Greft damar sertliği için fare modelleri

Özet

Biz fare greft arteriosclerois (GA) aynı doğuştan gerginlik bir alıcıya bir fare damar segmentinin interpozisyonu içeren modeller için protokolleri tarif. Damar donör içine ek genetik değişiklikler geri melezlenmesine tarafından, model GA belirli genlerin etkisini değerlendirebilir.

Özet

Ayrıca allogreft vaskülopatisi denir greft arteriosclerois (GA), tüm greft vasküler ağacın yaygın, çevresel darlığı ile karakterize nakledilen organlarda yıl ay içinde gelişen bir patolojik lezyondur. GA patogenezinde en önemli bileşeni intima içinde düz kas benzeri hücrelerinin çoğalması olduğunu. Bir insan koroner arter kademeli bir bağışıklık yetersizliği olan farelerde, infra-böbrek aortlarından içine yerleştirilmiş olduğunda, intimas arter verici veya eksojen insan IFN-γ insan T-hücrelerinin yokluğunda. Allojen adoptif transfer insan T hücrelerine karşılık olarak genişletmek mümkündür Bu fare modelinde, akut hücre kaynaklı red tepkisi tamamen iki üç içinde greft tüm verici türetilmiş vasküler hücrelerin ortadan kaldırır, çünkü başka bir fare suşu alıcıya bir suşundan bir fare aort araya girmesi insanlardaki kronik rejeksiyon için bir model olarak sınırlıdır hafta. Yakın zamanda iki yeni m geliştirdikBu sorunları aşmak için model Ouse. Birinci model, erkek fare, aynı kendilenmiş suşu (C57BL/6J) bir dişi alıcı bir kap kademeli bir araya girmesi içerir. Bu durumda greft reddi Y kromozomu (erkek mevcut ama kadın değil) ve birkaç hafta için donör kaynaklı düz kas hücreleri korumak için yeterince sessiz olduğu görüldüğünde bu red yanıtı tarafından kodlanan küçük doku uygunluk antijenleri karşı yalnızca yönlendirilir. İkinci model için reseptör yoksun aynı zorlanma ve cinsiyet bir dizi fare içine vahşi bir C57BL/6J fare verici bir arter segmenti interposing içerir IFN-γ fare uygulaması takip IFN-γ (fare enfeksiyon ile teslim bir adenoviral vektör ile karaciğer. donör ve alıcı fareler her ikisi de aynı gerginlik ve cinsiyet ama ev sahibi kaynaklı hücreleri, için reseptör eksik ise donör düz kas hücreleri sitokin yanıt olarak çoğalırlar bu durumda herhangi bir ret yokBu sitokin, tepkisiz. Damar donör içine ek genetik değişiklikler geri melezlenmesine tarafından, her iki modelde GA ilerlemesi belirli genlerin etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Burada, bizim fare GA modelleri için ayrıntılı protokolleri tarif.

Giriş

Ayrıca allogreft vaskülopatisi denir greft arteriosclerois (GA), tüm greft vasküler ağacın ⁷ yaygın, çevresel darlığı ile karakterize nakledilen organlarda yıl ay içinde gelişen bir patolojik lezyondur. Erken evrelerde böylece daha yakından geleneksel ateroskleroz görülen darlık benzeyen, arterlerde daha açıkça görülür eksantrik ve odak darlığı neden olabilir. Nedeniyle ana T hücreleri ve makrofajlar infiltrasyonu ve özellikle hücre-dışı matris birikimi ve düz kas hücreleri gibi için intimal genişleme greft damarlarının lümeni kaybı yetersiz telafi edilir greft, bir ana bilgisayar veya her ikisi de ^{5, 13, 19,} kaynaklanmıştır dışa gemi yeniden tarafından. Kardiyak allogreftlerin, en lezyonlar klinik olarak anlamlı epikardiyal ve intrakardiyak koroner arterlerde olanlardır. Sonuçta, koroner arterlerin GA iskemik kalp yetmezliği neden olur. GA geç kalp gr en önemli nedenidirkıç kaybı. GA darlığı güçlü patogenezinde greft aloantijenlerine ev sahibi tepki karıştığı ve bize kronik rejeksiyon ³ biçimi olarak GA sınıflandırmak yol açan, dikiş hatları durdurmak. Ancak, arter yaralanması diğer formları yaralanma net yükünü artırarak ya da yoğunlaştırılması ve / veya immün yanıt modüle yoluyla, GA riskini artırabilir. Greft arterlerin endotel hücre (EC) astar insan GA korunmuş ve AT astar bitişik intima en yüzeysel bölgelerinde en yoğun IFN-γ üreten T hücreleri ve makrofajlar ¹¹ ana-türetilmiş tarafından sızmış site olduğunu, içinde GA greft EC ¹⁶ ama damarları bağlamak donör özel alloantikorların gelişimi ile ilişkili bazı hastalarda Akut antikor aracılı ret ¹¹ özelliğidir fibrinoid nekroz çok az kanıt gösteriyor.

GA patogenezinde en önemli bileşeni olanintima içinde düz kas benzeri hücrelerinin çoğalması, bu süreci tutuklandı eğer, GA ilerleme pek mümkün değildir. Bizim gruptan önceki çalışma, insan koroner arter bölümlerinin intimas farenin bağışıklık yetersizliği olan bu işlem, arter donör allojen adoptif transfer insan T hücrelerine karşılık olarak genişletmek ve en alt böbrek aortlarından içine yerleştirilmiş olduğunu göstermiştir insan nötralize tarafından önlenebildi IFN- γ ^18. Ayrıca dışsal insan IFN-γ (ve orta) insan T hücrelerinin ^{15, 17} yokluğunda, bu damar grefti, vasküler düz kas hücresi (VSMC) yayılması intimal neden olabilir. (Bu not önemli olduğunu insan ve fare IFN-γ. Bu deneysel sistemde fare ana bilgisayarda dolaylı etkilerini iktidar, türler arası yok) Bu beşeri fare modelleri insan T hücre / vasküler hücre etkileşimleri yansıtan yararına ve intimal lezyonların büyük ölçüde insan (yani graft türevi) hücreler oluşurgibi klinik örneklerde gözlenmiştir, ancak klinik nakli lezyonlar dahil taşıyıcı makrofajlar ve muhtemelen diğer hücre tipleri rolü göz ardı çünkü tam klinik durum özetlemek yoktur. Bu işlem, geleneksel bir fare modeli teorik olarak tam bir konak bağışıklık sistemini içeren ve GA uygulanacak fare genetik yaklaşımlar güç sağlayan ek avantaj sağlayarak hümanize modeli sınırlamaları tamamlayan, bu sorunu çözmek olabilir. Iki en yaygın olarak kullanılan fare modelleri heterotopik kalp nakli ve ortotopik arter nakli ¹ içerir. Insan kalbi greft arterlerin intimal hücreler greft kökenli ^{5, 13, 19} ağırlıklı iken heterotopik kalp greft arterlerde geliştirmek lezyonlar büyük ölçüde, kemik iliği kökenli olasılıkla ev sahibi hücreleri, oluşur. Bu bize alternatif fare modelleri geliştirmek yol açmıştır önemli bir ayrımdır. Araya girmesiBu fare modelinde, akut hücre kaynaklı red tepkisi tamamen iki üç içinde greft tüm verici türetilmiş vasküler hücrelerde ortadan kaldırır, çünkü başka bir fare suşu alıcıya bir suşundan bir fare aort insanlardaki kronik rejeksiyon için bir model olarak daha da kısıtlı hafta ^19. Sonuç olarak, bir araya giren kap kademeli görülen sonraki değişiklikler klinikte meydana greft damar değişiklikleri için bir model olarak uygunluğu sınırlıdır hayli yapısından durum oluşturmak Decellularized geminin iskele yeniden doldurulur olan konakçı hücrelerin sadece bir yanıt vardır. Yakın zamanda bu sorunların ²¹ aşmak için iki yeni fare modeli geliştirdik. Birinci model, erkek fare, aynı kendilenmiş suşu (C57BL/6J) bir dişi alıcı bir kap kademeli bir araya girmesi içerir. İkinci model rec yoksun aynı zorlanma ve cinsiyet bir dizi fare içine vahşi bir C57BL/6J fare verici bir arter segmenti interposing içerireptor için IFN-γ (IFN-γR-KO), fare uygulaması takip IFN-γ (bir adenoviral vektörü ile fare karaciğer enfeksiyonu ile teslim edilmiştir. Burada ayrıntılı protokoller ve fare modelleri GA avantajlarını açıklar.

Protokol

Fare allogreft ve singeneik greft nakli modeli

Tüm hayvan çalışmaları Yale Üniversitesi kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komiteleri tarafından onaylanmıştır. Allogreft modeli için, erkek, 4-5 haftalık WT (C57BL/6J) veya IFN-γR-KO fareler aorta segmentleri bir uçtan kullanarak kadın alıcı, 8-12 haftalık WT abdominal aort içine yerleştirilen edildi uç mikrocerrahi anastomoz tekniği (ayrıntılar için sonraki bakınız). Singeneik greft modeli için, erkek, 4-5 haftalık WT farelerden alınan göğüs aortlarından kesimleri erkek karın aortlarından içine yerleştirilmiş olan, eski 8-12 hafta IFN-γR1-KO uçtan uca mikrocerrahi anastomoz tekniği kullanılarak. Ameliyat sonrası 1 hafta, hayvanlar 1 x 10 ⁹ PFU de Ad5.CMV-fare IFN-γ veya Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) ile iv ekildi. Serum fare IFN-γ düzeyleri 1 ELISA (eBioscience) tarafından ölçüldü ve 5 hafta adenovirüs uygulamadan sonra. Bazı hayvanlar BrdU aldıKurban önce 2 hafta içinde (Sigma-Aldrich), 100 mg / kg SC.

Uçtan uca mikrocerrahi anastomoz tekniği (Video bu bölümü için alınacaktır):

1. Donör Prosedürü

1. Ketamin (50mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile donör farelerden anestezisi.
2. Yeterli anestezi olduktan sonra, bir yatar pozisyonda bir tepsi üzerinde X8-30 büyütmede işletim mikroskop altında donör fareler yerleştirin ve göğüs duvarı hazırlanması için İyot Hazırlık Pad ve Alkol Hazırlık Pad kullanın.
3. Kaburga ve kalp ortaya çıkarmak için diyafram ile göğüs ön duvarı İnsizyon.
4. Sağ atrium açın, bir 25-gauge iğne ile 10 ml şırınga kullanarak fareler temizlemek için sol ventrikül içine heparinli 10 ml (100 U / ml) serum fizyolojik enjekte.
5. Torasik aort tüm uzunluğu ortaya çıkarmak için kalp ve akciğer rezeke.
6. Doğrudan travma, whil en aza indirmek için dikkatli bir şekilde torasik aorta incelemeke, tanımlamak Arter ve aort yakın 11-0 sütür kullanarak kereste dalları bölün.
7. Bir kez torakal aort çevreleyen doku, nakli için tüketim tüm torasik aort içermez.
8. (100 U / ml) heparinli serum fizyolojik ile donör aort kesik ucuna yıkayın ve nakli kadar buz üzerinde aynı çözümü (en fazla 6 saat) saklayın.

2. Alıcı Prosedürü

1. Analjezi için ip ketoprofen (5 mg / kg) ile alıcı farelere enjekte edilir, ve ip ketamin (50 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile fareler thenanesthetize. Alıcı farenin 60-90 dakika kadar bir süre için 10 dakika içinde derin anestezi uygulanır. Ameliyat sırasında, anestezi düzeyi forseps kullanarak karın ön duvarı ya da yürüyerek kısma her 15 dakikada değerlendirilir. Hayvan ameliyat sırasında her zaman zararlı uyaranlara tepki ise, ketamin ve ksilazin (1/4 veya 1/3 orijinal doz) ek bir doz sc veya im tarafından idare edilecektir
2. Yeterli anestezi olduktan sonra, bir elektrikli tıraş makinesi kullanarak karın ön duvarında kürk traş,, İyot Hazırlık Pad ve Alkol Hazırlık Pad kullanarak cilt temizlemek oftalmik merhem kullanarak göz kapağı. Ameliyat sırasında, aşağıdaki aseptik teknikler,% 10 çamaşır suyu ile ameliyat masasına temizlik steril eldiven ve steril mikrocerrahi aletleri (operasyonun başlaması için buharla sterilize aletler, sonra sıcak cam boncuk-sterilize kullanarak da dahil olmak üzere işlemleri için kullanılacak çoklu işlemleri, vb) arasında aletleri.
3. Bir yatar pozisyonda bir tepsi üzerinde X8-30 bir büyütmede işletim mikroskop altında alıcı fareler yerleştirin.
4. Xiphoid gelen pubis için orta hatta karın duvarı kesilirken, ve karın boşluğuna ortaya çıkarmak için bir mikro-retraktör kullanarak dışında karın duvarı yayıldı.
5. Superior bağırsak geri çekin ve gazlı bez ile sarın serum fizyolojik ile nemlendirilmiş. Alıcı fareler İşitme kaybı ile soğutulmuş olurdışsallaşmış bağırsak yoluyla t. Bu hayvan sıcaklık korumak için önemlidir. Mütevazı hipotermi aortik kan akımı tıkanıklığı gibi farenin gövdesinin alt yarısına yok kan akımı ile verimsiz ısı transferi yoktur sırasında omurilik hasarın önlenmesinde yararlı olduğu gibi Ancak, ısıtma kartı ameliyat sırasında kullanılmaz.
6. , Altta üreme organları hareket tuzlu-çözüm-nemlendirilmiş gazlı bez ile alıcı farelerin karın alanları sarın ve karnın sağ tarafına rektum geri çekmek için kullanabilirsiniz. Maruz kalan dokular nakli sırasında serum fizyolojik ile düzenli olarak sulanmaktadır.
7. Distale açık açık böbrek proksimal gemi ve aort çatallanma arasında infrarenal aorta bir segment incelemek ve dikkatle inferior vena kava (IVC) ayrı.
8. Belirlenmesi ve 11-0 Polyamid Monofilament dikiş kullanılarak abdominal aorta bu segmentte kaynaklanan küçük dalları tüm Arter.
9. A çapraz kelepçe izole segmentidışında yakın nedeni 5 mm, her sonunda bir iki damar kelepçeler kullanarak bdominal aort.
10. Anastomoz siteleri oluşturmak için keskin mikro-makas kullanarak kelepçeler arasındaki abdominal aort transect.
11. Donör aort greft karşılamak için kesilen alıcı aort bir kesik ucundan abdominal aorta (uzunluk en fazla 0.4 mm) küçük bir kesimi rezeke.
12. Kan artıkları çıkarmak için heparinli serum fizyolojik ile kelepçeler arasındaki aort segmentleri yıkayın. Kelepçeler ve donör aort greft arasındaki aort segmentleri anastomoz sırasında heparinize (100 U / ml) serum fizyolojik (en fazla 40 ml / kg) ile periyodik olarak sulanmaktadır.
13. Nakli için uzunluğu 2.5 mm bir segment greft oluşturmak için keskin mikro-makas ile donör aort her iki transect.
14. Bir son-t, sırasıyla ortotopik konumu, abdominal aort alıcının proksimal ve distal kesik ucuna anastomoz donör greft en yakın ve uzak uç, en donör aort greft yerleştirin11-0 Polyamid Monofilament dikiş kullanarak o uç desen.
15. Sürekli dikişler için, konaklama 3 de dikiş ve öncelikle 09:00 pozisyonları yerleştirin. Greft her iki tarafında iki konaklama sütür arasında anastomoz kesme çalışan dikiş kullanarak 3-4 dikiş kenarları, ve her ikisi de çift düğüm ile dikiş kalmak için çalışan sütür kravat. Kapağın her iki tabaka sürekli olduğu, ayrılma riski artar. Donör aort greft abdominal aortun alıcının proksimal ve distal kesik ucunu bağlamak için uygun uzunlukta olmalıdır.
16. Kesintiye dikişler için, 3 dört anastomoz inşa ve öncelikle greft her iki tarafında 9 hizasında ve greft her iki tarafında iki konaklama sütür arasında 3-4 dikiş hem kesim kenarları anastomoze.
17. Greft içine retrograd akışına izin vermek için distal kelepçe bırakın, kanama siteleri belirlemek ve 3 dakika içinde ek dikiş yapmak.
18. Tatmin edici hemostaz olduktan sonra, proksimal kelepçe bırakın.
19. Abdominal aorta ve inferior mezenterik arter distal komşu segmentinde özellikle, greft içinde güçlü nabız varlığı ve yerli abdominal aort proksimal komşu segment greft açıklığı onaylayın. Nabız kan akımının restorasyon sonra birkaç dakika içinde azalır eğer anastomoz sitelerinde tromboz düşünün.
20. Karın boşluğuna bağırsak dönün.
21. Sırasıyla, kas tabakası ve deri tabakasında 5-0 Naylon sütür kullanarak karın duvarı kapatmak dikin.
22. Bir ısıtma yastığı üstüne temiz bir kafes içine alıcı fareler yerleştirin ve bilinç kazanmak ve anestezi kurtarmak için fareler için 1-2 saat bekleyin. Bu kurtarma sırasında hayvanın yeterli sıcaklık korumak için önemlidir. Anestezi hayvan ardından önce sıcak ve kuru kafeste fareler tutun.
23. Fareler kurtarma sonra, tekrar ikinci gününde arka ekstremite motor fonksiyon değerlendirin. Başarılı bir transplantasyon cerrahi teyit edilecektir if arka bacaklarda hiçbir disfonksiyon ikinci gününde alıcı farelerde görülmektedir.
24. Içme suyu Ketoprofenin ile alıcı farenin yönetme (5 mg / kg / gün = 27 ug / içme suyu ml) 48 saat boyunca gerçekleştirilebilir. Damat, anormal demetler halinde duruş, vb hareketlilik, başarısızlık kaybı ile kanıtlandığı gibi herhangi bir alıcı fareler postoperatif analjezik tarafından giderilemeyen ağrı muzdarip, bunlar ötenazi olacak. Hayvanlar 1-60 gün sonra önceden tanımlanmış son noktalarında ötenazi olacaktır.

Greft analizi

Allogreftte arter greft (5 hafta viral enfeksiyon sonrası) 6 hafta operasyon sonrası vardı singeneik greft modelinde 4 hafta ve greft de temin ve Elastica-van Gieson (EVG) boyama, hematoksilen ve eozin (HE) için standart histolojik teknikler ile analiz edildi boyama ve immünofloresan boyama. Resimler bir immunofloresan mikroskop sistemi (Zeiss) ile alınmıştır. Pozitif immün çevrili çekirdeklerin hücre sayımı gerçekleştirmek olduyüksek büyütme altında ed ve her bir greft için 5 kesitler gelen ortalama. Lümen (endotel içinde), intima (endotel ve internal elastik lamina arasında, IEL), medya (IEL ve dış elastik lamina arasında, EEL), duvar kalınlığı (endotel ve dış elastik lamina arasında) greft alan ölçümleri ve bütün damar (EEL içinde) bilgisayar destekli görüntü analizi ve NIH Image 1.60 (kullanarak, her bir greft için ayrı 5 seri kesitleri, 150 mikron hesaplanmıştır http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).

İstatistiksel analizler

Tüm veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. Iki kuyruklu, çift t testi ve bir iki-yönlü varyans analizi Prism yazılım programı (GraphPad Software) kullanılarak yapıldı. P <0.05 ile farklılık istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Sonuçlar

Fare allogreft arteryoskleroz (GA) modeli: Bu modelde, bir erkek donör aort ana üzerinde sentezlenen küçük bir-Y antijeni (erkek-spesifik küçük histokompatibilite antijeni HY) karşı alloreactive T hücre aracılı immün tepkilerini getirir, böylece dişi alıcıya nakledilir greft ¹² ve sırayla T diğer organ transplantasyonu modellerinde ^2'de görüldüğü gibi, IFN-γ diskler VSMC proliferasyonunu ^{20, 6, 8-10, 14} hücre üretti. Bir donör erkek gelen...

Tartışmalar

Açıklanan protokoller fare GA modelleri odaklandık. Prosedürleri diğer grefti modeller uygulanabilir. Bu modeller insanlaşmış ksenogreft (yani insan koroner arter segmentleri bağışık yetmezliği olan farelerin alt-böbrek aortlarından içine interpoze) ve akut rejeksiyon fare GA modeli (yani başka bir genetik gerginlik alıcı içine bir genetik gerginlik bir fare aort) içerir. Bizim tarif fare modelleri insan GA lezyonlar kapatmak için daha fazladır. Birinci model, erkek fare, aynı k...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664	Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks)
Ketamine Hydrochloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053	Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution	Lloyd Inc.	NADA# 139-236	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml)
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml)
Heparin Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400	Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml)
Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride)	CareFusion	AL4109
0.9% Sodium Chloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10	To prepare the anesthetic
Petrolatum Ophthalmic Ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Microscope	Leica	MZ95
Micro Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5693
Spring Scissors	F.S.T	15009-08	To transect the aorta of donor or recipient
Extra Narrow Scissors	F.S.T	14088-10
Needle Holder/Forceps	MICRINS	MI1542	To hold the needle
Fine Forceps	F.S.T	11254-20
Forceps	F.S.T	11251-35
Standard Pattern Forceps	F.S.T	11000-12
Forceps	F.S.T	13011-12
LANCASTER Eye Speculum	Zepf Medical Instruments	42-1209-07
Micro Vascular Clip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6472
Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5440
Black Polyamide Monofilament Suture	AROSurgical Instruments Corporation	Cat #T4A10Q07	10-0 suture, Needle=70 microns
Black Monofilament Nylon Suture	Syneture (Covidien)	SN-1956	6-0 suture
Non-Woven Songes	McKesson Corp.	Reorder No. 94442000
1 ml Syringe	BD	REF 309659
3 ml Syringe	BD	REF 309657
10 ml Syringe	BD	REF 309604
18G 1 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305196
25G 7/8, Hypodermic Needle	BD	REF 305124
27G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305109
30G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305106
Hearting Pad	Sunbeam	Z-1228-001
Trimmer	Wahl	9854-500
Table 2. Specific reagents and equipment.