женщин) и реакции отторжения, который наступает достаточно ленивы, чтобы сохранить доноров полученные клетки гладких мышц в течение нескольких недель. Вторая модель включает в себя промежуточные артерии сегмент от дикого типа донор мыши C57BL/6J в хозяина мыши той же самой линии и пол, который испытывает недостаток рецептора IFN-γ с последующим введением мышь IFN-γ (доставляется через заражение мышей печень с аденовирусной вектора. Там нет отказа в этом случае, как донора и реципиента мышей той же линии и пола, но донором гладкомышечных клеток размножаться в ответ на цитокины хозяина в то время как клетки, полученные, не имея рецепторовэтого цитокина, не реагируют. По обратным скрещиванием дополнительных генетических изменений в сосуд доноров, обе модели могут быть использованы для оценки влияния специфических генов на прогрессирование ГА. Здесь мы описываем подробные протоколы для наших мышиных моделях GA.

Введение

Привитые arteriosclerois (GA), также называемый аллотрансплантата васкулопатию, это патологическое поражение, которое развивается в течение месяцев и даже лет в пересаженных органов характеризуется диффузной, окружные стеноз всего дерева сосудистого трансплантата ^7. На ранних стадиях может привести к эксцентричным и координационных стеноза, которые являются более очевидными в артериях, таким образом, более напоминающий стеноза видели в обычных атеросклероза. Просвет потери трансплантата результаты сосуды от интимных расширение за счет инфильтрации хост Т-клеток и макрофагов и особенно накопление внеклеточного матрикса и гладкие мышцы-подобных клеток происходит от трансплантата, хоста или оба ^{5, 13, 19,} которые неадекватно компенсироваться по внешнему ремоделирования сосудов. В сердечных трансплантатов, наиболее клинически значимыми поражениями являются те, в эпикардиальной интрамиокардиальной и коронарных артерий. В конечном счете, GA коронарных артерий вызывает ишемические сердечной недостаточности. ГА является основной причиной сердечных конце грКормовая потерь. Стенозами GA остановиться на линии шва, сильно причастности хозяина на трансплантат аллоантигенам в патогенезе и ведущих нам классифицировать GA как форма хронического отторжения ^3. Тем не менее, другие формы повреждения артерий может увеличить риск Г.А., либо за счет увеличения чистого бремя травм или усилением и / или модулирования аллоимунный ответа. Эндотелиальных клеток (ЭК) подкладка артерий трансплантата сохраняется в человеческой GA и самый поверхностный регионах, прилегающих к интиму подкладка ЕС является местом наиболее сильно проникли хозяина полученных IFN-γ-производители Т-клеток и макрофагов, ^11, в некоторых пациентов GA связан с развитием конкретных доноров аллоантитела, которые связываются с трансплантат EC ^16, но сосуды не наблюдается заметных признаков фибриноидный некроз, характерный острый антитело-опосредованной отказ ^11.

Наиболее важным компонентом патогенеза ГАпролиферации гладких мышц-подобных клеток в интиме, если этот процесс можно остановить, Джорджия вряд ли будет прогрессировать. Предыдущая работа из нашей группы показал, что из человека интим сегментов коронарных артерий вмешался в инфра-почечная аорты иммунодефицитных мышей расширяться в ответ на восприимчиво переданы Т-клетках человека аллогенной к артерии донора и что этот процесс может быть запрещена путем нейтрализации человеческого IFN- γ ^18. Кроме того экзогенный человеческого IFN-γ может привести интимных (и медиальной) клеток гладких мышц сосудов (VSMC) пролиферации этих артериальных трансплантатов в отсутствие Т-клетки человека ^{15, 17.} (Важно отметить, что человека и мыши IFN-γ не пересекают видов, исключая косвенное воздействие на мышей хозяин в этой экспериментальной системе.) Эти гуманизированными мышиные модели имеют преимущество сводный Т-клеток человека / сосудистые взаимодействия клеток и интимную поражения в основном состоит из человеческих (т.е. трансплантат производных), клеткикак было отмечено в клинических образцах, но они полностью не повторять от клинической ситуации, потому что они игнорируют роль хоста макрофагов и, возможно, другие типы клеток, участвующих в клинических поражений трансплантации. Традиционной модели мыши этого процесса теоретически может решить эту проблему, в дополнение к ограничениям гуманизированного модель с привлечением полной иммунной системы хозяина и предоставление дополнительных преимущество, что позволяет сила мыши генетические подходы должны применяться к GA. Два наиболее широко используемых моделей мыши включать гетеротопической трансплантации сердца и трансплантации ортотопический артерии ^1. Поражений, которые развиваются в артериях гетеротопической трансплантатов сердца в значительной степени состоят из клеток хозяина, вероятно костномозгового происхождения, в то время интимной клетки артерий в человеческих трансплантатов сердца преимущественно привитых происхождения ^{5, 13, 19.} Это значительное различие, которое привело нас к разработке альтернативных моделей мыши. Взаиморасположениемышь аорты от одного штамма в другой штамма-реципиента мышь еще более ограничен в качестве модели хронического отторжения в организме человека, так как острый клеточный ответ об отклонении в этой модели мыши полностью устраняет все донор полученные клетки сосудов из привитого течение двух-трех ¹⁹ недель. Следовательно, последующие изменения заметны и в сегменте вмешался судно исключительно ответа клеток-хозяев, которые заселили decellularized судна эшафот, создавая очень искусственной ситуации ограниченное значение в качестве модели для изменения в сосудах трансплантата, которые происходят в клинике. Недавно мы разработали две новые модели мыши, чтобы обойти эти проблемы ^21. Первая модель предполагает вмешательство судна сегмент от самца мыши в женский получателем же инбредной линии (C57BL/6J). Вторая модель включает в себя промежуточные артерии сегмента от дикого типа донора мыши C57BL/6J в хозяина мыши той же линии, что и пол не хватает RECeptor для IFN-γ (IFN-Гд-KO) с последующим введением мышь IFN-γ (поставляются инфекция печени мышей с аденовирусной вектора. Здесь мы описываем подробные протоколы и преимущества наших моделей мышей GA.

протокол

Мыши и аллотрансплантата сингенную модели трансплантации трансплантат

Все исследования на животных были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета из Йельского университета. Для аллотрансплантата модели сегментов грудной аорты от самцов 4-5 недельных WT (C57BL/6J) или IFN-Гд-KO мышей вставлены в брюшную аорту женского получатель, 8-12 недельных WT использованием конца в конец микрохирургической техники анастомоза (см. следующий право). Для сингенных модель трансплантата сегментов грудной аорты от мужских, 4-5 недельных мышей WT были вставлены в брюшную аорту мужского, 8-12 недельных IFN-γR1-KO использованием конец-в-конец микрохирургического анастомоза техники. Через 1 неделю после операции животных инокулировали внутривенно Ad5.CMV-мышь IFN-γ или Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) в концентрации 1 × 10 ⁹ PFU. Сыворотки мышей IFN-γ уровни были измерены с помощью ELISA (eBioscience) на 1 и 5 недель после аденовирус управления. Некоторые животные получали BrdU(Sigma-Aldrich) в дозе 100 мг / кг подкожно за 2 недели до жертвы.

Впритык микрохирургической техники анастомоза (Видео будут приняты для этой части):

1. Процедура Донор

1. Обезболить донора мышей с внутрибрюшинной инъекции кетамина (50 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг).
2. После обеспечения адекватной анестезии, поместите доноров мышам под операционным микроскопом в режиме x8-30 увеличение на подносе в положении лежа на спине, а также использовать йод Prep Pad Pad Алкоголь и подготовки к груди подготовки стен.
3. Надрезать переднюю грудную стенку через ребра и диафрагмы, чтобы открыть сердце.
4. Открытие правое предсердие, вводят 10 мл гепаринизированной (100 ед / мл), солевым раствором в левый желудочек, чтобы смыть мышей с использованием 10-мл шприц с 25-иглы.
5. Резекцию сердце и легкие, чтобы разоблачить всю длину грудной аорты.
6. Рассеките грудной аорты тщательно, чтобы свести к минимуму прямой травмы, Whilэлектронной выявления, перевязывать и разделить пиломатериалов веток с помощью 11-0 шва рядом с аортой.
7. Как только грудной аорты является свободным от окружающих тканей, акциз всей грудной аорты для трансплантации.
8. Промыть срез доноров аорты с гепарином (100 ЕД / мл) солевой раствор, и сохранить его в том же растворе на льду (до 6 ч) до трансплантации.

2. Получатель процедуры

1. Введите мышей-реципиентов с ф кетопрофен (5 мг / кг) для обезболивания и thenanesthetize мышей внутрибрюшинно кетамина (50 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг). Получателем мыши глубокой анестезии в течение 10 минут с продолжительностью 60-90 мин. Во время операции, уровень анестезии оценивается каждые 15 мин, зажимая передней брюшной стенки или ноги с помощью щипцов. Если животное реагирует на вредные стимулы в любое время во время операции, дополнительную дозу кетамина и ксилазина (1/4 или 1/3 первоначальной дозы) будет вводиться подкожно или внутримышечно
2. После обеспечения адекватной анестезии, сбрить мех в передней брюшной стенке с помощью электрической бритвы, очистите кожу с помощью йода Prep Pad и алкоголь Prep Pad, закрывала глаза использовании глазной мази. Во время операции, следующие асептических методов будет использоваться для операций, включая очистку операционный стол с 10% отбеливатель, носить стерильные перчатки с использованием стерильных микрохирургических инструментов (стерилизовали паром приборы для начала операции, а затем горячей стеклянных шариков стерилизованные инструментов между несколькими операции и т.д.).
3. Поместите мышей-реципиентов под операционным микроскопом при увеличении в X8-30 на подносе в положении лежа на спине.
4. Надрезать брюшной стенки по срединной линии от xyphoid к лобку, и распространять брюшную стенку друг от друга с помощью микро-втягивающим, чтобы разоблачить брюшной полости.
5. Уберите кишечник сверху и оберните марлей смоченной физиологическим раствором. Мышей-реципиентов становятся охлаждается потери за слухT через кишечник вовне. Важно поддерживать животное тепло. Тем не менее, отопительной панели не используется во время операции, как скромные гипотермии приносит пользу в предотвращении травмы позвоночника во время окклюзии аортального кровотока, а также существует неэффективно теплообмена с отсутствием притока крови к нижней половине тела мышей.
6. Переместить репродуктивных органов книзу, оберните области живота мышей-реципиентов с солевым раствором смоченную марлю, и использовать его, чтобы втянуть прямую кишку, чтобы правая сторона брюшной полости. Облученных тканей орошаются периодически с физиологическим раствором при пересадке.
7. Рассеките прямо сегмент инфраренального аорты между почечный сосуд проксимально и дистально бифуркации аорты и отделить от нижней полой вены (НПВ) тщательно.
8. Выявление и перевязывать все мелкие ветви, происходящих из данного сегмента брюшной аорты использованием 11-0 Полиамид мононить шва.
9. Крест-зажим изолированный сегментbdominal аорты с помощью двух зажимов сосудистой примерно 5 мм друг от друга, по одному на каждом конце.
10. Разрез брюшной аорты между зажимами острыми микро-ножницы для создания анастомоза сайтов.
11. Резекцию небольшой сегмент брюшной аорты (до 0,4 мм в длину) из одного отрезанного конца пересеченной аорты получателя для размещения трансплантата аорты донора.
12. Промойте сегментов аорты между зажимами использованием гепаринизированной солевой раствор для удаления остатков крови. Аорты сегментов между зажимами и донор трансплантата аорты орошают периодически с гепарином (100 ед / мл), солевым раствором (до 40 мл / кг) в течение анастомоза.
13. Разрез обе стороны доноров аорты с острыми микро-ножницы, чтобы создать сегмент трансплантата 2,5 мм в длину для трансплантации.
14. Поместите донор трансплантата аорты в ортотопической положение, анастомозирующих донор трансплантата проксимальный и дистальный конец проксимальный и дистальный конец сокращения получателя брюшной аорты, соответственно, на конец тO-конца узора с помощью 11-0 Полиамид мононить шва.
15. Для непрерывного швов, место пребывания швов на 3 и 9 часов позиции первых. Между двумя пребывания швы с каждой стороны трансплантата, анастомозируют как кромки в 3-4 строчек с использованием работает швы, и свяжите работает швы, чтобы остаться швы с двойной узел. Поскольку оба слоя закрытие непрерывны, риск расхождение увеличивается. Донор трансплантата аорты должна быть соответствующей длины для подключения проксимальный и дистальный конец сокращения получателя из брюшной аорты.
16. Для узловыми швами, построить четыре анастомоза на 3 и 9 часов позиции в обе стороны трансплантата во-первых, и анастомозируют как кромки в 3-4 стежками между двумя пребывания швы с каждой стороны трансплантата.
17. Отпустите зажим дистальных чтобы ретроградный кровоток в трансплантат, определить кровотечения сайтов и сделать дополнительные стежки в течение 3 минут.
18. Убедившись удовлетворительное гемостаза, отпустите зажим проксимальных.
19. Подтверждение шунта наличием энергичном пульсации трансплантата и проксимальный соседним сегментом родной брюшной аорты, в частности в дистальном смежный сегмент брюшной аорты и нижней брыжеечной артерии. Рассмотрим тромбоза анастомоза сайтов, если пульсации уменьшаются в течение нескольких минут после восстановления кровотока.
20. Возврат кишечника в брюшную полость.
21. Шовный закрыть брюшную стенку использованием 5-0 нейлоновой ниткой в ​​мышечный слой и слой кожи, соответственно.
22. Поместите мышей-реципиентов в чистую клетку на вершине грелку, и подождать 1-2 ч в течение мышей в сознание и восстановления после анестезии. Это важно для поддержания адекватного тепло животного во время восстановления. Держите мышей в теплой и сухой клетке перед животным пробуждение от наркоза.
23. Оценка двигательной функции задних конечностей после выздоровления мышей, и снова на второй день. Успешная операция по трансплантации будет подтверждена ЯF не дисфункцию задних конечностей не наблюдается мышей-реципиентов на второй день.
24. Администрирование мышей-реципиентов с кетопрофен в питьевой воде (5 мг / кг / сут = 27 мкг / мл в питьевой воде) в течение 48 часов. Если получатель мышей страдают от боли необлегченный по послеоперационном анальгетики, о чем свидетельствует потере подвижности, неспособность ухаживать, аномальный пучки положение, и т.д., они будут умерщвлены. Животные будут умерщвлены в предопределенные конечные точки после 1-60 дней.

Привитые анализа

Артерии трансплантатов аллотрансплантата были закуплены в течение 4 недель и трансплантатов у сингенных модель трансплантата были 6 недель после операции (5 недель после вирусной инфекции) и анализировали стандартными гистологическими методами Elastica-ван Гизон (EVG) окрашивания гематоксилином и эозином (HE) окрашивания и иммунофлюоресценции окрашивания. Снимки выполнены при помощи иммунофлюоресценции системы микроскопа (Zeiss). Сотовые подсчета ядер, окруженных положительными Иммуноокрашивание выполнятьЭд под большим увеличением и в среднем от 5 сечений для каждого трансплантата. Привитые измерения площади просвета (в эндотелий), интимы (между эндотелием и внутренней упругой пластинки, IEL), носитель (между IEL и внешней эластичной оболочкой, EEL), толщина стенки (между эндотелием и внешней эластичной оболочкой) и всего судна (в пределах угорь) были рассчитаны из 5 последовательных сечений, 150 мкм друг от друга для каждого трансплантата с использованием компьютерного анализа изображений и NIH Image 1.60 ( http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).

Статистический анализ

Все данные представлены как среднее ± SEM. Двусторонними, парные т тесты и двусторонней ANOVA анализ проводили с помощью программы Prism программное обеспечение (GraphPad Software). Различия с Р <0,05 считались указывают статистическую значимость.

Результаты

Мышь аллотрансплантата атеросклероза (GA) модель: В этой модели мужской аорты донора пересаживается в женский род получателя, так что хозяин аллореактивных вызывает опосредованный Т-клетками аллоиммунная ответов в отношении несовершеннолетнего антигена Y (мужской конкретных...

Обсуждение

Описанные протоколы ориентированы на мышиных моделях GA. Процедуры могут быть применены к другим трансплантат модели трансплантации. Эти модели включают гуманизированные ксенотрансплантата (т.е. человеку сегментов коронарных артерий вставлены в инфра-почечной аорты иммунодефиц...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664	Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks)
Ketamine Hydrochloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053	Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution	Lloyd Inc.	NADA# 139-236	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml)
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml)
Heparin Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400	Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml)
Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride)	CareFusion	AL4109
0.9% Sodium Chloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10	To prepare the anesthetic
Petrolatum Ophthalmic Ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Microscope	Leica	MZ95
Micro Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5693
Spring Scissors	F.S.T	15009-08	To transect the aorta of donor or recipient
Extra Narrow Scissors	F.S.T	14088-10
Needle Holder/Forceps	MICRINS	MI1542	To hold the needle
Fine Forceps	F.S.T	11254-20
Forceps	F.S.T	11251-35
Standard Pattern Forceps	F.S.T	11000-12
Forceps	F.S.T	13011-12
LANCASTER Eye Speculum	Zepf Medical Instruments	42-1209-07
Micro Vascular Clip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6472
Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5440
Black Polyamide Monofilament Suture	AROSurgical Instruments Corporation	Cat #T4A10Q07	10-0 suture, Needle=70 microns
Black Monofilament Nylon Suture	Syneture (Covidien)	SN-1956	6-0 suture
Non-Woven Songes	McKesson Corp.	Reorder No. 94442000
1 ml Syringe	BD	REF 309659
3 ml Syringe	BD	REF 309657
10 ml Syringe	BD	REF 309604
18G 1 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305196
25G 7/8, Hypodermic Needle	BD	REF 305124
27G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305109
30G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305106
Hearting Pad	Sunbeam	Z-1228-001
Trimmer	Wahl	9854-500
Table 2. Specific reagents and equipment.