הדמיה תלת ממדית של סיבי עצב Intraepidermal nociceptive בביופסיות עור אדם

Summary

על מנת ללמוד את השינויים של סיבי עצב intraepidermal nociceptive (IENFs) בneuropathies כואב (PN), פיתחנו פרוטוקולים שיכולים ישירות לבחון שינויים מורפולוגיים תלת ממדיים שנצפו בIENFs nociceptive. ניתוח תלת ממדי של IENFs יש את הפוטנציאל כדי להעריך את השינויים מורפולוגיים של IENF בPN.

Abstract

ביופסיה של העור משמשת בדרך כלל כדי לכמת את צפיפות סיבי עצב intraepidermal (IENFD) לאבחון של ^1,2 פולינאורופתיה ההיקפי. נכון לעכשיו, הוא מנהג נפוץ כדי לאסוף 3 מ"מ ביופסיות עור מהרגל דיסטלי (DL) והירך הפרוקסימלי (PT) להערכת polyneuropathies אורך תלויה ^3. עם זאת, בשל אופי multidirectional של IENFs, זה מאתגר לבחון חופף מבנים עצביים דרך הניתוח של הדמיה דו ממדית (2D). לחלופין, הדמיה תלת ממדית (3D) יכולה לספק פתרון טוב יותר לדילמה זו.

בדו"ח הנוכחי, אנו מציגים שיטות ליישום 3D הדמיה ללמוד נוירופתיה הכואבת (PN). על מנת לזהות IENFs, דגימות עור מעובדות לניתוח immunofluorescent של מוצר חלבון גן 9.5 (PGP), סמן עצבי מחבת. נכון לעכשיו, הוא מנהג סטנדרטי לאבחון neuropathies סיבים הקטנים באמצעות IENFD להרתיענכרה על ידי אימונוהיסטוכימיה PGP באמצעות מיקרוסקופיה brightfield ^4. במחקר הנוכחי, אנחנו מוחלים ניתוח כפול immunofluorescent לזהות IENFD הכולל, באמצעות PGP, וIENF nociceptive, באמצעות השימוש בנוגדנים המזהים tropomyosin קולט-קינאז, זיקה גבוהה לקולטן (TRK) לגורם גדילה עצבי ^5. היתרונות של IENF שיתוף מכתים עם PGP וTRK A נוגדני יתרונות המחקר של PN ידי בבירור מכתים סיבי PGP חיוביים, nociceptive. ניתן לכמת אותות ניאון אלה כדי לקבוע שינויי IENFD ומורפולוגי nociceptive של IENF קשורים PN. את תמונות הניאון נרכשות על ידי מיקרוסקופיה confocal ומעובד לניתוח 3D. 3D הדמיה מספקת יכולות סיבוב נוסף כדי לנתח שינויים מורפולוגיים הקשורים PN. יחדיו, ניאון שיתוף מכתים, ההדמיה confocal, וניתוח 3D באופן ברור לטובת המחקר של PN.

Introduction

נכון לעכשיו, הוא מנהג נפוץ עבור רופאים לכמת צפיפות סיבי עצב intraepidermal, (IENFD) מביופסיות אגרוף עור, שניתן להשתמש בם כדי לאבחן neuropathies קטן סיבים ^{3, 6-8.} ביופסיות שנלקחו מהרגל דיסטלי (DL), 10 ס"מ מעל malleolus לרוחב, וירך הפרוקסימלי (PT), 20 ס"מ מתחת לעמוד השדרה הכסל הקדמי ^9. כל IENF מסומנים באמצעות מוצר גן חלבון 9.5 (PGP), סמן ^10-12 מחבת עצבית. נכון לעכשיו, הוא מנהג סטנדרטי לאבחון neuropathies סיבים הקטנים באמצעות IENFD נקבע על ידי צביעת PGP עם brightfield מיקרוסקופיה ^6. בנוסף, מספר קבוצות מחקר השתמשו בפרוטוקולי Immunofluorescent לPGP אימונוהיסטוכימיה ^7-9. נוירופתיה סיבים קטנה היא נפוצה הקשורים כאב נוירופתי. על מנת להבין את תפקידו של IENF החיוני לעיבוד כאב נוסף, פיתחנו טכניקה לIENF הכוללת שיתוף תווית עם סיבים שיוצרים כאב. Nociceptive IENF, במיוחד Aδ וסיבי C, ניתן ללמוד דרך שיתוף התיוג של IENF עם PGP וסמן nociceptive, tropomyosin-קולטן קינאז (TRK) ^5. TRK הוא זיקה הגבוהה לקולטן לגורם גדילה עצבי שחיוני להתפתחות של Nociception. את סיבי עצב nociceptive חיובי TRK הם סיבים שpeptidergic המפורש חומר P (SP) וקלציטונין גנים הקשורים פפטיד (CGRP). בעבר, Lauria ועמיתיו ליישם את הטכניקה כפולת התיוג ללמוד PN, IENF PGP חיובי שיתוף תיוג עם סמן nociceptive ^10. במחקר הקודם שלנו, הוכיח כי IENF TRK-חיובי, אך לא IENF שלילי TRK, שהוגברו במודל חיה של נוירופתיה סוכרתית כואבת ^5. טכניקת שיתוף תיוג זה מספקת את היכולת להשוות כימות של IENFD nociceptive לסך IENFD והיכולת ללמוד שינויים מורפולוגיים הקשורים PN. היכולת לדמיין IENF nociceptive וcompaמחדש כימות של IENFD המוחלטת לIENFD nociceptive יכולה לספק ראיות אובייקטיביות לקיומו של כאב, ואולי תובנה חומרת כאב קשור PN. טכניקה זו היא גם לעור של מודלים של בעלי חיים. בהשוואה למחקרים קודמים, בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לניתוח תמונת 3D, יצירת ההזדמנות להימנע מטעויות שעלולות להתרחש בניתוח תמונת 2D.

Protocol

חלק א ': אימונוהיסטוכימיה

הכנה של צלחת 96 היטב ומניעה של ביופסיות עור Punch מכתים רקע נאספות מבני אדם וטופחו במשך 12-24 שעות בפתרון מקבע (paraformaldehyde 2% עם פתרון 0.75 מ 'L-ליזין (pH 7.4) ונתרן 0.05 מ"מ periodate) על 4 מעלות צלזיוס כפי שתואר לעיל ^8. דוגמאות אז cryoprotected בופר פוספט (PBS) עם גליצרול 20% על 4 מעלות צלזיוס עד שבוע 1, מוטבע בתקשורת הרכבה טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר), ולאחר מכן מחולקת למקטעים עבים 50 מיקרומטר על cryostat. הפרוטוקול המתואר להלן מיועד לחלקי עור 8, את המספר המרבי של חלקי עור אפשר לעבור אימונוהיסטוכימיה החופשית צף באחד 96 גם צלחת.

יום 1:

1. מניעת immunoreactivity הלא ספציפי בשכבה הקרנית

1. 96 גם צלחת תווית כפי שמוצג באיור 1.
2. הוסף 150 μl של תמונה-IT FX איתותים (Image-IT), יעילות לחסימת מכתים רקע ^11,12, לכל אחד גם בשורת 1 של 96 גם הצלחת.
3. הוסף 150 μl של 1X PBS היטב לתוך כל אחד בשורת 2 ו -3 של 96 גם הצלחת.
4. רכישת שני סעיפים 50 מיקרומטר לכל מטופל: סעיף אחד מהביופסיה נלקחת בDL, סעיף אחד מהביופסיה נלקחת בPT. לולאת inoculating (LeLoop) משמשת להעברת חלקים מאחד למשנהו לשטוף כדי למנוע נזק מורפולוגי. בעדינות להעביר כל סעיף 50 מיקרומטר, באמצעות לולאת inoculating, לאדם גם בשורה 1, המכיל תמונה-IT. דגירה סעיפים בתמונה-IT עבור 30 דקות ב RT על כיסא נדנדה שטוחה.
5. יש לשטוף את חלקי פעמיים עם 1X PBS (שורות 2 ו -3) במשך 10 דקות ב RT. מניחים צלחת גם על כיסא נדנדה שטוחה בין שטיפות.

2. הכנה של 5% פתרון חסימת BSA ו1% פתרון שטיפה

1. בעוד סעיפי ביופסיה הם דוגרים בתמונה-IT, להכין 5% חסימת solution (5% פתרון BSA, 0.3% TX-100, 0.1 מ 'PBS-BSA וורטקס עד מתמוסס לחלוטין).
2. הוסף 150 μl של פתרון חסימת BSA 5% לבאר כל השורה 4.
3. באמצעות לולאת inoculating, להעביר חלקים לתוך בארות בודדות של פתרון 5% BSA חסימה. דגירה סעיפים בפתרון חסימת BSA 5% עבור 1-2 שעות ב RT על כיסא נדנדה שטוחה.

3. הכנה של 1% פתרון BSA שטיפה ודילול של נוגדנים ראשוניים

1. בעוד סעיפים הם דוגרים בפתרון 5% BSA חסימה, להכין 1% שטיפת פתרון (BSA 1%, 0.3% פתרון TX-100, 0.1 מ 'PBS-BSA וורטקס עד מתמוסס לחלוטין).
2. בעוד סעיפים הם דוגרים בפתרון 5% BSA חסימה, לדלל נוגדנים עיקריים ב1% שטיפת פתרון.
   1. במשך שמונה סעיפים (μl 8 X 150 = 1,200 μl) יש צורך בסכום כולל של 1,200 μl. את הנוגדנים הראשוניים מורכבים ב1,500 μl (כ -20% בנפח נוסף).
   2. דילולים של הנוגדנים העיקריים: PGP, 1:500; TRK,1:500 ב1% BSA שטיפת פתרון.

4. דגירה של ביופסיות מחולק בנוגדן ראשוני

1. הוסף 150 μl של נוגדנים עיקריים מדוללים לתוך הבארות הייעודיות של 96 גם הצלחת (שורה 5).
2. העבר את החלקים מ5% חסימת פתרון (שורה 4) לתוך בארות הנוגדן הראשוניות הייעודיות (שורה 5).
3. חותם את הצלחת 96 היטב עם parafilm ורדיד אלומיניום, כדי למנוע התייבשות וחשיפה לאור.
4. דגירה 96 גם צלחת O / N ב 4 ° C על כיסא נדנדה שטוחה.

יום 2:

5. יש לשטוף את ביופסיות בפתרון שטיפת BSA 1%

1. הוסף 150 μl של פתרון שטיפת BSA 1% לכל אחד גם בשורה 6, 7, ו -8.
2. יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם שטיפת פתרון BSA 1% (6 שורות, 7, ו -8) במשך שעה 1 בכל פעם על RT. לכסות את הצלחת היטב בנייר אלומיניום ומניחים על נדנדה שטוחה בין שטיפות.

6. דילול של נוגדנים משני

1. בעוד סעיפים מודגרת בשטיפה האחרונה של פתרון שטיפת BSA 1% (שורה 8), לדלל נוגדנים משני בפתרון שטיפת BSA 1%:
   1. במשך שמונה סעיפים (μl 8 X 150 = 1,200 μl) יש צורך בסכום כולל של 1,200 μl. את הנוגדנים משני בנויים ב1,500 μl (כ -20% בנפח נוסף).
   2. דילולים של נוגדנים משני: לPGP (אלקסה פלואוריד 488 חמור נגד הארנב, 1:250), לTRK (אלקסה פלואוריד 647 חמורים נגד עיזים, 1:250) בפתרון BSA 1% שטיפה.

7. דגירה של ביופסיות מחולק בנוגדנים משני

1. הוסף 150 μl של נוגדנים משני מדוללים לתוך בארותיהם המיועדות של צלחת 96 היטב (שורה 9).
2. העבר את החלקים מחסימת פתרון 1% BSA (שורה 8) לנוגדנים משני היטב (שורה 9).
3. חותם את הצלחת 96 היטב עם parafilm ורדיד אלומיניום, כדי למנוע התייבשות וחשיפה לאור.
4. דגירה סעיפים במיועד המשני הנוגדנים O/ N ב 4 ° C על כיסא נדנדה שטוחה.

8. יש לשטוף את ביופסיות בפתרון שטיפת BSA 1%

1. הוסף 150 μl של 1% BSA פתרון שטיפה היטב לתוך כל אחד בשורת 10, 11, ו -12.
2. יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם שטיפת פתרון BSA 1% (10 שורות, 11, ו -12) עבור שעה 1 בכל פעם על RT. לכסות את הצלחת היטב בנייר אלומיניום ומניחים על כיסא נדנדה שטוחה בין שטיפות.

9. הכנת שקופיות מיקרוסקופ וביופסיות מחולק הרכבה

1. בעוד סעיפי ביופסיה הם דוגרים בשטיפה האחרונה של שטיפת פתרון BSA 1% (שורה 12), להכין שקופיות מיקרוסקופ.
2. הנח 50 μl של פתרון BSA 1% שטיפה בשקופית אחת בכל פעם.
3. הסר חלקים מפתרון שטיפת BSA 1% (שורה 12), ולמקם אותו בירידה של 50 μl פתרון שטיפת BSA 1% בשקופית מיקרוסקופ הייעודי. אחרי אופטימיזציה עמדתו של הסעיף, להסיר פתרון BSA 1% עודף שטיפה עם טפטפת זכוכית כדורית, נקיטת אמצעי זהירותכדי להימנע ממגע הדגימה.

הערה: ודא שסעיף אינו מקופל; הדגימה צריכה להיות שטוחה על פני השטח של שקופית מיקרוסקופ.

4. מקום 1 טיפה של להאריך antifade זהב הרכבה מגיב עם DAPI ליד הביופסיה בשקופית מיקרוסקופ. קח coverslip זכוכית מיקרוסקופ מ"מ 22x22 ומניח בעדינות אותו על ביופסיה וירידה של להאריך מגיב antifade זהב עם ירידת DAPI. חזור על פעולה עבור כל מקטע.
5. בואו שקופיות מיקרוסקופ יבשה O / N ב RT בחושך.

הערה: הוצא את כל בועות אוויר באמצעות קצה פיפטה. למחות עודף להאריך מגיב antifade זהב.

חלק ב ': ההדמיה Confocal

10. ההדמיה confocal

1. אותות הקרינה תמונה באמצעות לייזר 500 FluoView אולימפוס סריקת מיקרוסקופ confocal עם נפט טבילה (1.3 NA) אובייקטיבית וזום שתי פעמים עם תוכנת 5.0 גרסת FluoView 40X.

2. השתמש אלקסה פלואוריד 488 ו אלקסה פלואוריד 647 לרגש HeNe 543 ננומטר לייזר הירוק והאדום HeNe לייזר 633 ננומטר, בהתאמה. אות אלקסה פלואוריד 488 מיוצגת על ידי מראה ירוק עד שולחן (LUT) ופלואוריד אלקסה 647 על ידי LUT אדום.
3. הגדר את פתחי confocal לכל גלאי ב400 מיקרומטר כדי לשפר את האותות. סריקות רציפות צריכים להילקח ברזולוציה של 1,024 x 1,024 למקסם את הפרדת אות.
4. ללכוד תלת ממדי Z-סדרה באמצעות 1.2 מיקרומטר מרווחי z צעד (מבוסס על יחידת הסריקה האופטימלית מחושבת על ידי תוכנת FluoView) עם מיצוע קלמן (שתי מסגרות).

חלק ג': ויזואליזציה ואנימציה תלת ממדיות

11. ויזואליזציה (3D) תלת ממדים ואנימציה

1. קבצי FluoView פתוחים בתוכנת x64 Imaris (גרסה 7.3, Bitplane AG) כדי להמחיש את הסטים של תמונות 3D.
2. התאם להציג לפי צורך כדי לשפר את הניגודיות של אות מסוימת בעצבים.
3. צור surface לדמיין גבול עורי, אפידרמיס. השתמש בכלי קונטור בתיקו מצב לשרטט את הגבול.
4. הקצאת משטח שקוף למחצה עד לגבול כדי לראות את אותות הניאון בסיסיים.
5. לכידת תמונות סטילס של אותות ניאון 3D כדי ליצור תמונות Snapshot של סרט 3D.
6. השתמש בתכונת האנימציה ליצור סרט 3D. את התמונות ניתן לסובב 360 מעלות מספר פעמים כדי להראות לכל אות בנפרד וממוזג (איורים 2, 3 ו -4). הגדר אנימציה כדי ליצור סרטים בהיקף של 200 מסגרות אנימציה ב15 מסגרות לשנייה. שמור כל סרט כקובץ AVI גלם.
7. לדחוס את סרט AVI הסופי עם תוכנת VirtualDub (גרסת 1.9.4).

תוצאות

אנחנו מוחלים פרוטוקול הנוכחי כדי ללמוד את המורפולוגיה של IENF בביופסיות עור וPT DL מחולים עם PN. העור, משלושה נושאים, שנאסף באוניברסיטת יוטה להפגין pathomorphology קשור PN. הנושאים כוללים: מקרה 1: גבר בן 51 עם היסטוריה של PN של סוכרת מהסוג 2 (משך: 14 חודשים; ניקוד כאב: 51); מקרה 2: גבר בן 56 עם ...

Discussion

מדידה של IENFD כבר בשימוש נרחב על מנת לקבוע את מידת נוירופתיה היקפית ^13,14. נכון לעכשיו, הפרוטוקול הנפוץ ביותר מודד רק את הצפיפות של סיבי עצב שחודרים את קרום המרתף של האפידרמיס, זה לא לוקח בחשבון הסתעפות ו / או שינויים מורפולוגיים של העצבים axonal. בנוסף, ניתוח IENFD נוכחי ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X PBS	Fisher Scientific	BP399-4	To make up 1X PBS
Image-IT FX Signal	Invitrogen	I36933	Image-IT
Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit)	AbD Serotec	7863-0504	PGP
Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat)	R&D Systems	AF1056	Trk A
Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit	Invitrogen	A21206	AF488 donkey α-goat
Alexa Fluor 647 donkey α-goat	Invitrogen	A21447	AF647 donkey α-goat
Albumin, from Bovine Serum	Sigma-Aldrich	A7906-100	BSA
Triton X- 100	Sigma-Aldrich	T9284	TX-100
Non-calibrated Loop	LeLoop	MP 199025	inoculating Loop
96-well assay plate	Corning Incorporated	3603	Well plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36931	DAPI
Microscope Cover Glass 22x22 mm	Fisher Scientific	12-541-B	Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Microscope Slides
Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	FV500	Confocal Microscope
Optimum Cutting Temperature	Sakura	4583	OCT
Leica cryostat	Leica	CM1850	Cryostat