Долгосрочные молчание интерсектин-1 в легких мышей по повторной сдачи Конкретные миРНК через катионные липосомы. Оценка нокдаун эффекты электронной микроскопией

Резюме

Повторные ретро-орбитальной инъекции катионные комплексы liposomes/siRNA/ITSN-1s у мышей, каждые 72 часа в течение 24 дней, эффективной доставки миРНК дуплекс с микрососудов легких у мышей снижение ITSN-1 мРНК и экспрессию белка на 75%. Этот метод хорошо воспроизводимый в животной модели, не имеет побочных эффектов и позволяет избежать летальных исходов.

Аннотация

Предыдущие исследования показали, что нокдаун ITSN-1S (KD _ITSN), эндоцитотический белок, участвующий в регуляции проницаемости сосудов легких и эндотелиальные клетки (ECS) выживание, индуцированного апоптоза, основным препятствием в развитии системы клеточных культур с длительным ITSN-1S торможения ^1. Использование катионных липосом в качестве носителей, мы исследовали молчание ITSN-1 гена в легких мышей при системном введении миРНК ориентации ITSN-1 ген (миРНК _ITSN). Катионные липосомы обладают рядом преимуществ для доставки миРНК: Допускаются повторные дозировки, неиммуногенные, нетоксичны и легко производить ^2. Липосомы производительности и биологической активности зависит от их размера, заряда, липидный состав, стабильность, доза и способ введения ³ Здесь, эффективный и специфический KD _ITSN в легких мышей были получены с использованием холестерина и диметил диоктадецил сочетание бромид аммония. Внутривенного введениямиРНК _ITSN / катионной липосомы комплексы временно сбил ITSN-1 белка и мРНК в легких мышей на 3 день, который восстановился после еще ​​3 дня. Воспользовавшись тем, что катионные липосомы как безопасного перевозчика, повторяемые, исследование продлен на 24 дней. Таким образом, ретроорбитальной лечения с только что созданной комплексы вводили каждые 3 дня, вызывая устойчивый KD _ITSN на протяжении всего исследования ^4. Мышь ткани, собранные в нескольких временных точках после миРНК _ITSN подвергали электронной микроскопии (ЭМ) анализы, чтобы оценить эффекты хронического KD _ITSN, в легких эндотелия. Высокое разрешение изображения EM позволило нам оценить морфологические изменения, вызванные KDITSN в постели легких сосудистого (т.е. разрушение эндотелиального барьера, снижение количества кавеолы ​​и активацию альтернативные пути транспортировки), характеристики необнаруженными с помощью световой микроскопии. Общая этих выводов установленным важноеважную роль ITSN-1 в функции ЭКС и легких гомеостаза, а иллюстрирующие эффективность миРНК-липосомы доставки в естественных условиях.

Введение

Голые миРНК не может проникать через клеточную мембрану электрический заряд, и она легко разрушается ферментами в крови, тканей и клеток. Даже недавно структурных модификаций для улучшения стабильности, миРНК накопление в сайте-мишени после введения чрезвычайно низка и требует эффективного внутриклеточных транспортных средств ^5. Катионные липосомы стала безопасной нуклеиновых кислот носителей с потенциалом для передачи больших фрагментов ДНК / РНК в клетки путем инкапсуляции и защиты нуклеиновых кислот из ферментативного расщепления ^6. Кроме того, катионные липосомы спонтанно взаимодействуют с ДНК / РНК, тем самым способствуя переноса генов в клетки ^2. Совсем недавно липосомы были применены для доставки вакцин и низким молекулярным весом препаратов ^7. Липосомальной доставки микроРНК-7, экспрессирующих плазмид преодолевает рецептора эпидермального фактора роста ингибитор тирозинкиназы сопротивление в клетках рака легких ^8. При ориентациисосудистого эндотелия, внутривенного введения важно, потому что комплексы вряд ли пересечь барьер эндотелиальных и вытекать из сосудов в ткань и интерстиций ^9. По сравнению с другими органами, КЕ из микрососудов легких имеют наибольшее поглощение и жадно интернализации катионной липосомы и ДНК / РНК комплексов, а затем в лимфатических узлах и пейеровых бляшек ^9. Внутривенное доставки на моделях грызунов миРНК через ретро-орбитальной или хвостовой вены инъекций было доказано безвредны даже в высоких концентрациях, например, 50 мг / кг ^10. В опубликованной литературе состав катионные липосомы отличается на основе липидов разработки и их эквимол рном соотношении ^{11, 12.} Существует широкий спектр потенциальных приложений с использованием катионных липосом для доставки генов в естественных условиях, будь таргетинга down-regulation/over-expression белков, поставка вакцин или противоопухолевой терапии ^13-15. Важно помнить,является то, что эффективность ДНК / РНК-клеточное взаимодействие мембраны регулируется форма связи между генерируется комплексов и мембранных липидов. Это предполагает, что пошива липиды состав к целевой сотовой профилей мембрана может быть полезно и в результате высокий уровень трансфекции в конкретном типе клеток ^6.

протокол

1. Катионные липосомы подготовка

1. Автоклав чистую круглодонную колбу, которые будут использоваться для подготовки lipososmes.
2. Подготовка исходных растворов:
   1. - Растворить 200 мг диметил диоктадецил бромид (Doab) в 10 мл хлороформа с помощью небольшой стеклянной бутылки.
   2. - Растворить 200 мг холестерина в 10 мл хлороформа с помощью небольшой стеклянной бутылки.
   3. - Подготовка и автоклав для стерилизации 5% глюкозы в 100 мл РНК / ДНК-азы бесплатно дистиллированной воды.
3. Промойте круглодонную колбу хлороформом. Добавить 5-10 мл в колбу, вихря, и оставьте на несколько минут. Держите колбу, покрытую алюминиевой фольгой во все времена. Слейте хлороформа из колбы.
4. Получения липосом:
   1. - Добавить 315 мкл исходного раствора Doab в круглодонную колбу.
   2. - Добавить 200 мкл раствора холестерина в колбу.
   3. - Добавить 9.5 мл хлороформа в колбуй смешать вихрем.
5. Установка роторном испарителе при 37 ° С, 100 оборотов в минуту (RPM) или более (100-120 оборотов в минуту). Роторном испарителе должен быть подключен к воде вакуумный насос управления с всасывающей трубкой правильно установлены.
6. Подключите бак аргоном и роторного испарителя.
7. Прикрепить колбу роторного испарителя и корректировать оптимальные настройки перед опусканием его в водяной бане. Откройте первый клапан для аргона полностью, повернув его против часовой стрелки. Всегда открывать и закрывать этот клапан в первую очередь. Второй клапан регулирует давление аргона дует в колбу. Давление должно быть всегда нежным.
8. Опустите роторный испаритель в ванну с водой, достаточно для колбы прикоснуться к воде, не будучи полностью погружен и включите скорость.
9. Подождите, пока все испаряется хлороформ, около 10 мин. Тогда остановите машину.
10. Выключите скорость роторного испарителя и клапаны аргона бака. Теперь колбы должны быть удалены.
11. Добавить 2 мл 5%-й глюкозыэлектронной колбу, чтобы растворить липиды.
12. Царапины дне колбы тщательно с использованием 1 мл пипетки, чтобы растворить все липиды. После расчесывания, удалите оставшиеся жир с 1 мл наконечник в колбе, при необходимости, со второй чаевые.
13. Инкубируют полученного раствора в 42 ° С на водяной бане, медленно вортексе (15 оборотов в минуту) в колбе.
14. Заполните ультразвуковой ванне с холодной водой. Разрушать ультразвуком решение, по крайней мере 20-30 минут в колбе, поднял и нижний едва касаясь воды.
15. Нагревают колбу на водяной бане в роторном испарителе в течение 20 мин при 42 ° С, при нулевой скорости, с круглым дном, погруженных в воду, на этот раз.
16. Фильтр липосом через 0,47 мкм, а затем 0,22 микронные фильтры шприца.
17. С помощью небольшой экструдер, фильтр липосом через 50 нм мембраны для создания гомогенной популяции однослойных липосомных везикул.
18. Передача липосом в пробирку Эппендорф и поместить его на льду.

2. Подготовьте липосомы: миРНК ITSN-1 Комплексы

1. Ресуспендируют на цели мышь миРНК _ITSN миРНК в буфере, содержащем 20 мМ HEPES и 150 мМ хлорида натрия, рН 7,4, до конечной концентрации 2 мкг / мкл. Держите его на льду перед смешиванием.
2. Подготовьте липосомы: комплексы миРНК _ITSN в соотношении 8 нмоль липосомы: 2 мкг РНК (или 400 нмоль липосомы: 100 мкг миРНК _ITSN). В настоящем исследовании мы добавили 50 мкл миРНК _ITSN от маточного раствора (50 мкм) до 100 мкл свежеприготовленного липосомы использованием РНК / ДНК-азы бесплатно Эппендорф трубки. Следует отметить, что концентрация миРНК _ITSN очень важно, поскольку максимум 150 мкл смеси может быть двусторонней и ретро-орбитальной впрыском в мыши в одно время.
3. Смесь необходимо хранить на льду в ожидании вводят мышам.

3. Мышь ретроорбитальной вену (внутреннего угла глазницы)

jove_content "> Все мыши Эксперименты были одобрены и осуществлялась в соответствии с руководящими принципами Rush University Институциональные уходу и использованию животных комитета.

1. Обезболить мыши с помощью интраперитонеальной инъекции 50 мг / кг веса тела кетамина и 5 мг / кг массы тела ксилазина (коммерчески доступные смеси). В зависимости от веса и возраста животного, регулировать анестетики объем и концентрации. Мыши, используемые в исследовании мышей CD1 мышей-самцов, в возрасте 6-8 недель и весом около 25 граммов. Шприцы туберкулин 1 мл типа с иглой.
2. Удерживайте мышь уши одной рукой и переверните мышь вниз на сторону, чтобы выставить внутреннего угла глаза. Цель медиальнее складка semilunaris; не прикасайтесь к глазному яблоку.
3. Подход слезный гребень из глаза проведение шприц, содержащий смесь при углом 45 градусов по всем трем осям.
4. Медленно введите смеси и пусть мышь, чтобы восстановить с вводят стороной вверх. Если большое жидкостькапли форм на месте вставки иглы, втянуть иглу, всасывание обратно капли в шприц и повторите попытку. Повторные инъекции лучше всего делать путем чередования глаз, чтобы идеально восстановления. Если не уверены, эта методика может быть проверена путем инъекции синего красителя (50 мкл, 0,5% кристаллическим фиолетовым в метаноле) и подвергая легких мышей наблюдать синий сосудистой сети.
5. Мышей в этом исследовании вводили каждый ^3-й день в течение 3 недель без смертельных исходов или побочных эффектов.

4. Мышь перфузии легкого и сбора ткани для биохимических исследований

0. Установите перистальтический насос работать на 1,5 мл / мин.
1. Подготовьте установка: вентилятор, операционный стол, инструменты, стерильные ватные тампоны, ватные палочки, струны, мензурки, дистиллированная вода, сбалансированный солевой Хэнка, Tracer.
2. Обезболить мыши путем внутрибрюшинной инъекции анестезирующего смесь (100 мг / кг веса тела кетамина и 10 мг / кг массы тела ксилазин).
3. На уровне шеи, удалите слюнных желез и подвергать трахеи.
4. Начните с лапаротомии, акциз диафрагмы, и следовать с торакотомии, обнажая легких и сердца.
5. Удалить тимуса.
6. С помощью световой микроскопии для большей точности, катетеризации легочной артерии.
7. У трахеостомии и интубации мыши с помощью трахеостомы. Установить вентилятор для со скоростью 150 ударов / мин и рабочим объемом 150 мкл.
8. Как выход, откройте левое предсердие.
9. Заливать сосудистой легких у мышей свободный крови в течение 5 мин с использованием перистальтического насоса и раствор Хэнка нагревают при 37 ° С.
10. Заливать изотопу (8 нм золотых альбумин ¹⁶⁾ еще в течение 10 мин при той же скорости потока.
11. Промойте несвязанных Tracer на 5 мин перфузии легкого раствор Хэнка.
12. Последующие с на месте фиксации легких на 10 мин перфузии 4% (вес / объем) формальдегида, 2,5% глутарового альдегида и 1% дубильной кислоты в 0,1 ТРУБЫбуфером, рН 7,2.
13. Соберите легких, удалите чрезмерное ткани, нарезать небольшими блоками (3/3 мм), и поместить их в с меченым сцинтилляционный флакон с 2 мл смеси фиксатором.

Мыши истекает полностью под наркозом во время процедуры.

5. Мышь легких обработки ткани для ЭМ

1. Подготовка исходных растворов: 1% Palade OsO _4, ацетат веронала и Келленбергером буфера.
   1. - 1%-Палада OsO ₄ буфер содержит 1 мл уксусной кислоты веронала акции, 1,25 мл 4% OsO _4, 1 мл 0,1 N соляной кислотой и дистиллированной водой до 5 мл конечного объема.
   2. - Ацетат веронала маточный раствор получают растворением 1,15 г ацетата натрия andydrous и 2,94 г барбитал в 100 мл дистиллированной воды.
   3. -Келленбергер раствор содержит 2 мл ацетатного веронала акции, 2,8 мл 0,1 N соляной кислоты, 0,05 г ацетата уранила и 5,1 млдистиллированной воды, рН 6.
2. Промыть легких блоков в 0,1 М натрий-какодилатном буфере, рН 7,4, кратко 3 раза.
3. Закрепить образцов в 4% (вес / объем) формальдегида, 2,5% глутарового альдегида в 0,1 ТРУБЫ буфера, рН 7,2, в течение 1 ч при комнатной температуре.
4. Постфиксных с 1%-Palade осмия в течение 1 часа в капюшоне, на льду, в темноте.
5. Полоскание один раз буфером Келленбергер.
6. Образцы инкубируют в Келленбергер буфера в течение 2 ч в течение ночи при комнатной температуре.
7. Полоскание один раз в 50%-ном этаноле.
8. Высушить с серии градуированных этанола, 5 мин / каждая: 70%, 95%, затем 2 х 15 мин 100% этанола.
9. Переключить на 100% оксида пропилена, 2 х 15 мин.
10. Удалить пропиленоксида и добавляют смесь 50% пропиленоксида и 50% Epon 812, инкубировать в течение ночи, вращение на колесе, при комнатной температуре.
11. На следующее утро, удалить смесью и добавить свежие Epon 812, по крайней мере в течение 4-5 часов на колесе.
12. Использование удвоилось конические формы, наполненныеполовину пути со свежими 100% Epon 812, добавьте выбранные образцы и поместите их к краям.
13. Перемещение формы для инкубатор при 60 ° C, и пусть они вылечить в течение 48-72 часов.
14. После полимеризации отправить блоков быть тонким (60-70 нм) секционного.

Результаты

ITSN-1 белка и мРНК наблюдали в нескольких временных точках после доставки миРНК _ITSN методом вестерн-блоттинга и обычных и количественной ПЦР, как в ^4. ITSN-1 белка и мРНК в миРНК _ITSN обработанных легких мышей были приблизительно на 75% ниже со ссылкой на управление во время неп?...

Обсуждение

Основываясь на предыдущих исследованиях, опубликованных другими ⁹ и ^{1, нам, 18} мы разработали эту методику для долгосрочного сбить из ITSN-1S в естественных условиях повторных внутривенного введения (каждые 72 ч, в течение 24 дней подряд) специфических миРНК / липосомы комплек...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB)	Sigma-Aldrich	D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder)	Avestin Inc.	LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore	Avestin Inc.	LFM-50
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-8667
Chloroform	Mallinckrodt Chemicals	4432-04
Hank's balanced salts	Sigma-Aldrich	H1387
Round-bottom flask	Fisher Scientific	FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN - on target	Dharmacon/ThermoScientific	J-046912-11
Peristaltic pump	Ismatec	REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator	Hugo Sachs Electronik	NA
Barbital	Sigma-Aldrich	B-0500
Uranyl acetate	EM Sciences	22400
Epon812	EM Sciences	Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide	EM Sciences	20400
Embedding molds	EM Sciences	69923-05
Tannic acid	EM Sciences	21710
8 nm gold-albumin tracer		Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120