Imagen tridimensional de nociceptivos Fibras Nerviosas intraepidérmicas en biopsias de piel humana

Resumen

Con el fin de estudiar los cambios en las fibras nerviosas nociceptivas intraepidérmicos (IENFs) en neuropatías dolorosas (PN), hemos desarrollado protocolos que podrían examinar directamente los cambios morfológicos observados en tres dimensiones en IENFs nociceptivas. El análisis tridimensional de IENFs tiene el potencial para evaluar los cambios morfológicos de IENF en PN.

Resumen

Un punzón de biopsia de la piel se utiliza comúnmente para cuantificar la densidad de fibras nerviosas intraepidérmicos (IENFD) para el diagnóstico de ^1,2 polineuropatía periférica. En la actualidad, es una práctica común para recoger biopsias de piel 3 mm a partir de la pata distal (DL) y el muslo proximal (PT) para la evaluación de las polineuropatías dependiente de la longitud ^3. Sin embargo, debido a la naturaleza multidireccional de IENFs, es un reto para examinar superposición de estructuras nerviosas a través del análisis de formación de imágenes de dos dimensiones (2D). Alternativamente, imágenes en tres dimensiones (3D) podría proporcionar una mejor solución para este dilema.

En el presente informe, se presentan métodos para la aplicación de imágenes en 3D para estudiar la neuropatía dolorosa (PN). Con el fin de identificar IENFs, muestras de piel se procesan para el análisis de inmunofluorescencia de producto de gen de la proteína 9.5 (PGP), un marcador neuronal sartén. En la actualidad, es una práctica estándar para diagnosticar neuropatías de fibras pequeñas utilizando IENFD disuadirminada por inmunohistoquímica utilizando PGP microscopía de campo claro ^4. En el estudio actual, se aplicó análisis de doble inmunofluorescencia para identificar IENFD total de, utilizando PGP, y IENF nociceptivo, a través del uso de anticuerpos que reconocen la tropomiosina-receptor-quinasa A (Trk A), el receptor de alta afinidad para el factor de crecimiento de los nervios ^5. Las ventajas de IENF co-tinción con PGP y Trk A anticuerpos beneficia el estudio de la PN por tinción con claridad, fibras nociceptivas PGP-positivos. Estas señales fluorescentes se pueden cuantificar para determinar los cambios morfológicos y IENFD nociceptivas de IENF asociados con PN. Las imágenes fluorescentes se adquirieron por microscopía confocal y se procesaron para análisis en 3D. 3D-imagen proporciona capacidades de rotación seguir analizando los cambios morfológicos asociados a la PN. En conjunto, co-tinción fluorescente, la imagen confocal y análisis 3D se benefician claramente el estudio de la PN.

Introducción

En la actualidad, es una práctica común para los médicos para cuantificar la densidad de fibras nerviosas intraepidérmicos, (IENFD) a partir de biopsias de piel en sacabocados, que pueden ser utilizados para diagnosticar neuropatías de fibras pequeñas ^{3, 6-8.} Las biopsias se toman de la pierna distal (DL), 10 cm por encima del maléolo lateral y el muslo proximal (PT), 20 cm por debajo de la espina ilíaca anterior ^9. Todos IENF están etiquetados de usar el producto gen de la proteína 9.5 (PGP), un marcador neuronal bandeja ^10-12. En la actualidad, es una práctica estándar para diagnosticar neuropatías de fibras pequeñas utilizando IENFD determinado por tinción de PGP con microscopía de campo claro ^6. Además, varios grupos de investigación han utilizado protocolos de inmunofluorescencia para PGP inmunohistoquímica ^7-9. Neuropatía de fibras pequeñas se asocia con el dolor neuropático. Para entender mejor el papel de IENF esencial para el procesamiento del dolor, se desarrolló una técnica para co-label total de IENF con fibras que generan dolor. Nocicepcióntiva IENF, específicamente Aδ y las fibras C, se pueden estudiar a través de la co-etiquetado de IENF con PGP y el marcador nociceptivo, tropomiosina-receptor-quinasa A (Trk A) ^5. Trk A es el receptor de alta afinidad para el factor de crecimiento nervioso que es esencial para el desarrollo de la nocicepción. Las fibras nerviosas nociceptivas A-positivos Trk son fibras peptidérgicas que expresan la sustancia P (SP) y el péptido relacionado con el gen calcitonina (CGRP). Anteriormente, Lauria y sus colegas aplicaron la técnica de doble etiquetado para estudiar PN, co-etiquetado IENF PGP-positiva con un marcador de ¹⁰ nociceptivo. En nuestro estudio anterior, hemos demostrado que Trk IENF A positivo, pero no Trk IENF A negativo, se upregulated en un modelo animal de la neuropatía diabética dolorosa ^5. Esta técnica de co-etiquetado proporciona la capacidad para comparar la cuantificación de IENFD nociceptivo al total de IENFD y la capacidad para estudiar los cambios morfológicos asociados con PN. La capacidad de visualizar nociceptivo IENF y compañerasre cuantificación de IENFD total a la IENFD nociceptivo podría proporcionar evidencia objetiva para la presencia de dolor, y, posiblemente, una idea de la severidad del dolor asociado con PN. Esta técnica es también aplicable a la piel de modelos animales. En comparación con estudios previos, el protocolo actual describe métodos para el análisis de imagen en 3D, la creación de la oportunidad de evitar errores que podrían ocurrir en el análisis de imagen 2D.

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Protocolo

Parte A: La inmunohistoquímica

Preparación de la placa de 96 pocillos y la prevención de la tinción de fondo biopsias en sacabocados de piel se recogen a partir de sujetos humanos y se incubaron durante 12-24 h en solución fijadora (2% de paraformaldehído con una solución de L-Lisina 0,75 M (pH 7,4) y 0,05 mM de peryodato de sodio) a 4 ° C como se ha descrito previamente ^8. Las muestras son entonces cryoprotected en tampón fosfato salino (PBS) con 20% de glicerol a 4 º C durante hasta 1 semana, incrustado en un medio de montaje de temperatura óptima de corte (OCT), a continuación, se seccionó en 50 micras de espesor secciones en un criostato. El protocolo se describe a continuación está diseñado para 8 secciones de piel, el número máximo de secciones de piel posible someterse a técnicas de inmunohistoquímica de flotación libre en una placa de 96 pocillos.

DÍA 1:

1. Prevención de la inmunorreactividad no específica en el estrato córneo

1. Etiqueta de placa de 96 pocillos como se muestra en la Figura 1.
2. Añadir 150 l de Imagen FX-TI de señal (Image-TI), eficaz para el bloqueo de la tinción de fondo ^11,12, en cada pocillo en la fila 1 de la placa de 96 pocillos.
3. Añadir 150 l de 1X PBS en cada pocillo en la fila 2 y 3 de la placa de 96 pocillos.
4. Adquirir dos secciones de 50 micras por paciente: una sección de la biopsia tomada en DL, una sección de la biopsia tomada en PT. Un asa de inoculación (LeLoop) se utiliza para transferir secciones de un enjuague a la siguiente para evitar daño morfológico. Transferir suavemente cada sección de 50 m, con un asa de inoculación, en un individuo y de la fila 1, que contiene imagen-IT. Incubar las secciones de imagen-IT durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador plana.
5. Enjuague secciones dos veces con PBS 1X (filas 2 y 3) durante 10 min a TA. Coloque la placa de bien en una mecedora plana entre enjuagues.

2. Preparación de 5% de BSA disolución de bloqueo y 1% de solución de enjuague

1. Mientras que las secciones de biopsia están incubando en la imagen-IT, prepare 5% solución de bloqueoción (5% de BSA, TX-100, 0,3% solución 0,1 M de PBS-BSA al vórtice hasta que se disuelve completamente).
2. Añadir 150 l de solución de bloqueo BSA al 5% en cada pocillo de la fila 4.
3. El uso de un asa de inoculación, transferir secciones en pocillos individuales de solución de bloqueo BSA al 5%. Incubar las secciones de solución de bloqueo BSA 5% durante 1-2 horas a temperatura ambiente en un agitador plana.

3. Preparación de BSA al 1% solución de lavado y dilución de los anticuerpos primarios

1. Mientras que las secciones están incubando en solución de bloqueo BSA al 5%, preparar la solución de enjuague 1% (1% de BSA, TX-100, solución de PBS-Vortex 0,1 M hasta 0,3% de BSA se disuelve completamente).
2. Mientras que las secciones están incubando en solución de bloqueo BSA al 5%, se diluye anticuerpos primarios en 1% de solución de lavado.
   1. Durante ocho secciones (8 x 150 l = 1,200 l) Se necesita un total de 1.200 l. Los anticuerpos primarios se componen de 1,500 l (aproximadamente 20% del volumen extra).
   2. Las diluciones de los anticuerpos primarios: PGP, 1:500; Trk A,1:500 en BSA al 1% de solución de lavado.

4. La incubación de las biopsias seccionados en el anticuerpo primario

1. Añadir 150 l de anticuerpos primarios diluidos en los pocillos designados de la placa de 96 pocillos (fila 5).
2. Transferencia secciones de solución de bloqueo 5% (fila 4) en los pocillos de anticuerpos primarios designados (fila 5).
3. Selle la placa de 96 pocillos con parafilm y papel de aluminio para evitar que se sequen y exposición a la luz.
4. Incubar la placa de 96 pocillos O / N a 4 ° C en un agitador plana.

DÍA 2:

5. Enjuague biopsias en BSA al 1% de solución de enjuague

1. Añadir 150 l de solución de lavado BSA al 1% en cada pocillo en la fila 6, 7, y 8.
2. Enjuague secciones tres veces con solución de lavado BSA 1% (Filas 6, 7, y 8) durante 1 hora cada vez a temperatura ambiente. Cubra el plato bien con papel de aluminio y colocar en rocker plano entre enjuagues.

6. La dilución de anticuerpos secundarios

1. Mientras que las secciones se incubaron en el último enjuague de solución de lavado BSA al 1% (fila 8), diluir anticuerpos secundarios en solución de lavado BSA al 1%:
   1. Durante ocho secciones (8 x 150 l = 1,200 l) Se necesita un total de 1.200 l. La secundaria de anticuerpos se preparan en 1500 l (aproximadamente 20% del volumen extra).
   2. Las diluciones de los anticuerpos secundarios: para PGP (Alexa Fluor 488 burro anti-conejo, 1:250), para Trk A (Alexa Fluor 647 burro anti-cabra, 1:250) en 1% BSA solución de lavado.

7. La incubación de las biopsias seccionados en el anticuerpo secundario

1. Añadir 150 l de anticuerpos secundarios diluidos en sus pocillos designados de la placa de 96 pocillos (Fila 9).
2. Transferencia secciones de solución de bloqueo 1% de BSA (Fila 8) en anticuerpo secundario bien (Fila 9).
3. Selle la placa de 96 pocillos con parafilm y papel de aluminio para evitar que se sequen y exposición a la luz.
4. Incubar las secciones de los anticuerpos secundarios designada O/ N a 4 ° C en un agitador plana.

8. Enjuague biopsias en BSA al 1% de solución de enjuague

1. Añadir 150 l de solución de lavado BSA al 1% en cada pocillo en la fila 10, 11, y 12.
2. Enjuague secciones tres veces con solución de lavado BSA 1% (filas 10, 11, y 12) durante 1 hora cada vez a temperatura ambiente. Cubra el plato bien con papel de aluminio y colocar en una mecedora plana entre enjuagues.

9. Preparación de preparaciones microscópicas y montaje Biopsias seccionados

1. Mientras que las secciones de biopsia están incubando en el último enjuague de solución de lavado BSA 1% (fila 12), preparar portaobjetos.
2. Coloque 50 l de BSA al 1% de solución de lavado en una diapositiva a la vez.
3. Retire las secciones del 1% BSA solución de lavado (Fila 12) y colocarlo en la 50 l gota de solución de lavado BSA al 1% en el portaobjetos de un microscopio designado. Después de la optimización de la posición de la sección, eliminar el exceso de solución de lavado BSA al 1% con una pipeta de vidrio abombada, tomando las precaucionespara evitar el contacto de la muestra.

NOTA: Asegúrese de que la sección no está doblada, la muestra debe ser plana contra la superficie del portaobjetos.

4. Colocar 1 gota de reactivo prolongar Oro de montaje con DAPI cerca de la biopsia en el portaobjetos de un microscopio Antifade. Tome un microscopio mm cubreobjetos de 22x22 y suavemente colóquelo sobre una biopsia y una gota de prolongar antifade reactivo de oro con caída DAPI. Repita para cada sección.
5. Vamos portaobjetos seco O / N a temperatura ambiente en la oscuridad.

NOTA: Quite las burbujas de aire utilizando una punta de pipeta. Limpie el exceso de prolongar Gold antifade reactivo.

Parte B: Confocal de imágenes

10. Confocal de imágenes

1. Señales de fluorescencia de imagen utilizando una FluoView 500 microscopio confocal de barrido con una inmersión en aceite (1,3 NA) objetivo y zoom dos veces con software versión 5.0 FluoView 40X láser Olympus.
2. Utilice Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 647 para excitar el 543-nm HeNe láser verde y el 633-nm láser HeNe rojo, respectivamente. La señal de Alexa Fluor 488 está representado por una mirada verde tabla de consulta (LUT) y el Alexa Fluor 647 por una LUT rojo.
3. Ajuste las aberturas confocal para cada detector a 400 micras para mejorar las señales. Exploraciones secuenciales deben ser tomadas con una resolución de 1024 x 1024 para maximizar la separación de señales.
4. Captura tridimensional z-serie utilizando 1,2 micras intervalos de z a paso (sobre la base de la unidad de escaneado óptima calculada por el software FluoView) con Kalman promedio (dos marcos).

Parte C: La visualización tridimensional y animación

11. Tridimensional Visualización y animación (3D)

1. Archivos Fluoview abiertas en software Imaris x64 (versión 7.3, Bitplane AG) para visualizar los conjuntos de imágenes en 3D.
2. Ajuste mostrará cuando sea necesario para mejorar el contraste de la señal específica del nervio.
3. Crear un surface para visualizar el límite dermo-epidérmica. Utilice la herramienta de contorno en el modo de dibujo para dibujar el contorno.
4. Asignar una superficie semi-transparente a la frontera con el fin de ver las señales fluorescentes subyacentes.
5. Captura imágenes fijas de las señales fluorescentes en 3D para crear imágenes instantáneas de la película en 3D.
6. Utilice la función de animación para crear una película en 3D. Las imágenes se pueden girar 360 grados varias veces para mostrar cada señal por separado y combinado (Figuras 2, 3 y 4). Establezca la animación para crear películas que consta de 200 cuadros animados a 15 fotogramas por segundo. Guarde cada película como archivo AVI prima.
7. Comprimir la última película AVI con el software VirtualDub (versión 1.9.4).

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Resultados

Se aplicó el protocolo actual para estudiar la morfología de IENF en PT y DL biopsias de piel de pacientes con PN. La piel, a partir de tres sujetos, se recogió en la Universidad de Utah para demostrar la patomorfología asociado con PN. Los temas incluyen: Caso 1: varón de 51 años de edad, con antecedentes de PN de la diabetes tipo 2 (duración: 14 meses, la puntuación de dolor: 51), y Caso 2: varón de 56 años de edad, con antecedentes de PN de la diabetes tipo 2 (duración: 108 meses, la puntuación de dolor: ...

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Discusión

Medición de IENFD ha sido ampliamente utilizado para determinar el grado de neuropatías periféricas ^13,14. En la actualidad, el protocolo más comúnmente utilizado sólo mide las densidades de las fibras nerviosas que penetran en la membrana basal de la epidermis; no toma en consideración de ramificación axonal y / o cambios morfológicos de los nervios. Además, no se ha demostrado el análisis IENFD actual para correlacionar IENFD con la presencia de dolor en PN ^15.

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X PBS	Fisher Scientific	BP399-4	To make up 1X PBS
Image-IT FX Signal	Invitrogen	I36933	Image-IT
Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit)	AbD Serotec	7863-0504	PGP
Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat)	R&D Systems	AF1056	Trk A
Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit	Invitrogen	A21206	AF488 donkey α-goat
Alexa Fluor 647 donkey α-goat	Invitrogen	A21447	AF647 donkey α-goat
Albumin, from Bovine Serum	Sigma-Aldrich	A7906-100	BSA
Triton X- 100	Sigma-Aldrich	T9284	TX-100
Non-calibrated Loop	LeLoop	MP 199025	inoculating Loop
96-well assay plate	Corning Incorporated	3603	Well plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36931	DAPI
Microscope Cover Glass 22x22 mm	Fisher Scientific	12-541-B	Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Microscope Slides
Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	FV500	Confocal Microscope
Optimum Cutting Temperature	Sakura	4583	OCT
Leica cryostat	Leica	CM1850	Cryostat