Modelli murini per l'arteriosclerosi Graft

Riepilogo

Descriviamo i protocolli per i nostri arteriosclerois innesto del mouse (GA) modelli che comportano l'interposizione di un segmento di vaso del mouse in un destinatario dello stesso ceppo inbred. Con backcrossing ulteriori cambiamenti genetici nella nave cedente, il modello è in grado di valutare l'effetto di geni specifici in GA.

Abstract

Arteriosclerois Graft (GA), chiamati anche vasculopatia allotrapianto, è una lesione patologica che si sviluppa nel corso di mesi o anni di organi trapiantati caratterizzate da diffusa, stenosi circonferenziale dell'intero albero vascolare del trapianto. Il componente più critico di GA patogenesi è la proliferazione di cellule muscolari lisce-simili all'interno dell'intima. Quando un segmento di arteria coronaria umana è interposto nel aortae infra-renale di topi immunodeficienti, le intimas potrebbero essere espandono in risposta a cellule T umane adoptively trasferiti al donatore allogenico un'arteria o esogena umana IFN-γ in assenza di cellule T umane. Interposizione di una aorta topo da un ceppo in un altro ceppo ricevente topo è limitato come modello per rigetto cronico nell'uomo perché la risposta cellulo-mediata rigetto acuto in questo modello di topo elimina completamente tutte derivate dal donatore cellule vascolari del trapianto entro due-tre settimane. Abbiamo recentemente sviluppato due nuovi mOuse modelli per aggirare questi problemi. Il primo modello prevede l'interposizione di un segmento del vaso da un topo maschio in una femmina destinatario dello stesso ceppo inbred (C57BL/6J). Rigetto in questo caso è diretto solo contro antigeni di istocompatibilità minori codificate dal cromosoma Y (presente nel maschio, ma non la femmina) e la risposta di rifiuto che ne deriva è sufficientemente indolente di conservare le cellule muscolari lisce derivate dal donatore per diverse settimane. Il secondo modello prevede l'interposizione di un segmento di arteria da un tipo donatore C57BL/6J topo selvatico in un topo ospite dello stesso ceppo e genere che manca il recettore per IFN-γ seguita da somministrazione di topo IFN-γ (distribuito mediante infezione del mouse fegato con un vettore adenovirale. Non c'è rigetto in questo caso come donatore e topi riceventi sono dello stesso ceppo e genere ma donatori cellule muscolari lisce proliferano in risposta alla citochina mentre ospitanti cellule derivate, privo recettore perquesta citochina, non rispondono. Con backcrossing ulteriori cambiamenti genetici nella nave cedente, entrambi i modelli possono essere utilizzati per valutare l'effetto di geni specifici sulla progressione GA. Qui, descriviamo protocolli dettagliati per i nostri modelli di mouse GA.

Introduzione

Arteriosclerois Graft (GA), chiamati anche vasculopatia allotrapianto, è una lesione patologica che si sviluppa nel corso di mesi o anni di organi trapiantati caratterizzate da diffusa, stenosi circonferenziale dell'intero albero vascolare dell'innesto ^7. Fasi precoci possono causare stenosi eccentriche e focale che sono più evidenti nelle arterie, quindi più da vicino assomiglia stenosi visto in aterosclerosi convenzionale. La perdita lume dei vasi dell'innesto risultati espansione intimale causa di infiltrazioni di cellule T e macrofagi ospite e soprattutto per l'accumulo di matrice extracellulare e di muscolo liscio-come cellule originati da trapianto, host o entrambi ^{5, 13, 19,} che è insufficientemente compensata da esterno nave rimodellamento. In allotrapianti cardiaci, le lesioni clinicamente più significative sono quelle nelle arterie coronarie e epicardiche intramiocardica. In definitiva, GA delle arterie coronarie provoca insufficienza cardiaca ischemica. GA è la principale causa di ritardo gr cardiacoperdita di poppa. Le stenosi di GA fermano le linee di sutura, che implica fortemente la risposta dell'ospite a alloantigeni innesto nella sua patogenesi e che ci porta a classificare GA come una forma di rigetto cronico ^3. Tuttavia, altre forme di lesione arteriosa può aumentare il rischio di GA, sia attraverso aumentando il carico netto di lesioni o intensificando e / o modulare la risposta allo immune. La cella (CE) rivestimento endoteliale delle arterie innesto viene conservata in GA umano e le regioni più superficiali del intimale adiacente al rivestimento CE è il sito più pesantemente infiltrati da host-derived IFN-γ-producono cellule T e macrofagi ^11; nella alcuni pazienti GA è associato con lo sviluppo di alloanticorpi donatore-specifici che si legano a innesto EC ¹⁶ ma i vasi mostrano poca prova della necrosi fibrinoide che è caratteristica di rigetto acuto anticorpo-mediata ^11.

Il componente più critico di GA patogenesi è laproliferazione di cellule muscolari lisce-simili all'interno del intima, se questo processo può essere arrestato, GA è improbabile a progredire. Precedente lavoro del nostro gruppo aveva dimostrato che intimas di segmenti di arterie coronariche umane interposti nella aortae infra-renale di topi immunodeficienti espandono in risposta a cellule T umane allogeniche adoptively trasferiti al donatore arteria e che questo processo potrebbe essere inibito neutralizzando umana IFN- γ ^18. Inoltre esogeno IFN-γ umano potrebbe causare intimale (e mediale) cellule muscolari lisce (VSMC) proliferazione vascolare in questi innesti arteriosi in assenza di cellule umane T ^{15, 17.} (E 'importante notare che uomo e topo IFN-γ non attraversare specie, escludendo gli effetti indiretti sulla ospite del mouse in questo sistema sperimentale). Questi modelli di topo umanizzato hanno il vantaggio di ricapitolare cellule T umano / interazioni delle cellule vascolari e il intimale Le lesioni sono in gran parte costituiti da cellule umane (cioè graft-derivato),Come è stato osservato in campioni clinici, ma non ricapitolare appieno la situazione clinica perché ignorano il ruolo dei macrofagi ospitanti e forse altri tipi di cellule coinvolte nelle lesioni trapianti clinici. Un modello convenzionale topo di questo processo potrebbe teoricamente risolvere questo problema, integrando le limitazioni del modello umanizzato coinvolgendo un sistema completo immunitario ospite e fornendo l'ulteriore vantaggio di permettere la potenza di approcci genetici topo da applicare a GA. I due modelli di mouse più diffusi riguardano il trapianto di cuore eterotopico e arteria trapianto ortotopico ^1. Le lesioni che si sviluppano nelle arterie dei trapianti di cuore eterotopico sono in gran parte costituiti da cellule ospiti, probabilmente di origine midollare, mentre le cellule intimale delle arterie a innesti cardiaci umani sono prevalentemente di origine innesto ^{5, 13, 19.} Questa è una distinzione importante, che ha portato a sviluppare modelli alternativi del mouse. Interposizione diuna aorta topo da un ceppo in un altro ceppo ricevente mouse è ancora più limitata come modello per rigetto cronico nell'uomo perché la risposta cellulo-mediata rigetto acuto in questo modello di topo elimina completamente tutte le cellule vascolari derivate dal donatore dal trapianto entro due-tre ¹⁹ settimane. Di conseguenza, le successive variazioni visti nel segmento del vaso interposto sono solo una risposta di cellule ospiti che hanno ripopolato il decellularized nave patibolo, creando una situazione estremamente artefatta di scarsa rilevanza come modello per i cambiamenti di vasi di innesto che si verificano nella clinica. Abbiamo recentemente sviluppato due nuovi modelli di mouse per aggirare questi problemi ^21. Il primo modello prevede l'interposizione di un segmento del vaso da un topo maschio in una femmina destinatario dello stesso ceppo inbred (C57BL/6J). Il secondo modello prevede l'interposizione di un segmento di arteria da un tipo donatore C57BL/6J topo selvatico in un topo ospite dello stesso ceppo e genere che manca della receptor per IFN-γ (IFN-γR-KO), seguito da somministrazione di IFN-γ del mouse (distribuito mediante infezione del fegato del topo con un vettore adenovirale. Qui, descriviamo protocolli dettagliati ed i vantaggi dei nostri modelli murini GA.

Protocollo

Topo allotrapianto e singenico modello di trapianto di innesto

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dalla cura degli animali istituzionale e comitati uso di Yale. Per il modello di allotrapianto, segmenti di aorta toracica da maschio, 4-5 settimane vecchia WT (C57BL/6J) o IFN-γR-KO sono stati interposti in aorta addominale del destinatario femminile, 8-12 settimane di età WT utilizzando un end-to -end microchirurgico tecnica anastomotica (vedi successivo per i dettagli). Per il modello innesto singenico, segmenti di aortae toracica da Male, la settimana 4-5 topi WT sono stati interposti nella aortae addominale del maschio, 8-12 settimane di età IFN-γR1-KO con una soluzione end-to-end microchirurgico tecnica anastomotica. Dopo 1 settimana dopo l'intervento, gli animali sono stati inoculati iv con Ad5.CMV-topo IFN-γ o Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) a 1 x 10 ⁹ PFU. Siero del mouse IFN-γ livelli sono stati misurati mediante test ELISA (eBioscience) a 1 e 5 settimane dopo la somministrazione di adenovirus. Taluni animali hanno ricevuto BrdU(Sigma-Aldrich) a 100 mg / kg sc per 2 settimane prima del sacrificio.

End-to-end microchirurgica tecnica anastomotica (video verranno intraprese per questa parte):

1. Procedura donatore

1. Anestetizzare i topi donatori con iniezioni intraperitoneali di ketamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg).
2. Dopo aver verificato l'anestesia adeguata, mettere i topi donatori sotto il microscopio operatorio a X8-30 ingrandimento su un vassoio in posizione supina, e l'uso di iodio Prep Pad e alcol Prep Pad per la preparazione della parete toracica.
3. Incidere la parete toracica anteriore attraverso le nervature e il diaframma per esporre il cuore.
4. Aprire l'atrio destro, iniettare 10 ml di eparina (100 U / ml) di soluzione salina nel ventricolo sinistro per svuotare i topi utilizzando una siringa da 10 ml con un ago calibro 25.
5. Resecare cuore e polmoni per esporre l'intera lunghezza dell'aorta toracica.
6. Sezionare attentamente l'aorta toracica per minimizzare il trauma diretto, while identificare, legare e sezionare i rami legname che utilizzano 11-0 sutura vicino l'aorta.
7. Una volta che l'aorta toracica è libera dal tessuto circostante, accise tutta aorta toracica per il trapianto.
8. Lavare l'estremità del taglio dell'aorta donatore con eparina (100 U / ml) di soluzione salina, e memorizzarlo nella stessa soluzione sul ghiaccio (fino a 6 ore) fino al trapianto.

2. Procedura destinatario

1. Iniettare i topi riceventi con ip ketoprofene (5 mg / kg) per l'analgesia, e thenanesthetize i topi con ketamina ip (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). I topi riceventi sono profondamente anestetizzati entro 10 minuti per una durata di 60-90 min. Durante l'intervento, il livello di anestesia viene valutata ogni 15 min da pizzicare la parete addominale anteriore o il piede con pinze. Se l'animale reagisce agli stimoli nocivi in ​​qualsiasi momento durante l'intervento, un'ulteriore dose di chetamina e xilazina (1/4 o 1/3 della dose originale) sarà somministrato per sc o im
2. Dopo aver verificato l'anestesia adeguata, radere il pelo nella parete addominale anteriore con un rasoio elettrico, pulire la pelle con Iodio Prep Pad e alcol Prep Pad, coprire gli occhi con pomata oftalmica. Durante la chirurgia, le seguenti tecniche asettiche saranno utilizzati per le operazioni di pulizia, compreso il tavolo operatorio con 10% di candeggina, indossando guanti sterili e utilizzando strumenti di microchirurgia sterilizzati (strumenti sterilizzati per l'inizio dell'operazione, vetro poi caldo bead-sterilizzato strumenti tra i più operazioni, ecc.)
3. Collocare i topi riceventi al microscopio operativo ad un ingrandimento di X8-30 su un vassoio in posizione supina.
4. Incidere la parete addominale sulla linea mediana da xifoidea al pube, e diffondere la parete addominale le superfici usando un micro-retrattore per esporre la cavità addominale.
5. Ritrarre l'intestino superiormente e avvolgere con una garza inumidita con soluzione fisiologica. I topi riceventi soffrano il freddo da perdita di heaT attraverso intestino esternalizzati. È importante mantenere il calore animale. Tuttavia, il bordo del riscaldamento non viene usato durante la chirurgia come modesta ipotermia è utile per prevenire lesioni spinali durante l'occlusione del flusso ematico aortico e vi è poco efficiente trasferimento di calore con il flusso di sangue assente alla metà inferiore del corpo topi.
6. Spostare gli organi riproduttivi inferiormente, avvolgere le zone addome di topi riceventi con garza salina-soluzione-inumidito, e usarlo per ritrarre il retto al lato destro dell'addome. I tessuti esposti sono irrigati periodicamente con soluzione salina durante il trapianto.
7. Sezionare senza mezzi termini un segmento di aorta sottorenale tra il vaso renale prossimale e distale biforcazione aortica e separare dalla vena cava inferiore (IVC) con attenzione.
8. Identificare e legare tutti i piccoli rami provenienti da questo segmento di aorta addominale utilizzando 11-0 poliammide monofilamento sutura.
9. Cross-clamp il segmento isolato di unaaorta bdominal utilizzando due morsetti vascolari proximately 5 millimetri a parte, uno ad ogni estremità.
10. Transezione l'aorta addominale tra il morsetto con taglienti micro-forbici per creare i siti anastomosi.
11. Resecare un piccolo segmento di aorta addominale (fino a 0,4 mm di lunghezza) da una estremità tagliata di transected destinatario aorta per accogliere il graft aortico donatore.
12. Lavare i segmenti aortici tra i morsetti utilizzando soluzione fisiologica con eparina per rimuovere il sangue residuo. I segmenti aortici tra morsetti e l'innesto aortico donatore sono irrigati periodicamente con eparina (100 U / ml) di soluzione salina (fino a 40 ml / kg) durante anastomosi.
13. Transezione entrambi i lati del donatore aorta con taglienti micro-forbici per creare un innesto segmento di 2,5 mm di lunghezza per il trapianto.
14. Posizionare l'innesto aortico donatore in posizione ortotopico, anastomose estremità prossimale e distale del donatore dell'innesto a fine taglio prossimale e distale del destinatario dell'aorta addominale, rispettivamente, con un fine-tmodello o-end utilizzando 11-0 poliammide monofilamento sutura.
15. Per le continue suture, posizionare i punti di sutura soggiorno a 3 e 9 posizioni in primo luogo. Tra due suture a ogni lato del graft, anastomose entrambi i bordi tagliati in 3-4 punti utilizzando le suture in esecuzione, e legare le suture in esecuzione per rimanere suture con un doppio nodo. Poiché i due strati di chiusura sono continui, il rischio di deiscenza è aumentato. L'innesto aortico donatore dovrebbe essere di lunghezza adeguata per collegare all'estremità di taglio prossimale e distale del destinatario della aorta addominale.
16. Per i punti staccati, costruire quattro anastomosi a 3 e 9 posizioni in entrambi i lati del trapianto in primo luogo, e anastomose entrambi i bordi tagliati in 3-4 punti di sutura tra due punti di sutura soggiornare in ogni lato del trapianto.
17. Rilasciare il morsetto distale per consentire il flusso retrogrado in trapianto, identificare le sedi di sanguinamento e fare punti aggiuntivi entro 3 minuti.
18. Dopo aver accertato l'emostasi soddisfacente, allentare il morsetto prossimale.
19. Confermare la pervietà dell'innesto dalla presenza di pulsazione vigorosa l'innesto e il segmento adiacente prossimale dell'aorta addominale nativa, in particolare nel segmento adiacente distale dell'aorta addominale e mesenterica inferiore. Considerare trombosi in siti anastomotiche se la pulsazione diminuisce nel giro di pochi minuti dopo il ripristino del flusso sanguigno.
20. Restituire l'intestino nella cavità addominale.
21. Suturare chiudere la parete addominale utilizzando 5-0 sutura in nylon strato muscolare e lo strato della pelle, rispettivamente.
22. Mettere i topi riceventi in una gabbia pulita sulla sommità di una piastra elettrica, e aspettare 1-2 ore per i topi a riprendere coscienza e recuperare da anestesia. È importante mantenere un'adeguata animale calore durante il recupero. Tenere i topi in gabbia caldo e asciutto prima di scia animale dall'anestesia.
23. Valutare la funzione motoria degli arti posteriori dopo il recupero topi, e di nuovo il secondo giorno. Un intervento chirurgico di trapianto di successo verrà confermato if nessuna disfunzione degli arti posteriori è osservata in topi riceventi il ​​secondo giorno.
24. Amministrare i topi riceventi con ketoprofene in acqua potabile (5 mg / kg / d = 27 ug / ml in acqua potabile) per 48 ore. Se alcuni topi riceventi soffrono di dolore non trattato dagli analgesici postoperatori come dimostra la perdita di mobilità, il mancato sposo, anormale ricompattato postura, ecc, saranno sacrificati. Gli animali saranno sacrificati a fine punti predefiniti dopo 1-60 giorni.

Analisi Graft

Innesti di arteria del trapianto sono stati acquistati a 4 settimane e innesti a modello dell'innesto singenico erano sei settimane dopo l'intervento (5 settimane dopo l'infezione virale) e analizzati mediante tecniche istologiche standard per Elastica-van Gieson (EVG) colorazione ematossilina eosina (HE) colorazione e colorazione di immunofluorescenza. Foto sono state scattate con un sistema di microscopia di immunofluorescenza (Zeiss). Conteggio delle cellule di nuclei circondati da immunoistochimica positiva è stata eseguireed in alto ingrandimento e in media da 5 sezioni per ogni innesto. Le misurazioni dell'area innesto del lume (entro l'endotelio), intimale (tra la lamina elastica interna ed endotelio, IEL), media (tra il IEL e della lamina elastica esterna, EEL), spessore di parete (tra la lamina elastica esterna ed endotelio) e vaso intero (entro l'anguilla) sono stati calcolati da 5 seriali sezioni, 150 micron a parte per ogni innesto, utilizzando l'analisi computer-assistita e NIH Immagine 1.60 ( http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).

L'analisi statistica

Tutti i dati sono espressi come media ± SEM. Due code, t test appaiati e un due vie ANOVA = analisi sono state eseguite utilizzando il programma software Prism (GraphPad Software). Differenze con p <0,05 sono stati considerati come statisticamente significativi.

Risultati

Topo modello allotrapianto arteriosclerosi (GA): In questo modello, un donatore maschio aorta viene trapiantato nel ricevente femmina modo che l'host induce risposte allo-mediate da cellule T alloreattive contro un antigene Y minore (il maschio-specifico minore di istocompatibilità HY) espressi sul l'innesto ^12, ed a sua volta prodotta da cellule T γ-IFN azionamenti VSMC proliferazione ²⁰ come osservato in altri modelli di trapianto allogenico ^{2, 6, 8-10, 14.} U...

Discussione

I protocolli descritti si concentrano su modelli murini GA. Le procedure possono essere applicate ad altri modelli di trapianto innesto. Questi modelli includono xenotrapianto umanizzato (cioè segmenti di arterie coronariche umane interposti nella aortae infra-renale di topi immunodeficienti), e il rigetto acuto del mouse modello GA (cioè una aorta mouse da un ceppo genetico in un altro ceppo ricevente genetica). I nostri modelli murini descritti sono più per chiudere le lesioni GA umani. Il primo m...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664	Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks)
Ketamine Hydrochloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053	Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution	Lloyd Inc.	NADA# 139-236	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml)
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml)
Heparin Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400	Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml)
Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride)	CareFusion	AL4109
0.9% Sodium Chloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10	To prepare the anesthetic
Petrolatum Ophthalmic Ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Microscope	Leica	MZ95
Micro Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5693
Spring Scissors	F.S.T	15009-08	To transect the aorta of donor or recipient
Extra Narrow Scissors	F.S.T	14088-10
Needle Holder/Forceps	MICRINS	MI1542	To hold the needle
Fine Forceps	F.S.T	11254-20
Forceps	F.S.T	11251-35
Standard Pattern Forceps	F.S.T	11000-12
Forceps	F.S.T	13011-12
LANCASTER Eye Speculum	Zepf Medical Instruments	42-1209-07
Micro Vascular Clip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6472
Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5440
Black Polyamide Monofilament Suture	AROSurgical Instruments Corporation	Cat #T4A10Q07	10-0 suture, Needle=70 microns
Black Monofilament Nylon Suture	Syneture (Covidien)	SN-1956	6-0 suture
Non-Woven Songes	McKesson Corp.	Reorder No. 94442000
1 ml Syringe	BD	REF 309659
3 ml Syringe	BD	REF 309657
10 ml Syringe	BD	REF 309604
18G 1 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305196
25G 7/8, Hypodermic Needle	BD	REF 305124
27G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305109
30G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305106
Hearting Pad	Sunbeam	Z-1228-001
Trimmer	Wahl	9854-500
Table 2. Specific reagents and equipment.