השתקה ארוכת טווח של Intersectin-1S בעכבר על ידי משלוח ריאות חוזר ונשנה של siRNA ספציפי באמצעות ליפוזומים קטיוני. הערכה של השפעות מציאה על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים

Summary

זריקות רטרו מסלולית חוזרות ונשנות של מתחמי קטיוני liposomes/siRNA/ITSN-1s בעכברים, בכל 72 שעות למשך 24 ימים, ביעילות לספק דופלקס siRNA לmicrovasculature ריאות עכבר הפחתת mRNA ITSN-1S וביטוי חלבון על ידי 75%. טכניקה זו היא שחזור מאוד במודל של בעלי חיים, אין לו תופעות לוואי ונמנע הרוגים.

Abstract

מחקרים קודמים הראו כי מציאה של ITSN-1S (KD _ITSN), חלבון endocytic המעורב בויסות חדירות כלי דם וריאות תאי האנדותל (ECS) הישרדות, מוות של תאי אפופטוטיים מושרה, מכשול עיקרי בפיתוח מערכת תרבית תאים עם ITSN-1S ממושך עיכוב ^1. באמצעות ליפוזומים קטיוני כנשאים, בחן את ההשתקה של גן ITSN-1S בעכבר ריאות על ידי ממשל מערכתי של siRNA גן מיקוד ITSN-1 _(ITSN siRNA). ליפוזומים קטיוני מציעים מספר יתרונות למסירת siRNA: בטוח במינון חוזר ונשנה, nonimmunogenic, רעילים, וקלים לייצור ^2. ביצועים ליפוזומים ופעילות ביולוגית שלהם תלויות בגודל, תשלום, שומנים הרכב, יציבות, מינון ודרך מתן ³ הנה, יעיל והספציפי _בITSN KD ריאות עכבר הושג באמצעות שילוב רומיד אמוניום dioctadecyl כולסטרול ודימתיל. משלוח תוך ורידישל _ITSN siRNA / מתחמי liposome קטיוני דפקו transiently למטה חלבון ITSN-1S וmRNA בעכבר ריאות ביום 3, שהתאושש לאחר 3 ימים נוספים. מנצלים את יפוזומים קטיוני כמוביל בטוח הדיר, המחקר הוארך למשך 24 ימים. לפיכך, טיפול רטרו מסלולית עם מתחמים טריים שנוצרו היה מנוהל בכל יום 3, גרימת _ITSN KD המתמשך לאורך כל תקופת המחקר ^4. רקמות עכבר שנאספו במספר הנקודות _ITSN לאחר זמן siRNA היו נתונים למיקרוסקופים אלקטרונים (EM) ניתוחים כדי להעריך את ההשפעות של KD _ITSN הכרוני, בהאנדותל ריאות. רזולוציה גבוהה EM הדמיה אפשרה לנו להעריך את השינויים מורפולוגיים שנגרמו על ידי KDITSN במיטת כלי דם הריאה (כלומר שיבוש של מכשול אנדותל, מספר caveolae וupregulation של מסלולי תחבורה חלופיים ירד), מאפיינים שאינם לזיהוי על ידי מיקרוסקופ אור. בסך הכל ממצאים אלו הוקמו imporהתפקיד של TANT ITSN-1S בתפקוד ECs והומאוסטזיס ריאות, ואילו הממחיש את היעילות של ליפוזומים משלוח siRNA בin vivo.

Introduction

siRNA בלתי מזוינת לא יכול לחדור את קרום התא, שטעון שלילי, וזה בקלות מושפל על ידי אנזימים בדם, רקמות ותאים. אפילו עם לאחרונה שינויים מבניים לשיפור יציבות, הצטברות siRNA באתר היעד לאחר מתן היא נמוכה ביותר ודורשת רכב תאי יעיל ^5. ליפוזומים קטיוני התפתחו כנשאים חומצות גרעין בטוחים עם הפוטנציאל להעברת חלקים גדולים של ה-DNA / RNA לתאים על ידי encapsulating והגנה על חומצות גרעין משפלה האנזימטית ^6. כמו כן, ליפוזומים קטיוני אינטראקציה באופן ספונטני עם DNA / RNA, ובכך לקדם העברת גנים לתאים ^2. לאחרונה יפוזומים יושמו כדי לספק חיסונים ותרופות מולקולריים נמוכה במשקל ^7. משלוח liposomal של microRNA-7-להביע פלסמיד מתגבר על גורם הקולטן טירוזין קינאז מעכב גדילה באפידרמיס-התנגדות בתאי סרטן ריאות ^8. כאשר מיקודהאנדותל של כלי דם, האספקה ​​תוך ורידי הוא חיוני משום המתחמים צפויים לחצות את מחסום האנדותל וextravasate לinterstitium ^9. על ידי השוואה לאיברים אחרים, ECS מmicrovasculature של הריאה יש הספיגה הגדולה ביותר בשקיקה ולהפנים יפוזום קטיוני ומתחמי DNA / RNA, ואחריו את בלוטות הלימפה והטלאים של Peyer ^9. משלוח תוך ורידי במודלים של מכרסמים של siRNA באמצעות זריקות וריד רטרו מסלולית או זנב הוכח בלתי מזיק גם בריכוזים גבוהים, כגון 50 מ"ג / ק"ג ^10. בספרות שפורסמה בהרכב ליפוזומים קטיוני שונה, המבוסס על ניסוח שומנים והיחס שלהם equimolar ^{11, 12.} יש מגוון רחב של יישומים אפשריים באמצעות ליפוזומים קטיוני למסירת גן in vivo, בין אם מיקוד down-regulation/over-expression של החלבונים, משלוח של חיסונים או טיפולים אנטי סרטניים ^13-15. חשוב לזכורהוא שהיעילות של אינטראקציה קרום DNA / RNA-הסלולר מוסדרת על ידי צורת צימוד בין מתחמים שנוצרו ושומנים בממברנה. הדבר מצביע על כך חייטות הרכב שומנים לפרופילי הממברנה התאיים הממוקדים עשויה להיות מועילה ותוצאה בשיעור גבוה של transfection בסוג תא מסוים ^6.

Protocol

1. הכנה ליפוזומים cationic

1. חיטוי בקבוק מסביב לתחתית נקי כדי לשמש להכנת lipososmes.
2. הכן פתרונות מניות:
   1. - ממיסים 200 מ"ג של אמוניום ברומיד dioctadecyl דימתיל (DOAB) בכלורופורם 10 מ"ל באמצעות בקבוק זכוכית קטן.
   2. - ממיסים 200 מ"ג של כולסטרול בכלורופורם 10 מ"ל באמצעות בקבוק זכוכית קטן.
   3. - היכונו והחיטוי לעקר 5% גלוקוז ב100 מ"ל של רנ"א / מים מזוקקים חופשיים ה-DNA ASE.
3. יש לשטוף את הבקבוק מסביב לתחתית עם כלורופורם. הוסף 5-10 מ"ל לבקבוק, המערבולת, ולתת לו לשבת במשך כמה דקות. שמור את הבקבוק מכוסה ברדיד אלומיניום בכל העת. רוקן את כלורופורם מהבקבוק.
4. הכנת ליפוזומים:
   1. - הוספה 315 μl של פתרון מניות DOAB לבקבוק מסביב לתחתית.
   2. - הוספה 200 μl של פתרון מניות כולסטרול לבקבוק.
   3. - הוסף 9.5 מ"ל של כלורופורם לבקבוקND לערבב על ידי מערבולת.
5. הגדר את rotavapor על 37 מעלות צלזיוס, 100 סיבובים לדקה (סל"ד) או יותר (100-120 סל"ד). Rotavapor צריך להיות מחובר לשליטת ואקום משאבת מים עם צינור יניקה המחוברת כמו שצריך.
6. חבר את המכל גז הארגון וrotavapor.
7. צרף את הבקבוק לrotavapor ולהתאים את ההגדרות האופטימליות לפני הורדתו באמבט המים. פתח את השסתום הראשון לארגון לחלוטין על ידי הפיכתו נגד כיוון השעון. תמיד לפתוח ולסגור את השסתום הזה ראשון. השסתום השני שולט בלחץ ניפוח בארגון לבקבוק. הלחץ צריך להיות עדין תמיד.
8. מנמיכים את rotavapor באמבט המים, מספיק הבקבוק לגעת במים מבלי להיות שקוע לחלוטין ולהדליק את המהירות.
9. חכה עד שכל מתאדה כלורופורם, כ -10 דקות. ואז לעצור את המכונה.
10. כבה את מהירות rotavapor ואת שסתומי טנקי הארגון. עכשיו יש להוציא את הבקבוק.
11. הוסף 2 מ"ל של 5% גלוקוז לבקבוק הדואר לפזר את השומנים.
12. לגרד את תחתית הבקבוק ביסודיות באמצעות טיפ 1 מיליליטר פיפטה לפזר את כל השומנים. לאחר הגירוד, להסיר כל שומנים שנותרו מקצה 1 מ"ל לתוך הבקבוק, במידת צורך, עם קצה שני.
13. דגירה הפתרון שהושג ב42 ° C אמבט מים תוך vortexing לאט (15 סל"ד) הבקבוק.
14. מלא את מע"מ sonicator עם מים קרים. Sonicate הפתרון לפחות 20-30 דקות עם הבקבוק והרים את התחתית רק בקושי נוגע במים.
15. מחממים את הבקבוק באמבט המים של rotavapor במשך 20 דקות על 42 מעלות צלזיוס, במהירות אפס, עם התחתית העגולה שקועה במים, הפעם.
16. לסנן את יפוזומים דרך מיקרון 0.47 ולאחר מכן, 0.22 מסנני מזרק מיקרון.
17. באמצעות מכבש קטן, לסנן את יפוזומים דרך קרום ננומטר 50 כדי לייצר אוכלוסייה הומוגנית של שלפוחית ​​liposome unilamellar.
18. העבר את יפוזומים לצינור Eppendorf ולמקם אותו על קרח.

2. הכינו את יפוזומים: siRNA-ITSN-1 תסביכים

1. Resuspend _ITSN siRNA העכבר על היעד בחיץ siRNA המכיל 20 מ"מ וHEPES נתרן כלורי 150mm, pH 7.4, לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / μl. שמור את זה על קרח לפני הערבוב.
2. הכן את יפוזומים: מתחמי _ITSN siRNA ביחס של 8 ליפוזומים nmol: 2 RNA מיקרוגרם (או 400 ליפוזומים nmol: _ITSN siRNA מיקרוגרם 100). במחקר הנוכחי, שהוספנו 50 μl של _ITSN siRNA מפתרון המניות (50 מיקרומטר) עד 100 μl של יפוזומים עתה הוכנו באמצעות צינור Eppendorf בחינם DNA-ASE RNA /. שימו לב שהריכוז של _ITSN siRNA הוא מאוד חשוב, כי מקסימום של 150 μl של תערובת ניתן להזריק בילטרלי ורטרו מסלולית בעכבר בפעם אחת.
3. שמור את התערובת על קרח בעת שהמתין כדי להזריק את העכברים.

3. הזרקה לוריד רטרו מסלולית עכבר (זווית פנימית של שקע העין)

jove_content "> כל ניסויי העכבר אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות הטיפול של אוניברסיטת Rush בבעלי חיים המוסדיים ועדת שימוש.

1. להרדים את העכבר על ידי הזרקה תוך הצפק של קטמין 50 מ"ג / ק"ג משקל גוף ומשקל גוף 5 xylazine מ"ג / ק"ג (תערובת זמינה מסחרי). בהתאם למשקל וגיל בעלי החיים, להתאים את עוצמת קול וריכוז ההרדמה. העכברים ששמשו במחקר העכברים הם CD1 עכברי זכרים, 6-8 שבועות ושוקלים סביב 25 גרם. את המזרקים הם סוג טוברקולין 1 מ"ל עם המחט מחוברת.
2. החזק את אוזני עכבר ביד אחת ולהפוך את העכבר למטה בצד לחשוף את הזווית הפנימית של העין. המטרה המדיאלי לsemilunaris plica; להימנע מלגעת בגלגל העין.
3. מתקרב לcaruncle הדמע של העין מחזיקה את המזרק המכיל את התערובת בזווית של 45 מעלות בכל שלושת הצירים.
4. לאט לאט להזריק את התערובת ולתת לעכבר כדי להתאושש עם הצד המוזרק למעלה. אם נוזל גדולצורות רביב במקום החדרת המחט, לחזור בו מחט, שאיבה בחזרה הטיפה לתוך המזרק ונסו שוב. זריקות חוזרות ונשנות נעשות על ידי מיטב לסירוגין את העיניים, כדי לאפשר התאוששות מושלמת. אם אינך בטוח, ניתן לבדוק בטכניקה זו על ידי הזרקת צבע כחול (50 μl, סגול גביש 0.5% במתנול) וחושף את ריאות העכבר כדי לבחון את כלי הדם הכחולים.
5. העכברים במחקר זה הוזרקו כל יום 3 ^rd במשך 3 שבועות ללא הרוגים או תופעות לוואי.

4. זלוף עכבר ריאות ואוסף רקמות ללימודים ביוכימיה

0. הגדר את משאבת peristaltic לרוץ ב1.5 מ"ל / דקה.
1. הכן את ההגדרה: מכונת הנשמה, שולחן ניתוחים, מכשירים, צמר גפן סטרילי, Q-טיפים, מחרוזות, כוסות, מים מזוקקים, מלח מאוזן של האנק, נותב.
2. להרדים את העכבר על ידי זריקת intraperitoneal של תערובת ההרדמה (קטמין 100 מ"ג / ק"ג משקל גוף ומשקל הגוף xylazine 10 מ"ג / ק"ג).
3. ברמת הצוואר, להסיר את בלוטות הרוק ולחשוף את קנה הנשימה.
4. התחל עם laparotomy, בלו הסרעפת, ופעל עם פתיחת בית החזה, חושף את הריאות ואת הלב.
5. הסר את התימוס.
6. שימוש במיקרוסקופ האור לדיוק טוב יותר, לצנתר את העורק הריאתי.
7. האם הנשמה וצנרר העכבר באמצעות tracheostoma. הגדר את מכונת ההנשמה לשיעור של 150 מקרי שבץ / דקה ונפח פעימה של 150 μl.
8. כפורקן, לפתוח את הפרוזדור השמאלי.
9. Perfuse כלי דם הריאה העכבר ללא דם במשך 5 דקות, תוך שימוש בפתרון של האנק המשאבה וperistaltic חימם על 37 ° C.
10. Perfuse נותב (8 ננומטר זהב אלבומין ¹⁶⁾ לתוספת 10 דקות באותו קצב הזרימה.
11. לשטוף נותב מאוגד על ידי זלוף ריאות דקות 5 עם פתרונו של האנק.
12. פעל עם קיבוע באתרו של הריאות על ידי 10 זלוף דקות של 4% (wt / כרך) פורמלדהיד, 2.5% glutaraldehyde, ו -1% חומצה טאני ב0.1 צינורותחיץ, pH 7.2.
13. לאסוף את הריאות, להסיר את הרקמה המוגזמת, לחתוך קוביות קטנות (3/3 מ"מ), ומניח אותם לבקבוקון נצנץ כותרת המכיל 2 מ"ל של תערובת מקבע.

העכברים יפוגו בהרדמה מלאה במהלך ההליך.

5. עיבוד רקמת ריאה עכבר לEM

1. הכינו פתרונות מניות: 1% Palade ₄ oso, אצטט הוורונל, וחיץ קלנברגר.
   1. - 1% חיץ Palade-oso ₄ מכיל: 1 מיליליטר מניית אצטט הוורונל, 1.25 מ"ל 4% ₄ oso, 1 מ"ל של 0.1 N חומצה הידרוכלורית, ומים מזוקקים עד 5 מ"ל של נפח סופי.
   2. - פתרון מניות הוורונל אצטט מתקבל על ידי המסת 1.15 andydrous גרם נתרן אצטט ו2.94 g barbital ב100 מ"ל של מים מזוקקים.
   3. פתרון-קלנברגר מכיל 2 מ"ל של מניית הוורונל אצטט, 2.8 מ"ל של 0.1 N חומצה הידרוכלורית, 0.05 אצטט uranyl גרם, ו5.1 מ"לשל מים מזוקקים, pH = 6.
2. שטוף את גושי הריאה ב0.1 מ 'נתרן cacodylate חיץ, pH = 7.4, 3 פעמים לזמן קצר.
3. תקן את הדגימות ב4% (wt / כרך) פורמלדהיד, glutaraldehyde 2.5% בחיץ צינורות 0.1, pH 7.2, עבור שעה 1, בטמפרטורת חדר.
4. פוסט לתקן עם Palade-אוסמיום 1% עבור שעה 1 במכסת המנוע, על קרח, בחושך.
5. יש לשטוף פעם אחת עם חיץ קלנברגר.
6. דגירה דגימות בקלנברגר חיץ במשך שעה 2 ללילה, בטמפרטורת חדר.
7. יש לשטוף פעם אחת ב 50% אתנול.
8. ליבש עם סדרה מדורגת של אתנול, 5 דקות / כל אחד: 70%, 95%, ולאחר מכן 2 x 15 דקות 100% אתנול.
9. מעבר ל -100% פרופילן אוקסיד, 2 x 15 דקות.
10. הסר פרופילן אוקסיד ולהוסיף תערובת של 50% פרופילן אוקסיד ו -50% EPON 812, דגירה הלילה, מסתובב על גלגל, בטמפרטורת חדר.
11. למחרת בבוקר, להסיר את התערובת ולהוסיף 812 EPON הטרי, לפחות עבור שעות 4-5 על ההגה.
12. שימוש בתבניות הוכפלו מחודדות, מלאותחצי דרך עם 100% טריים EPON 812, להוסיף דגימות נבחרות ולמקם אותם לקצוות.
13. להעביר את התבניות לסט החממה ב 60 ° C ולתת להם לרפא במשך 48-72 שעות.
14. כאשר polymerized, לשלוח את אבני להיות רזה (60-70 ננומטר עבה) מחולק.

תוצאות

רמות חלבון וה-mRNA ITSN-1s היו במעקב במספר נקודות זמן לאחר לידת _ITSN siRNA ידי כתם המערבי וPCR הקונבנציונלי וכמותית ^בכ4. רמות חלבון וה-mRNA ITSN-1S בעכבר ריאות שטופלו _ITSN siRNA היו כ -75% נמוכים יותר על ידי התייחסות לבקרות במהלך מתמדת של מציאה ITSN-1S במשך 21 ימים. ללא ITSN-1S, dynamin-2...

Discussion

בהתבסס על מחקרים קודמים שפורסמו על ידי אחרים ^{ו9 1, 18} שפתחנו מתודולוגיה זו לטווח ארוך להפיל של ITSN-1S in vivo על ידי עירוי לוריד חזר (בכל שעה 72, במשך 24 ימים רצופים) של siRNA הספציפי / מתחמי liposome. גישה ניסויית זה היא יעילה, בטוח לשימוש ושוב ושוב וניתן להרחיב אותו בקלות כדי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB)	Sigma-Aldrich	D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder)	Avestin Inc.	LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore	Avestin Inc.	LFM-50
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-8667
Chloroform	Mallinckrodt Chemicals	4432-04
Hank's balanced salts	Sigma-Aldrich	H1387
Round-bottom flask	Fisher Scientific	FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN - on target	Dharmacon/ThermoScientific	J-046912-11
Peristaltic pump	Ismatec	REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator	Hugo Sachs Electronik	NA
Barbital	Sigma-Aldrich	B-0500
Uranyl acetate	EM Sciences	22400
Epon812	EM Sciences	Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide	EM Sciences	20400
Embedding molds	EM Sciences	69923-05
Tannic acid	EM Sciences	21710
8 nm gold-albumin tracer		Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120