Silenciar a largo plazo de Intersectin-1 en los pulmones de ratones por entrega repetida de un siRNA específico a través de liposomas catiónicos. Evaluación de Efectos desmontables de Microscopía Electrónica

Resumen

Inyecciones retro-orbitales repetidas de complejos catiónicos liposomes/siRNA/ITSN-1s en ratones, cada 72 horas durante 24 días, eficiente entregar el dúplex siARN de la microvasculatura pulmonar del ratón la reducción de ARNm ITSN-1s y expresión de la proteína en un 75%. Esta técnica es altamente reproducible en un modelo animal, no tiene efectos adversos y evita accidentes mortales.

Resumen

Estudios anteriores mostraron que desmontables de ITSN-1s (KD _ITSN), una proteína implicada en la regulación endocítica permeabilidad vascular pulmonar y células endoteliales (EC) la supervivencia, la muerte celular apoptótica inducida, un obstáculo importante en el desarrollo de un sistema de cultivo celular con prolongada ITSN-1s inhibición ^1. Utilizando liposomas catiónicos como vehículos, exploramos el silenciamiento de genes ITSN-1 en los pulmones de ratones mediante la administración sistémica de siRNA dirigidos ITSN-1 gen _(ITSN siRNA). Los liposomas catiónicos ofrecen varias ventajas para la salida del siRNA: caja fuerte con dosificación repetida, no inmunogénico, no tóxico, y fácil de producir ^2. Los liposomas rendimiento y la actividad biológica dependen de su tamaño, carga, composición de lípidos, la estabilidad, la dosis y la vía de administración ³ Aquí, eficiente y _ITSN KD específica en los pulmones del ratón se ha obtenido mediante una combinación bromuro de amonio y dimetil dioctadecil colesterol. La administración intravenosade _ITSN siRNA / complejos de liposomas catiónicos transitoriamente derribaron proteína ITSN-1 y mRNA en los pulmones de ratones en el día 3, que se recuperó después de 3 días adicionales. Tomando ventaja de los liposomas catiónicos como un portador seguro repetible, el estudio extendió durante 24 días. Por lo tanto, el tratamiento retro-orbital con complejos recién generados se administró cada 3 días, induciendo _ITSN KD sostenida a lo largo del estudio ^4. Tejidos de ratón recogidos en varios puntos de tiempo post-siRNA _ITSN fueron sometidos a análisis de microscopía electrónica (EM) para evaluar los efectos de la crónica KD _ITSN, en el endotelio pulmonar. De alta resolución de imágenes EM nos permitió evaluar los cambios morfológicos causados ​​por KDITSN en el lecho vascular pulmonar (es decir, la interrupción de la barrera endotelial, disminución del número de caveolae y la regulación positiva de las vías de transporte alternativos), las características no detectables por microscopía de luz. En general estos resultados establecieron un importantetante papel de ITSN-1 en la función de EC y la homeostasis de pulmón, mientras que ilustra la eficacia de la entrega de siRNA-liposomas in vivo.

Introducción

ARNsi desnudo no puede penetrar la membrana celular, siendo cargado negativamente, y es fácilmente degradado por enzimas en la sangre, tejidos y células. Incluso con recientemente modificaciones estructurales para mejorar la estabilidad, la acumulación de siRNA en el sitio diana después de la administración es extremadamente baja y requiere un vehículo intracelular eficiente ^5. Los liposomas catiónicos surgieron como seguras ácidos nucleicos portadores con el potencial de transferir grandes piezas de ADN / ARN en las células mediante la encapsulación y la protección de los ácidos nucleicos a partir de la degradación enzimática ^6. También, los liposomas catiónicos espontáneamente interactúan con el ADN / ARN, promoviendo así la transferencia de genes a las células ^2. Más recientemente, los liposomas se han aplicado para entregar vacunas y fármacos de bajo peso molecular ^7. Entrega liposomal de microARN-7-plásmido que expresa supera factor de crecimiento epidérmico receptor de la tirosina quinasa inhibidor de la resistencia en las células de cáncer de pulmón ^8. Cuando el objetivo es laendotelio vascular, la administración intravenosa es esencial, ya que los complejos son poco probable que cruzar la barrera endotelial y extravasación en el intersticio ^9. En comparación a otros órganos, ECs de la microvasculatura del pulmón tener el mayor absorción y ávidamente internalizar liposomas catiónicos y complejos de ADN / ARN, seguido por los ganglios linfáticos y los parches de Peyer ^9. La entrega por vía intravenosa en modelos de roedores de ARNsi a través de inyecciones en la vena retro-orbital o de la cola ha sido probado ser inofensivas incluso en altas concentraciones, tales como 50 mg / kg ^10. En la literatura publicada la composición de los liposomas catiónicos es diferente, basada en la formulación de lípidos y su relación equimolar ^{11, 12.} Hay una amplia gama de aplicaciones potenciales utilizando liposomas catiónicos para la entrega de genes in vivo, ya sea dirigiéndose down-regulation/over-expression de las proteínas, la entrega de vacunas o terapias anti-tumorales ^13-15. Es importante recordares que la eficiencia de ADN / ARN-interacción membrana celular está regulada por el acoplamiento de forma entre los complejos generados y lípidos de membrana. Esto sugiere que la adaptación de la composición de los lípidos de los perfiles de la membrana celular específicos puede ser beneficioso y el resultado en altas tasas de transfección en un tipo de célula particular ^6.

Protocolo

1. Los liposomas catiónicos Preparación

1. Autoclave un matraz limpio para ser utilizado para la preparación lipososmes.
2. Preparar soluciones madre:
   1. - Disolver 200 mg de bromuro de dimetil dioctadecil amonio (Doab) en 10 ml de cloroformo usando una botella de vidrio pequeño.
   2. - Disolver 200 mg de colesterol en 10 ml de cloroformo usando una botella de vidrio pequeño.
   3. - Preparar y esterilizar en autoclave para esterilizar el 5% de glucosa en 100 ml de ARN / ADN-asa agua destilada libre.
3. Enjuagar el matraz con cloroformo. Añadir 5-10 ml al matraz, remolino, y dejar que repose durante unos minutos. Mantener el matraz cubierto con papel de aluminio en todo momento. Vacíe el cloroformo del matraz.
4. Preparación de liposomas:
   1. - Añadir 315 l de Doab solución madre en el matraz de fondo redondo.
   2. - Añadir 200 l de solución madre de colesterol al matraz.
   3. - Añadir 9,5 ml de cloroformo al matraz unand mezcla por turbulencia.
5. Ajuste el rotavapor a 37 ° C, 100 revoluciones por minuto (rpm) o más (100-120 rpm). El rotavapor se debe conectar a un control de vacío de la bomba de agua con un tubo de succión conectado correctamente.
6. Conecte el tanque de gas argón y el rotavapor.
7. Coloque el matraz al rotavapor y ajustar la configuración óptima antes de bajar en el baño de agua. Abra la primera válvula para el argón completamente en sentido antihorario. Siempre abrir y cerrar la válvula de primera. La segunda válvula controla la presión de argón que sopla en al matraz. La presión debe ser siempre suave.
8. Baje el rotavapor en el baño de agua, suficiente para el frasco de tocar el agua sin estar completamente sumergida y encienda la velocidad.
9. Espere hasta que todas las cloroformo se evapora, a unos 10 min. A continuación, detenga la máquina.
10. Apague la velocidad rotavapor y las válvulas del tanque de argón. Ahora el matraz debe ser eliminado.
11. Añadir 2 ml de glucosa al 5% a the matraz para disolver los lípidos.
12. Raspe el fondo del frasco a fondo con 1 ml punta de la pipeta para disolver los lípidos. Después de rascarse, eliminar cualquier resto de grasa de la punta de 1 ml en el frasco, si es necesario, con un segundo punta.
13. Incubar la solución obtenida en el baño de agua 42 ° C, mientras que lentamente agitación (15 rpm) al matraz.
14. Llene el tanque de ultrasonidos con agua fría. Someter a ultrasonidos la solución durante al menos 20-30 minutos con el matraz mantenido y la parte inferior apenas tocando el agua.
15. Calentar el matraz en el baño de agua del evaporador rotatorio durante 20 min a 42 ° C, a velocidad cero, con el fondo redondo se sumerge en agua, esta vez.
16. Filtrar los liposomas a través de un 0,47 micras y, posteriormente, filtros de jeringa de 0,22 micrones.
17. El uso de un pequeño extrusor, filtrar los liposomas a través de una membrana de 50 nm para generar una población homogénea de vesículas de liposomas unilamelares.
18. La transferencia de los liposomas a un tubo Eppendorf y colocarlo en hielo.

2. Preparar los liposomas: siRNA ITSN-1 Complejos

1. Resuspender el ratón en-blanco _ITSN ARNsi en tampón de ARNsi que contiene 20 mM de HEPES y cloruro de sodio 150 mM, pH 7,4, a una concentración final de 2 mg / l. Guárdelo en hielo antes de la mezcla.
2. Preparación de los liposomas: _ITSN complejos de siRNA en una proporción de 8 nmol de liposomas: 2 mu g de ARN (o 400 nmol de liposomas: 100 g ARNsi _ITSN). En el presente estudio, se añadieron 50 l de _ITSN siRNA de la solución madre (50 mM) a 100 l de liposomas recién preparadas usando un ARN / ADN-asa libre de Eppendorf tubo. Tenga en cuenta que la concentración de _ITSN ARNsi es muy importante, ya que un máximo de 150 l de mezcla puede ser inyectada bilateralmente y retro-orbital en el ratón a la vez.
3. Mantenga la mezcla en hielo mientras se espera para inyectar a los ratones.

3. Ratón inyección en la vena retro-orbital (ángulo interno de la órbita del ojo)

jove_content "> Todos los experimentos con ratones se aprobaron y se realizan de acuerdo con las directrices de la Universidad Rush Institucional Cuidado de Animales y el empleo.

1. Se anestesia el ratón por inyección intra-peritoneal de un mg / kg de ketamina peso 50 corporal y 5 mg / kg de xilazina peso corporal (mezcla disponible comercialmente). Dependiendo del peso de los animales y la edad, ajuste el volumen y la concentración de los anestésicos. Los ratones utilizados en el estudio son los ratones CD1 ratones machos, de 6-8 semanas de edad y pesan alrededor de 25 gramos. Las jeringas son de tuberculina de 1 ml tipo con la aguja puesta.
2. Mantenga orejas de ratón con una mano y gire el ratón sobre un lado para exponer el ángulo interno del ojo. Apunte medial de la plica semilunar, evite tocar el globo ocular.
3. Acérquese a la carúncula lagrimal del ojo que sostiene la jeringa que contiene la mezcla en un ángulo de 45 grados en los tres ejes.
4. Inyecte lentamente la mezcla y dejar que el ratón para recuperarse con el lado inyectado arriba. Si un líquido grandeformas de gotas en el lugar de inserción de la aguja, retraer la aguja, la succión de nuevo la gota en la jeringa y vuelva a intentarlo. Las inyecciones repetidas se hacen mejor por la alternancia de los ojos, para permitir la recuperación perfecta. Si no está seguro, esta técnica se puede comprobar mediante la inyección de colorante azul (50 l, 0,5% de cristal violeta en metanol) y la exposición de los pulmones de los ratones para observar la vasculatura azul.
5. Los ratones en este estudio se inyectaron cada día 3 ^ª durante 3 semanas sin víctimas mortales o efectos adversos.

4. Ratón de perfusión pulmonar y recogida de tejidos para estudios bioquímicos

0. Establecer la bomba peristáltica para funcionar a 1,5 ml / min.
1. Preparar el entorno: ventilador, mesa de operaciones, instrumentos, hisopos de algodón estériles, q-tips, cuerdas, vasos, agua destilada, salina equilibrada de Hank, trazador.
2. Se anestesia el ratón mediante inyección intraperitoneal de la mezcla anestésica (100 mg / kg de ketamina peso corporal y 10 mg / kg de xilazina peso corporal).
3. A nivel del cuello, eliminar las glándulas salivales y exponer la tráquea.
4. Comience con la laparotomía, cortar el diafragma, y ​​seguir con la toracotomía, la exposición de los pulmones y el corazón.
5. Retire el timo.
6. Con el microscopio óptico para una mayor precisión, cateterización de la arteria pulmonar.
7. Haga traqueotomía y entubar el ratón usando el traqueostoma. Ajuste el ventilador a una velocidad de 150 golpes / min y el volumen de carrera de 150 l.
8. Como salida, abra la aurícula izquierda.
9. Perfundir la vasculatura pulmonar del ratón libre de sangre durante 5 min, usando la bomba peristáltica y solución de Hank calentado a 37 ° C.
10. Perfundir el trazador (8 nm de oro-albúmina ¹⁶⁾ para 10 min adicionales a la misma velocidad de flujo.
11. Enjuague el trazador no unido por 5 min de perfusión pulmonar con solución de Hank.
12. Siga con la fijación in situ de los pulmones por 10 min de perfusión de 4% (peso / vol) de formaldehído, 2,5% de glutaraldehído y ácido tánico al 1% en 0,1 TUBOStampón, pH 7,2.
13. Recoge los pulmones, retire el exceso de tejido, cortar pequeños bloques (3/3 mm), y colocarlos en un vial de centelleo de marcado que contiene 2 ml de la mezcla de fijador.

Los ratones caducarán completamente anestesiada durante el procedimiento.

5. Ratón pulmón Procesamiento de tejido de EM

1. Preparar soluciones madre: 1% Palade _OsO4, acetato de veronal y tampón Kellenberger.
   1. - 1% Palade-OSO tampón ₄ contiene: 1 ml de caldo de veronal de etilo, 1,25 ml de 4% OSO _4, 1 ml de ácido clorhídrico 0,1 N, y agua destilada hasta 5 ml de volumen final.
   2. - Acetato de solución madre de veronal se obtiene por disolución de 1,15 g de acetato de sodio andydrous y 2,94 g de barbital en 100 ml de agua destilada.
   3. Solución-Kellenberger contiene 2 ml de acetato de stock veronal, 2,8 ml de ácido clorhídrico 0,1 N, 0,05 g de acetato de uranilo, y 5,1 mlde agua destilada, pH = 6.
2. Lavar los bloques de pulmón en 0,1 M de cacodilato de sodio tampón, pH = 7,4, 3 veces brevemente.
3. Fijar las muestras en el 4% (peso / vol) de formaldehído, 2,5% de glutaraldehído en 0,1 TUBOS tampón, pH 7,2, durante 1 hora, a temperatura ambiente.
4. Post-arreglar con un 1% Palade-osmio durante 1 hora en la capilla, en el hielo, en la oscuridad.
5. Lavar una vez con tampón Kellenberger.
6. Incubar las muestras en tampón de Kellenberger durante 2 horas a toda la noche, a temperatura ambiente.
7. Enjuagar una vez en etanol al 50%.
8. Deshidratar con serie graduada de etanol, 5 min / cada uno: 70%, 95%, luego 2 x 15 min 100% de etanol.
9. Cambiar a óxido de propileno 100%, 2 x 15 min.
10. Eliminar el óxido de propileno y añadir una mezcla de óxido de propileno 50% y 50% Epon 812, incubar durante la noche, en una rueda giratoria, a temperatura ambiente.
11. La mañana siguiente, retire la mezcla y añadir Epon fresca 812, al menos por 4-5 horas en el volante.
12. Utilizando moldes cónicos duplicado, llenosmedio camino con fresca 100% Epon 812, añadir especímenes seleccionados y colocarlos a los bordes.
13. Mueva los moldes a la incubadora a 60 ° C y dejarlos curar durante 48-72 horas.
14. Cuando se polimeriza, envía los bloques de estar delgado (60-70 nm de espesor) seccionado.

Resultados

Los niveles de proteína ITSN-1s y el ARNm se controlaron a varios puntos de tiempo después de siRNA entrega _ITSN por Western blot y PCR convencional y cuantitativo como en ^4. Los niveles de proteína ITSN-1s y ARNm en siRNA _ITSN pulmones tratados con ratón fueron aproximadamente 75% más baja por referencia a los controles durante la caída continua de ITSN-1s durante 21 días. Sin ITSN-1s, dynamin-2, una importante interacción socio de jugador ITSN-1s y esencial en el desprendimient...

Discusión

Con base en estudios anteriores publicados por otros ⁹ y nosotros ^{1, 18} hemos desarrollado esta metodología para el largo plazo derribar de ITSN-1 in vivo mediante la administración intravenosa repetida (cada 72 horas, durante 24 días consecutivos) de siRNA / liposoma. Este enfoque experimental es eficaz, se puede utilizar de forma segura y en repetidas ocasiones y que se puede extender fácilmente para estudiar la implicación de un gen que codifica cualquier proteína de interés en e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB)	Sigma-Aldrich	D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder)	Avestin Inc.	LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore	Avestin Inc.	LFM-50
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-8667
Chloroform	Mallinckrodt Chemicals	4432-04
Hank's balanced salts	Sigma-Aldrich	H1387
Round-bottom flask	Fisher Scientific	FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN - on target	Dharmacon/ThermoScientific	J-046912-11
Peristaltic pump	Ismatec	REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator	Hugo Sachs Electronik	NA
Barbital	Sigma-Aldrich	B-0500
Uranyl acetate	EM Sciences	22400
Epon812	EM Sciences	Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide	EM Sciences	20400
Embedding molds	EM Sciences	69923-05
Tannic acid	EM Sciences	21710
8 nm gold-albumin tracer		Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120