Taire à long terme de intersectine-1 dans les poumons de souris par livraison répétée d'un siRNA spécifique via des liposomes cationiques. Évaluation des effets de sacrifiés par microscopie électronique

Résumé

Des injections répétées rétro-orbitaires de complexes cationiques liposomes/siRNA/ITSN-1s chez la souris, toutes les 72 heures pendant 24 jours, fournir efficacement le duplex de siRNA à la microvascularisation pulmonaire de la souris réduire ARNm ITSN-1 et l'expression des protéines de 75%. Cette technique est hautement reproductible dans un modèle animal, n'a pas d'effets indésirables et évite les accidents mortels.

Résumé

Des études antérieures ont montré que knockdown de ITSN-1 (KD _ITSN), une protéine endocytose impliqué dans la régulation du poumon perméabilité vasculaire et les cellules endothéliales () la survie, la mort cellulaire par apoptose induite, un obstacle majeur au développement d'un système de culture cellulaire avec prolongée ITSN-1s ^une inhibition. Utilisant des liposomes cationiques comme porteurs, nous avons exploré le silence des gènes ITSN-1 dans les poumons de souris par l'administration systémique de siRNA ciblant ITSN-1 gène _(ITSN de siRNA). Les liposomes cationiques offrent plusieurs avantages pour la livraison de siRNA: coffre-fort avec des doses répétées, non immunogène, non toxique et facile à produire ^2. performance des liposomes et l'activité biologique dépend de leur taille, la charge, lipides composition, la stabilité, la dose et la voie d'administration ³ Ici, efficace et _ITSN KD spécifique dans les poumons de souris a été obtenu en utilisant une combinaison de bromure d'ammonium dioctadecyl cholestérol et de diméthyle. Administration intraveineusede _ITSN de siRNA / complexes liposome cationique transitoire renversé protéines ITSN-1 et l'ARNm dans les poumons de souris au jour 3, qui a récupéré après 3 jours supplémentaires. Profitant des liposomes cationiques comme un transporteur sûr reproductible, l'étude prolongée de 24 jours. Ainsi, le traitement rétro-orbital avec des complexes fraîchement générés a été administrée tous les 3 jours, induisant soutenue _ITSN KD tout au long de l'étude ^4. tissus de souris recueillies en plusieurs points du temps post-siRNA _ITSN ont été soumis à des analyses en microscopie électronique (EM) pour évaluer les effets de la chronique KD _ITSN, dans l'endothélium pulmonaire. Imagerie EM à haute résolution nous a permis d'évaluer les changements morphologiques causés par KDITSN dans le lit vasculaire pulmonaire (c. rupture de la barrière endothéliale, le nombre de cavéoles et la régulation positive des voies alternatives de transport a diminué), les caractéristiques non détectables par microscopie optique. Globalement, ces résultats ont établi un importantTANT rôle de ITSN-1 dans la fonction EC et l'homéostasie du poumon, tout en illustrant l'efficacité de la livraison de siRNA-liposomes in vivo.

Introduction

SiARN nu ne peut pas pénétrer la membrane cellulaire, étant chargé négativement, et il est facilement dégradés par les enzymes dans le sang, les tissus et les cellules. Même avec des modifications structurales récemment d'améliorer la stabilité, l'accumulation de siRNA au niveau du site cible après administration est extrêmement faible et nécessite un véhicule intracellulaire efficace ^5. Les liposomes cationiques sont apparus comme sûrs acides nucléiques transporteurs ayant le potentiel de transférer de gros morceaux d'ADN / ARN dans les cellules par encapsulation et la protection des acides nucléiques à partir de la dégradation enzymatique ^6. En outre, les liposomes cationiques interagissent spontanément avec l'ADN / ARN, favorisant ainsi le transfert de gènes dans les cellules ^2. Plus récemment liposomes ont été appliquées à l'administration de vaccins et de médicaments à faible poids moléculaire ^7. Livraison liposomale de microRNA-7 plasmide exprimant surmonte facteur de croissance épidermique récepteur tyrosine kinase inhibiteur de la résistance dans les cellules de cancer du poumon ^8. Lorsque vous ciblez l'endothélium vasculaire, l'administration par voie intraveineuse est essentielle parce que les complexes sont peu susceptibles de traverser la barrière endothéliale et s'extravaser dans le tissu interstitiel ^9. En comparaison à d'autres organes, ECS de la microvascularisation du poumon ont le plus l'absorption et avidement internaliser liposome cationique et complexes ADN / ARN, suivie par les ganglions lymphatiques et les plaques de Peyer ^9. Administration intraveineuse dans des modèles rongeurs de siRNA via injections veine rétro-orbitaires ou la queue a été prouvé inoffensif, même à des concentrations élevées, telles que 50 mg / kg ^10. Dans la littérature publiée de la composition de liposomes cationiques est différente, sur la base de la formulation de lipides et de leur rapport équimolaire ^{11, 12.} Il existe un large éventail d'applications potentielles en utilisant des liposomes cationiques pour la livraison de gènes in vivo, si le ciblage down-regulation/over-expression des protéines, la livraison des vaccins ou des thérapies anti-tumorales ^13-15. Important de se rappelerest que l'efficacité de l'interaction de la membrane l'ADN / ARN cellulaire est régulée par la forme de couplage entre les complexes générés et les lipides membranaires. Ceci suggère que l'adaptation de la composition des lipides aux profils ciblés de la membrane cellulaire peut être bénéfique et entraîner des taux élevés de transfection dans un type cellulaire particulier ^6.

Protocole

1. Préparation des liposomes cationiques

1. Autoclave un ballon propre à être utilisé pour la préparation lipososmes.
2. Préparer des solutions de:
   1. - Dissoudre 200 mg de bromure de diméthyl ammonium dioctadecyl (Doab) dans 10 ml de chloroforme en utilisant une petite bouteille en verre.
   2. - Dissoudre 200 mg de cholestérol dans 10 ml de chloroforme en utilisant une petite bouteille en verre.
   3. - Préparer et passer à l'autoclave pour stériliser les 5% de glucose dans 100 ml d'ARN / ADN-ase eau distillée libre.
3. Rincer le ballon avec du chloroforme. Ajouter 5-10 ml dans le flacon, tourbillon, et laisser reposer pendant quelques minutes. Gardez le flacon recouvert d'une feuille d'aluminium à tout moment. Vider le chloroforme du ballon.
4. Préparation de liposomes:
   1. - Ajouter 315 ul de la solution mère Doab au ballon rond.
   2. - Ajouter 200 pi de solution de cholestérol dans le ballon.
   3. - Ajouter 9,5 ml de chloroforme à la fiolend mélanger par tourbillonnement.
5. Réglez le rotovapeur à 37 ° C, 100 rotations par minute (rpm) ou plus (100-120 rpm). L'évaporateur rotatif doit être connectée à une commande de vide de pompe à eau avec un tube d'aspiration fixé correctement.
6. Connectez le réservoir de gaz argon et l'évaporateur rotatif.
7. Fixer le ballon à l'évaporateur rotatif et ajuster les réglages optimaux avant de descendre dans le bain d'eau. Ouvrez la première vanne pour l'argon complètement en tournant dans le sens antihoraire. Toujours ouvrir et fermer cette vanne premier. La seconde soupape commande la pression d'argon de soufflage dans le ballon. La pression doit être toujours douce.
8. Abaisser le rotovapeur dans le bain d'eau, assez pour le flacon toucher l'eau sans être complètement submergé et allumez la vitesse.
9. Attendez jusqu'à ce que tous les chloroforme s'évapore, environ 10 min. Ensuite arrêter la machine.
10. Éteignez la vitesse de rotovapeur et les robinets du réservoir d'argon. Maintenant, le flacon doit être supprimée.
11. Ajouter 2 ml de glucose à 5% pour ee ballon pour dissoudre les lipides.
12. Rayer le fond du flacon à fond en utilisant une pointe de pipette ml pour dissoudre tous les lipides. Après grattage, enlever tout reste de lipides à partir de la pointe de 1 ml dans le flacon, le cas échéant, avec une deuxième extrémité.
13. Incuber la solution obtenue à 42 ° C au bain d'eau tout en tourbillonnant lentement (15 min) dans le ballon.
14. Remplir la cuve d'ultrasons avec de l'eau froide. Soniquer la solution pendant au moins 20-30 minutes avec le ballon tenu et le bas juste à peine toucher l'eau.
15. Chauffer le ballon dans un bain d'eau de l'évaporateur rotatif pendant 20 min à 42 ° C, à la vitesse zéro, avec le fond rond immergé dans l'eau, cette fois.
16. Filtrer les liposomes à travers un 0,47 micron et par la suite, 0,22 micron filtres seringue.
17. Utilisation d'une petite extrudeuse, filtrer les liposomes à travers une membrane de 50 nm pour générer une population homogène de vésicules de liposomes unilamellaires.
18. Transférer les liposomes dans un tube Eppendorf et le placer sur la glace.

2. Préparer les liposomes: siRNA-ITSN-1 Complexes

1. Reprendre le sur-cible souris siRNA _ITSN dans un tampon de siRNA contenant HEPES 20 mM et du chlorure de sodium 150 mM, pH 7,4, à une concentration finale de 2 pg / pl. Gardez-le sur la glace avant de les mélanger.
2. Préparer les liposomes: _{complexes ITSN} de siRNA à un ratio de 8 liposomes nmol: 2 ug d'ARN (ou 400 nmol liposomes: 100 ug siRNA _ITSN). Dans la présente étude, nous avons ajouté 50 pi de _ITSN de siRNA à partir de la solution mère (50 M) à 100 pi de liposomes fraîchement préparés en utilisant un ARN / ADN-ase tube Eppendorf libre. Notez que la concentration de _ITSN de siRNA est très important car un maximum de 150 pi de mélange peut être injecté bilatéralement et rétro-orbitaires chez la souris en même temps.
3. Gardez le mélange sur la glace en attendant d'injecter des souris.

3. Souris rétro-orbitaire injection dans la veine (angle interne de l'orbite)

jove_content "> Toutes les expériences de souris ont été arrêtés et exécutés en conformité avec les directives du Rush University Institutional Animal Care et Use Committee.

1. Anesthésier la souris par injection intra-péritonéale d'un mg / kg de kétamine 50 corps de poids et de 5 mg / kg de poids corporel xylazine (mélange disponible dans le commerce). Selon le poids de l'animal et de l'âge, de régler le volume des anesthésiques et de concentration. Les souris utilisées dans les souris de l'étude sont des souris CD1 mâles, âgées de 6-8 semaines et pèse environ 25 grammes. Les seringues sont tuberculine 1 ml Type avec l'aiguille fixée.
2. Tenir des oreilles de souris avec une main et tourner la souris enfoncé sur un côté pour exposer l'angle interne de l'œil. But médiale à la plica semilunaris; éviter de toucher le globe oculaire.
3. Approchez-vous des caruncle lacrymales de l'oeil tenant la seringue contenant le mélange à un angle de 45 degrés dans les trois axes.
4. Injecter lentement le mélange et laissez la souris pour récupérer le côté injecté vers le haut. Si une grande liquideformes de gouttelettes sur le lieu d'insertion de l'aiguille, l'aiguille se rétractent, aspiration arrière de la goutte dans la seringue et essayez à nouveau. Des injections répétées sont mieux fait en alternant les yeux, pour permettre la récupération parfaite. En cas de doute, cette technique peut être vérifiée en injectant un colorant bleu (50 pi, 0,5% de cristal violet dans le méthanol) et en exposant les poumons de souris pour observer la vascularisation bleu.
5. Les souris dans cette étude ont été injectés chaque 3 ^ème jour pendant 3 semaines sans décès ou les effets indésirables.

4. Souris perfusion du poumon et collection de tissus pour les études biochimiques

0. Régler la pompe péristaltique pour fonctionner à 1,5 ml / min.
1. Préparer le réglage: ventilateur, table d'opération, les instruments, des cotons-tiges stériles, des cotons tiges, cordes, gobelets, eau distillée, sel équilibrée de Hank, traceur.
2. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale du mélange anesthésique (100 mg / kg de kétamine corps de poids et de 10 mg / kg de poids corporel xylazine de poids).
3. Au niveau de la nuque, enlever les glandes salivaires et d'exposer la trachée.
4. Commencez par laparotomie, l'excision de la membrane, et suivre avec thoracotomie, exposant les poumons et le coeur.
5. Retirez le thymus.
6. Utilisation de la microscopie optique pour une meilleure précision, cathétérisme de l'artère pulmonaire.
7. Avez-trachéotomie et intuber la souris en utilisant la trachéotomie. Réglez le ventilateur à une vitesse de 150 coups / min et le volume systolique de 150 pi.
8. En sortie, ouvrez l'oreillette gauche.
9. Perfuser le système vasculaire pulmonaire de souris sans sang pendant 5 min, à l'aide de la pompe péristaltique et la solution de Hank réchauffé à 37 ° C.
10. Perfuser le traceur (8 nm d'or-albumine ¹⁶⁾ pour supplémentaire de 10 min à la même vitesse d'écoulement.
11. Rincer le traceur non lié par 5 perfusion du poumon min avec une solution de Hank.
12. Suivre avec la fixation in situ dans les poumons de 10 min perfusion de 4% (poids / volume) de formaldéhyde, 2,5% de glutaraldéhyde, l'acide tannique et de 1% à 0,1 PIPEStampon, pH 7,2.
13. Recueillir les poumons, enlever le tissu excessive, couper des petits blocs (3/3 mm), et les placer dans une fiole à scintillation marqué contenant 2 ml de mélange fixateur.

Les souris vont expirer complètement anesthésié pendant la procédure.

5. Souris traitement du tissu pulmonaire pour EM

1. Préparer des solutions de 1% Palade _OSO4, acétate veronal, et le tampon Kellenberger.
   1. - Mémoire tampon _Palade-OSO4 ​​1% contient: 1 ml d'acétate d'actions veronal, 1,25 ml 4% _OSO4, 1 ml d'acide chlorhydrique 0,1 N et de l'eau distillée jusqu'à 5 ml de volume final.
   2. - Solution stock veronal d'acétate est obtenue par dissolution de 1,15 g de sodium andydrous d'acétate et 2,94 g barbiturique dans 100 ml d'eau distillée.
   3. Solution Kellenberger contient 2 ml d'acétate d'actions veronal, 2,8 ml d'acide chlorhydrique 0,1 N, 0,05 g d'acétate d'uranyle et de 5,1 mlde l'eau distillée, à pH = 6.
2. Laver les blocs du poumon chez 0,1 M cacodylate de sodium, pH = 7,4, brièvement 3 fois.
3. Fixer les échantillons dans les 4% (poids / volume) de formaldéhyde, 2,5% de glutaraldéhyde dans un tampon 0,1 PIPES, pH 7,2, pendant 1 heure, à température ambiante.
4. Post-fixer avec 1% Palade-Osmium pendant 1 h dans la hotte, sur la glace, dans l'obscurité.
5. Rincer une fois avec un tampon Kellenberger.
6. Incuber les échantillons dans un tampon Kellenberger pendant 2 heures ou toute la nuit, à la température ambiante.
7. Rincer une fois dans l'éthanol à 50%.
8. Déshydrater avec la série graduée de l'éthanol, 5 min / chacun: 70%, 95%, puis 2 x 15 min de l'éthanol à 100%.
9. Mettez à 100% d'oxyde de propylène, 2 x 15 min.
10. Éliminer l'oxyde de propylène et d'ajouter un mélange de 50% d'oxyde de propylène et 50% Epon 812, incuber pendant la nuit, tournant sur une roue, à la température ambiante.
11. Le lendemain matin, retirez le mélange et ajouter frais Epon 812, au moins pour 4-5 heures sur le volant.
12. En utilisant des moules coniques doublé, remplisà mi-chemin avec des produits frais 100% Epon 812, ajouter les échantillons sélectionnés et les placer sur les bords.
13. Déplacez les moules à l'ensemble incubateur à 60 ° C et laissez-les durcir pendant 48-72 h.
14. Lorsque polymérisé, envoyer les blocs d'être mince (60-70 nm d'épaisseur) sectionnés.

Résultats

Taux de protéines ITSN-1 et l'ARNm ont été contrôlés à plusieurs points de temps après la livraison _de siRNA _ITSN par Western blot et PCR classique et quantitative en ^4. Taux de protéines ITSN-1 et l'ARNm dans les poumons siRNA _ITSN traités souris étaient environ 75% plus faible par rapport aux contrôles pendant knockdown continue de ITSN-1 pendant 21 jours. Sans ITSN-1s, dynamin-2, un premier partenaire d'interaction du lecteur ITSN-1 et essentiel dans ...

Discussion

Basé sur des études précédentes publiées par d'autres ⁹ et nous ^{1, 18} nous avons développé cette méthodologie pour le long terme abattre des ITSN-1 in vivo par administration intraveineuse répétée (toutes les 72 h, pendant 24 jours consécutifs) de siRNA spécifique / complexes de liposomes. Cette approche expérimentale est efficace, peut être utilisé en toute sécurité et de façon répétée et il peut être facilement étendu pour étudier l'implication d'un g...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB)	Sigma-Aldrich	D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder)	Avestin Inc.	LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore	Avestin Inc.	LFM-50
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-8667
Chloroform	Mallinckrodt Chemicals	4432-04
Hank's balanced salts	Sigma-Aldrich	H1387
Round-bottom flask	Fisher Scientific	FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN - on target	Dharmacon/ThermoScientific	J-046912-11
Peristaltic pump	Ismatec	REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator	Hugo Sachs Electronik	NA
Barbital	Sigma-Aldrich	B-0500
Uranyl acetate	EM Sciences	22400
Epon812	EM Sciences	Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide	EM Sciences	20400
Embedding molds	EM Sciences	69923-05
Tannic acid	EM Sciences	21710
8 nm gold-albumin tracer		Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120