Silencing a lungo termine di Intersectin-1s in Polmoni mouse consegna ripetuta di un siRNA specifico tramite liposomi cationici. Valutazione degli effetti Knockdown al microscopio elettronico

Riepilogo

Ripetute iniezioni retro-orbitali di liposomes/siRNA/ITSN-1s cationici complessi nei topi, ogni 72 ore per 24 giorni, fornire in modo efficiente il duplex siRNA per il mouse microcircolo polmonare riducendo mRNA ITSN-1s e di espressione proteica del 75%. Questa tecnica è altamente riproducibile in un modello animale, non ha effetti collaterali ed evita infortuni mortali.

Abstract

Studi precedenti hanno mostrato che knockdown di ITSN-1s (KD _ITSN), una proteina coinvolta nella regolazione endocitico polmone permeabilità vascolare e delle cellule endoteliali (EC) di sopravvivenza, la morte cellulare per apoptosi indotta, un ostacolo importante nello sviluppo di un sistema di coltura cellulare con prolungata ITSN-1s inibizione ^1. Usando liposomi cationici come vettori, abbiamo esplorato il silenziamento del gene ITSN-1s nei polmoni del mouse con la somministrazione sistemica di siRNA mira ITSN-1 gene (siRNA _ITSN). Liposomi cationici offrono diversi vantaggi per la consegna di siRNA: cassaforte con somministrazioni ripetute, nonimmunogenic, non tossico e facile da produrre ^2. Prestazioni liposomi e attività biologica dipendono dalla loro dimensione, carica, lipidi composizione, la stabilità, la dose e la via di somministrazione ³ Qui, efficiente e specifici _ITSN KD in polmoni topo è stata ottenuta utilizzando una combinazione ammonio bromuro dioctadecil colesterolo e dimetil. La consegna per via endovenosadi siRNA _ITSN / cationico complessi liposomi transitoriamente abbattute proteina ITSN-1s e mRNA nei polmoni del mouse al giorno 3, che ha recuperato dopo ulteriori 3 giorni. Sfruttando i liposomi cationici come un vettore sicuro ripetibile, lo studio esteso per 24 giorni. Quindi, il trattamento retro-orbitale con complessi di fresco generato è stato somministrato ogni 3 giorni, inducendo sostenuta _ITSN KD tutto lo studio ^4. Topo tessuti raccolti in diversi momenti post-siRNA _ITSN sono stati sottoposti ad analisi di microscopia elettronica (EM) per valutare gli effetti di KD cronica _ITSN, in endotelio polmonare. Imaging ad alta risoluzione EM ci ha permesso di valutare le variazioni morfologiche causate da KDITSN nel letto vascolare polmonare (cioè rottura della barriera endoteliale, numero di caveolae e sovra-regolazione di vie di trasporto alternative diminuito), caratteristiche non rilevabili al microscopio ottico. Nel complesso questi risultati stabilito un importanteruolo portante di ITSN-1 nella funzione EC e l'omeostasi del polmone, mentre illustra l'efficacia della consegna del siRNA-liposomi in vivo.

Introduzione

Nudo siRNA non può penetrare la membrana cellulare, essendo di carica negativa, ed è facilmente degradata da enzimi nel sangue, tessuti e cellule. Recentemente anche con modifiche strutturali per migliorare la stabilità, l'accumulo siRNA presso il sito bersaglio dopo somministrazione è estremamente basso e richiede un veicolo intracellulare efficiente ^5. Liposomi cationici emersi come sicure acidi nucleici vettori con il potenziale per trasferire grandi pezzi di DNA / RNA in cellule incapsulando e proteggendo gli acidi nucleici da degradazione enzimatica ^6. Inoltre, liposomi cationici interagiscono spontaneamente con il DNA / RNA, agevolando così il trasferimento genico nelle cellule ^2. Più recentemente liposomi sono stati applicati per fornire vaccini e farmaci a basso peso molecolare ^7. Consegna liposomiale di microRNA-7-esprimendo plasmide supera fattore di crescita epidermico recettore tirosina chinasi inibitore-resistenza in cellule tumorali del polmone ^8. Quando ci si rivolge alendotelio vascolare, la consegna endovenosa è essenziale perché i complessi difficilmente attraversare la barriera endoteliale e stravaso in per nell'interstizio ^9. In confronto ad altri organi, ECS dal microcircolo del polmone hanno il maggior assorbimento e avidamente internalizzare liposoma cationico e DNA / RNA complessi, seguito dai linfonodi e placche di Peyer ^9. La consegna per via endovenosa in modelli di roditori di siRNA tramite iniezioni vena retro-orbitale o la coda è stato dimostrato innocuo anche in alte concentrazioni, come ad esempio 50 mg / kg ^10. Nella letteratura pubblicata la composizione di liposomi cationici differisce, in base alla formulazione lipidi ed il loro rapporto equimolare ^{11, 12.} Vi è una vasta gamma di potenziali applicazioni utilizzando liposomi cationici per la consegna del gene in vivo, sia il targeting down-regulation/over-expression delle proteine, la consegna di vaccini o terapie anti-tumorali ^13-15. Importante da ricordareè che l'efficienza della membrana interazione DNA / RNA cellulare è regolata dal accoppiamento di forma fra i complessi generati e lipidi di membrana. Questo suggerisce che la composizione sartoria lipidi ai profili mirati membrana cellulare può essere utile e causare alti tassi di trasfezione in un particolare tipo di cellula ^6.

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Protocollo

1. Liposomi cationici Preparazione

1. Autoclavare un matraccio pulito a fondo rotondo da utilizzare per la preparazione lipososmes.
2. Preparare soluzioni:
   1. - Sciogliere 200 mg di dimetil ammonio bromuro dioctadecil (Doab) in 10 ml di cloroformio con una piccola bottiglia di vetro.
   2. - Sciogliere 200 mg di colesterolo in 10 ml di cloroformio con una piccola bottiglia di vetro.
   3. - Preparare e sterilizzare in autoclave a 5% di glucosio in 100 ml di RNA / DNA-asi acqua distillata gratuito.
3. Risciacquare il pallone con il cloroformio. Aggiungere 5-10 ml al pallone, agitare e lasciare riposare per qualche minuto. Mantenere il matraccio coperto con un foglio di alluminio in ogni momento. Svuotare il cloroformio dal pallone.
4. Preparazione di liposomi:
   1. - Aggiungere 315 ml di Doab magazzino soluzione al pallone.
   2. - Aggiungere 200 ml di colesterolo soluzione madre al pallone.
   3. - Aggiungere 9,5 ml di cloroformio nel matraccio unand mescolare con turbolenza.
5. Impostare il rotavapor a 37 ° C, 100 rotazioni al minuto (rpm) o più (100-120 rpm). Il rotavapor deve essere collegato ad un controllo del vuoto acqua-pompa con un tubo di aspirazione collegato correttamente.
6. Collegare il serbatoio del gas argon e il rotavapor.
7. Collegare il pallone al rotavapor e regolare le impostazioni ottimali prima di abbassare nel bagnomaria. Aprire la prima valvola per l'argon completamente in senso antiorario. Sempre aperto e chiudere la valvola prima. La seconda valvola controlla la pressione argon soffia al pallone. La pressione deve essere sempre gentile.
8. Abbassare la rotavapor nel bagnomaria, sufficiente per il pallone toccare l'acqua senza essere completamente sommerso e accendere la velocità.
9. Attendere fino a quando tutti gli evapora il cloroformio, circa 10 min. Quindi arrestare la macchina.
10. Spegnere la velocità rotavapor e le valvole del serbatoio di argon. Ora il matraccio deve essere rimosso.
11. Aggiungere 2 ml di glucosio al 5% al ​​secolobeuta e per sciogliere i lipidi.
12. Gratta il fondo del pallone a fondo usando 1 ml di punta della pipetta per sciogliere tutti i lipidi. Dopo graffi, rimuovere ogni residuo lipidico dalla punta 1 ml nel pallone, se necessario, con una seconda punta.
13. Incubare la soluzione ottenuta in 42 ° C in bagno d'acqua mentre lentamente vortex (15 rpm) la beuta.
14. Riempite la vasca sonicatore con acqua fredda. Sonicare la soluzione per almeno 20-30 min con la beuta retto e il fondo appena tocca l'acqua.
15. Riscaldare il pallone in bagnomaria del rotavapor per 20 min a 42 ° C, a velocità zero, con il fondo rotondo immerso in acqua, questa volta.
16. Filtrare i liposomi attraverso un 0,47 micron e successivamente, 0,22 micron filtri per siringa.
17. Usando un piccolo estrusore, filtrare i liposomi attraverso una membrana 50 nm per generare una popolazione omogenea di unilamellari vescicole liposomiali.
18. Trasferire i liposomi di una provetta Eppendorf e posizionarlo sul ghiaccio.

2. Preparare i liposomi: siRNA-ITSN-1 Complessi

1. Risospendere il on-target topo siRNA _ITSN in tampone siRNA contenente HEPES 20 mM e cloruro di sodio 150 mM, pH 7,4, ad una concentrazione finale di 2 mg / mL. Tenerlo in ghiaccio prima della miscelazione.
2. Preparare i liposomi: siRNA complessi _ITSN con un rapporto di 8 liposomi nmol RNA: 2 mg (o 400 liposomi nmol: 100 mcg siRNA _ITSN). Nel presente studio, abbiamo aggiunto 50 ml di siRNA _ITSN dalla soluzione madre (50 micron) per 100 ml di liposomi preparati al momento utilizzando un RNA / DNA-asi libera provetta Eppendorf. Si noti che la concentrazione di siRNA _ITSN è molto importante perché un massimo di 150 pl di miscela può essere iniettato bilateralmente e retro-orbitale nel topo in una sola volta.
3. Conservare la miscela in ghiaccio in attesa di iniettare i topi.

3. Topo iniezione nella vena retro-orbitale (angolo interno della cavità oculare)

jove_content "> Tutti gli esperimenti del mouse sono stati approvati ed eseguiti in conformità con le linee guida del Rush University Institutional Animal Care e del Comitato Usa.

1. Anestetizzare il mouse per iniezione intraperitoneale di un mg / kg di peso corporeo ketamina 50 e 5 mg / kg di peso corporeo xilazina (miscela disponibile in commercio). A seconda del peso e l'età degli animali, regolare il volume e la concentrazione di anestetici. I topi utilizzati nei topi di studio sono CD1 topi maschi, 6-8 settimane e pesano circa 25 grammi. Le siringhe sono tubercolina tipo 1 ml con l'ago inserito.
2. Tenere le orecchie del mouse con una mano e ruotare il mouse su un lato per esporre l'angolo interno dell'occhio. Puntare mediale della plica semilunaris, evitare di toccare il bulbo oculare.
3. Avvicinare le caruncle lacrimali dell'occhio tenendo la siringa contenente la miscela con un angolo di 45 gradi in tutti i tre assi.
4. Iniettare lentamente il composto e lasciare il mouse per recuperare con la parte iniettata in su. Se una grande liquidoforme di gocce nel luogo di inserimento dell'ago, ritirare l'ago, aspirazione indietro la goccia nella siringa e riprovare. Iniezioni ripetute sono fatto meglio alternando gli occhi, per consentire il recupero perfetto. Se non sei sicuro, questa tecnica può essere verificato iniettando colorante blu (50 pl, 0,5% di cristallo viola in metanolo) ed esponendo i polmoni del mouse per osservare la vascolarizzazione blu.
5. I topi in questo studio sono state iniettate ogni giorno 3 ^° per 3 settimane senza incidenti mortali o effetti avversi.

4. Topo perfusione polmonare e Collezione tessuto per studi biochimici

0. Impostare la pompa peristaltica di funzionare a 1,5 ml / min.
1. Preparare l'ambiente: ventilatore, tavolo operatorio, strumenti, tamponi di cotone sterile, q-tips, stringhe, bicchieri, acqua distillata, equilibrato sale di Hank, tracciante.
2. Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di miscela anestetica (100 mg / kg di peso corporeo ketamina e 10 mg / kg di peso corporeo xilazina).
3. A livello del collo, rimuovere le ghiandole salivari ed esporre la trachea.
4. Inizia con laparotomia, accisa il diaframma, e seguire con toracotomia, esponendo i polmoni e il cuore.
5. Togliere il timo.
6. Utilizzando il microscopio ottico per una migliore precisione, cateterizzarla l'arteria polmonare.
7. Fate tracheostomia e intubare il mouse usando la tracheostomia. Impostare il ventilatore ad una velocità di 150 colpi / min e volume tratto di 150 ml.
8. Come uscita, aprire l'atrio sinistro.
9. Perfondere il mouse vascolare di polmone libera di sangue per 5 minuti, utilizzando la pompa peristaltica e la soluzione di Hank riscaldato a 37 ° C.
10. Perfondere il tracciante (8 nm oro-albumina ¹⁶⁾ per ulteriori 10 min a parità di portata.
11. Lavare il tracciante non legato da 5 min perfusione polmonare con soluzione di Hank.
12. Seguite con fissazione in situ dei polmoni da 10 min perfusione del 4% (peso / volume), formaldeide, glutaraldeide al 2,5%, e l'1% di acido tannico in 0,1 TUBItampone, pH 7,2.
13. Raccogliere i polmoni, rimuovere il tessuto eccessivo, tagliare piccoli blocchi (3/3 mm), e metterli in una fiala di scintillazione etichettato contenente 2 ml di miscela di fissativo.

I topi scadranno completamente anestetizzato durante la procedura.

5. Polmone mouse Lavorazione tessuti per EM

1. Preparare soluzioni: 1% Palade OsO _4, acetato veronal, e tampone Kellenberger.
   1. - 1% Palade-oso ₄ buffer contiene: 1 ml di acetato di magazzino veronal, 1,25 ml 4% OsO _4, 1 ml di acido cloridrico 0,1 N, e acqua distillata fino a 5 ml di volume finale.
   2. - Acetato soluzione di riserva veronal è ottenuta sciogliendo 1,15 g di sodio andydrous acetato e 2,94 g barbital in 100 ml di acqua distillata.
   3. Soluzione-Kellenberger contiene 2 ml di acetato di magazzino veronal, 2,8 ml di acido cloridrico 0,1 N, 0,05 g di acetato di uranile, e 5.1 mldi acqua distillata, pH = 6.
2. Lavare i blocchi polmonari in 0,1 M di sodio cacodilato tampone, pH = 7,4, brevemente 3 volte.
3. Fissare i campioni nel 4% (peso / vol) di formaldeide, glutaraldeide 2,5% in tampone PIPES 0,1, pH 7,2, per 1 ora, a temperatura ambiente.
4. Post-fissare con 1% Palade-osmio per 1 ora nel cofano, sul ghiaccio, al buio.
5. Risciacquare una volta con tampone Kellenberger.
6. Incubare i campioni in Kellenberger tampone per 2 ore a tutta la notte, a temperatura ambiente.
7. Risciacquare una volta in 50% di etanolo.
8. Disidratare con serie graduata di etanolo, 5 min / ciascuno: 70%, 95%, quindi 2 x 15 min al 100% di etanolo.
9. Passare a ossido di propilene al 100%, 2 x 15 min.
10. Rimuovere l'ossido di propilene e aggiungere una miscela di ossido di propilene 50% e 50% Epon 812, incubare una notte, rotante su una ruota, a temperatura ambiente.
11. La mattina dopo, togliere il composto e aggiungere fresco Epon 812, almeno per 4-5 ore sulla ruota.
12. Utilizzando stampi conici raddoppiato, pienia metà strada con il fresco 100% Epon 812, aggiungere i campioni selezionati e metterli ai bordi.
13. Spostare gli stampi per l'incubatore a 60 ° C e far loro cura per 48-72 ore.
14. Quando polimerizzato, inviare i blocchi per essere sottili (60-70 nm di spessore) sezionato.

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Risultati

Livelli di proteina ITSN-1s e mRNA sono stati monitorati a diversi intervalli di tempo dopo la consegna di siRNA _ITSN mediante Western blot e PCR convenzionale e quantitativa come in ^4. Livelli di proteina ITSN-1s e mRNA in siRNA polmoni del mouse _ITSN trattati erano inferiori di circa il 75% con riferimento ai controlli durante atterramento continuo di ITSN-1s per 21 giorni. Senza ITSN-1s, dynamin-2, un importante partner interagenti del giocatore ITSN-1s ed essenziale in distacco caveo...

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Discussione

Sulla base di studi precedenti pubblicati da altri ⁹ e noi ^{1, 18} abbiamo sviluppato questa metodologia per il lungo termine abbattere di ITSN-1 in vivo per via endovenosa ripetuta (ogni 72 ore, per 24 giorni consecutivi) di specifici siRNA / complessi liposomi. Questo approccio sperimentale è efficiente, può essere utilizzato in modo sicuro e ripetutamente e può essere facilmente esteso per studiare il coinvolgimento di un gene che codifica una qualsiasi proteina di interesse in endotel...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB)	Sigma-Aldrich	D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder)	Avestin Inc.	LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore	Avestin Inc.	LFM-50
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-8667
Chloroform	Mallinckrodt Chemicals	4432-04
Hank's balanced salts	Sigma-Aldrich	H1387
Round-bottom flask	Fisher Scientific	FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN - on target	Dharmacon/ThermoScientific	J-046912-11
Peristaltic pump	Ismatec	REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator	Hugo Sachs Electronik	NA
Barbital	Sigma-Aldrich	B-0500
Uranyl acetate	EM Sciences	22400
Epon812	EM Sciences	Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide	EM Sciences	20400
Embedding molds	EM Sciences	69923-05
Tannic acid	EM Sciences	21710
8 nm gold-albumin tracer		Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120