JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

С целью изучения изменений ноцицептивных внутриэпидермальных нервные волокна (IENFs) в болезненных невропатии (PN), мы разработали протоколы, которые могут непосредственно исследовать трехмерный морфологических изменений, наблюдаемых в ноцицептивных IENFs. Трехмерный анализ IENFs имеет потенциал, чтобы оценить морфологические изменения в IENF PN.

Аннотация

Биопсии кожи обычно используется для количественной внутриэпидермальных нервных волокон плотностью (IENFD) для диагностики периферической 1,2 полинейропатии. В настоящее время это обычная практика, чтобы собрать 3 мм биопсии кожи от дистального ногу (DL) и проксимального бедра (PT) для оценки длины зависит полинейропатии 3. Однако из-за разнонаправленного характера IENFs, это сложно рассматривать перекрытие нервных структур путем анализа двумерного (2D) изображения. Кроме того, трехмерные (3D) изображения может обеспечить лучшее решение этой дилеммы.

В настоящем докладе мы представляем методы применения 3D визуализации для изучения болезненной нейропатии (PN). Для того чтобы определить IENFs, образцы кожи обрабатываются для иммунофлуоресцентного анализа белковых генного продукта 9,5 (PGP), поддон нейронального маркера. В настоящее время она является стандартной практикой для диагностики небольших невропатии волокна с использованием IENFD сдерживанияляется PGP иммуногистохимию использованием светлого микроскопии 4. В данном исследовании мы применяли двойного иммунофлуоресцентного анализа для определения общего IENFD, используя PGP и ноцицептивной IENF, с помощью антител, которые распознают тропомиозином-рецептор-киназы (TRK), высокое сродство к рецептору фактора роста нервов 5. Преимущества совместного окрашивания IENF с PGP и ТРК антител приносит пользу изучения PN, четко окрашивания PGP-позитивные, ноцицептивных волокон. Эти флуоресцентные сигналы могут быть количественно определить ноцицептивных IENFD и морфологические изменения, связанные с IENF PN. Флуоресцентные изображения приобретаются с помощью конфокальной микроскопии и обрабатывается для анализа 3D. 3D-визуализация обеспечивает крутящий способностей для дальнейшего анализа морфологических изменений, связанных с PN. Взятые вместе, флуоресцентные совместным окрашиванием, конфокальной микроскопии и 3D анализ ясно пользу изучения PN.

Введение

В настоящее время это обычная практика для врачей количественно внутриэпидермальных нервного волокна плотностью (IENFD) из кожи биопсии удар, который может быть использован для диагностики небольших невропатии волокна 3, 6-8. Биопсии взяты из дистальной ножки (DL), 10 см над наружной лодыжки, и проксимальный бедра (РТ), 20 см ниже передней подвздошной ости 9. Все IENF помечены использованием белкового продукта гена 9,5 (PGP), пан нейронный маркер 10-12. В настоящее время она является стандартной практикой для диагностики небольших невропатии волокна с использованием IENFD определяется PGP окрашивания светлого микроскопии 6. Кроме того, некоторые исследовательские группы использовали иммунофлуоресцентного протоколы для PGP иммуногистохимии 7-9. Малый невропатии волокна, обычно связанных с невропатической боли. В целях более глубокого понимания роли IENF необходимых для обработки боли, мы разработали методику совместного этикетке общей IENF с волокнами, которые генерируют боли. Nocicepных IENF, в частности Aδ и С-волокна, могут быть изучены через кооперацию, маркировка IENF с PGP и ноцицептивной маркером, тропомиозином-рецептор-киназы (TRK) 5. Trk является высокое сродство к рецептору фактора роста нервов, что является необходимым для развития болевой чувствительности. ТРК-положительных ноцицептивных нервных волокон являются волокна, которые пептидергических экспресс вещество Р (SP) и кальцитонин ген родственный пептид (CGRP). Ранее Лория и коллеги применили двойной маркировки методика исследования PN, со-маркировки PGP-позитивные IENF с ноцицептивной маркером 10. В нашем предыдущем исследовании мы показали, что Trk IENF-положительных, но не Trk-отрицательных IENF, были активируется в животной модели болезненной диабетической нейропатии 5. Это сотрудничество маркировки метод обеспечивает возможность сравнить количественное ноцицептивных IENFD к общему IENFD и способность изучение морфологических изменений, связанных с PN. Возможность визуализировать ноцицептивных IENF и компаниямповторное определение количества от общего IENFD в ноцицептивных IENFD может обеспечить объективных признаков на наличие боли и, возможно представление о серьезности боль, связанную с PN. Этот метод также применим к коже животных моделях. По сравнению с предыдущими исследованиями, текущий протокол описывает методы для анализа 3D изображения, создавая возможность избежать ошибок, которые могут возникать в 2D анализа изображения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Часть А: Иммуногистохимия

Приготовление 96-луночный планшет и профилактики фоновое окрашивание биопсии кожи Удар собирают из человеческих субъектов и инкубировали в течение 12-24 ч в фиксирующий раствор (2% параформальдегида с 0,75 М L-лизин раствор (рН 7,4) и 0,05 мМ периодата натрия) при 4 ° С, как описано выше 8. Затем образцы криопротекции в фосфатном буферном растворе (PBS) с 20% глицерина при 4 ° С в течение 1 недели, встроенные в монтажной среды оптимальной температуры резки (OCT), а затем разрезали на 50 мкм разделы криостата. Протокол, описанный ниже предназначена для 8 секций кожу, максимальное количество разделов кожи можно проходить свободно плавающих иммуногистохимии в один 96-луночного планшета.

День 1:

1. Предупреждение неспецифической иммунореактивности в роговом слое

  1. Этикетка 96-луночный планшет, как показано на рисунке 1.
  2. Добавить 150 мкл Изображение-IT FX сигнала (Изображение-IT), эффективное для блокирования фоновое окрашивание 11,12, в каждую лунку в строке 1 96-луночный планшет.
  3. Добавить 150 мкл 1X PBS в каждую лунку в строке 2 и 3 96-луночного планшета.
  4. Приобретите два 50 мкм разделов на одного пациента: один участок от биопсии, принятые на DL, один раздел из биопсии, принятые на PT. Прививки петли (LeLoop) используется для передачи разделов из одного полоскания к следующему чтобы избежать морфологических повреждений. Аккуратно передать каждому разделу 50 мкм, используя прививки петли, в отдельную лунку ряд 1, содержащие изображения-IT. Выдержите в разделах Изображение-IT в течение 30 минут при комнатной температуре на плоской рокера.
  5. Промыть разделах дважды 1X PBS (строки 2 и 3) в течение 10 мин при комнатной температуре. Место, хорошо пластины на плоский рокер между полосканий.

2. Приготовление 5% BSA Блокирующий раствор и 1% раствора для промывки

  1. В то время как биопсия разделах высиживания в изображение-IT, готовить 5% блокирующего растворации (5% BSA, 0,3% ТХ-100, 0,1 М PBS-Vortex раствор до BSA полного растворения).
  2. Добавить 150 мкл 5% BSA блокирующего раствора в каждую лунку Ряд 4.
  3. Использование прививки петли, передавать секций в отдельных скважинах 5% BSA блокирующий раствор. Инкубируют секций в 5% BSA блокирующем растворе в течение 1-2 ч при комнатной температуре на плоской качалку.

3. Приготовление 1% BSA раствора для промывки и разбавления первичных антител

  1. А в разделах высиживания в 5% BSA блокирующий раствор, готовят 1% раствора для промывки (1% BSA, 0,3% ТХ-100, 0,1 М PBS-вихревое решение BSA до полного растворения).
  2. А в разделах высиживания в 5% BSA блокирующим раствором, разбавленным первичных антител в 1% раствора для промывки.
    1. В течение восьми разделов (8 х 150 = 1200 мкл мкл) в общей сложности 1200 мкл необходима. Первичные антитела состоят в 1500 мкл (около 20% дополнительного объема).
    2. Разведения первичных антител: PGP, 1:500; Trk,1:500 в 1% BSA раствора для промывки.

4. Инкубация Sectioned Биопсия в первичных антител

  1. Добавить 150 мкл разбавленного первичными антителами в назначенный лунки 96-луночного планшета (строка 5).
  2. Передача разделов от 5% блокирующий раствор (строка 4) в специально отведенные скважин антител (строка 5).
  3. Уплотнение 96-луночный планшет с парафином и алюминиевая фольга, чтобы избежать высыхания и освещенности.
  4. Инкубируют 96-луночный планшет O / N при 4 ° С на плоской качалку.

ДЕНЬ 2:

5. Промыть биопсий 1% BSA раствора для промывки

  1. Добавить 150 мкл 1% BSA раствора для промывки в каждую лунку в ряд 6, 7 и 8.
  2. Промыть разделах три раза 1% BSA промывки раствором (строки 6, 7 и 8) в течение 1 часа каждый раз при комнатной температуре. Кожух и пластины с алюминиевой фольгой и положите на плоскую рокер между полосканий.

6. Разведение вторичными антителами

  1. В то время как разделах инкубируют в последнем полоскании 1% BSA раствора для промывки (строка 8), разбавленные вторичные антитела в 1% BSA раствора для промывки:
    1. В течение восьми разделов (8 х 150 = 1200 мкл мкл) в общей сложности 1200 мкл необходима. Вторичные антитела состоят в 1500 мкл (около 20% дополнительного объема).
    2. Разведения вторичных антител: для PGP (Alexa Fluor 488 осла анти-кролик, 1:250), для Trk (Alexa Fluor 647 осла анти-козел, 1:250) в 1% BSA раствора для промывки.

7. Инкубация Sectioned биопсий вторичными антителами

  1. Добавить 150 мкл разбавленных вторичных антител в своих назначенных лунки 96-луночного планшета (строка 9).
  2. Передача секций от 1% BSA блокирующий раствор (строка 8) в вторичными антителами хорошо (9 ряд).
  3. Уплотнение 96-луночный планшет с парафином и алюминиевая фольга, чтобы избежать высыхания и освещенности.
  4. Выдержите разделов в назначенный вторичными антителами O/ N при 4 ° С на плоской рокера.

8. Промыть биопсий 1% BSA раствора для промывки

  1. Добавить 150 мкл 1% BSA раствора для промывки в каждую лунку в 10 строк, 11 и 12.
  2. Промыть разделах три раза 1% BSA промывки раствором (Строки 10, 11 и 12) в течение 1 часа каждый раз при комнатной температуре. Кожух и пластины с алюминиевой фольгой и положите на плоскую рокер между полосканий.

9. Подготовка стекла микроскопа и монтаж Sectioned Биопсия

  1. В то время как биопсия разделах высиживания после последнего полоскания 1% BSA раствора для промывки (строка 12), подготовить для микроскопа.
  2. Добавьте 50 мкл 1% BSA раствора для промывки на одном слайде одновременно.
  3. Удалить из разделов 1% BSA раствора для промывки (строка 12), и поместить его в 50 мкл капли 1% BSA раствора для промывки на указанном стекло микроскопа. После оптимизации положение разделе удалить избыток 1% BSA раствора для промывки с bulbed пипетки стекла, принимают меры предосторожностичтобы они не соприкасались образца.

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь раздела не загибают, образец должен быть плоским по отношению к поверхности предметного стекла.

  1. Место 1 каплю Продли Золотой Antifade монтажа реагента с DAPI рядом с биопсией на предметное стекло микроскопа. Возьмите 22x22 мм покровным стеклом микроскопа и осторожно поместите его на биопсию и капли реагента Продли Золотой Antifade с падением DAPI. Повторите эти действия для каждого раздела.
  2. Пусть микроскопом сухой O / N при комнатной температуре в темноте.

ПРИМЕЧАНИЕ: удалить пузырьки воздуха использовании кончика пипетки. Вытирать излишки Продли Золотой Antifade реагента.

Часть B: конфокальной микроскопии

10. Конфокальной микроскопии

  1. Изображение использованием сигналов флуоресценции Olympus Fluoview 500 лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с 40X нефтью погружения (1.3 NA) объективных и увеличения в два раза с Fluoview программное обеспечение версии 5.0.
  2. Используйте Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 647 для возбуждения 543 нм гелий-неоновый зеленый лазер и 633-нм гелий-неоновый красный лазер, соответственно. Alexa Fluor 488 сигнала представляет собой зеленый справочной таблицы (LUT) и Alexa Fluor 647 на красный LUT.
  3. Установка конфокальной отверстия для каждого детектора при 400 мкм для повышения сигналов. Последовательного сканирования должно быть принято при разрешении 1024 х 1024 с максимально разделения сигналов.
  4. Захват трехмерной г-серии, используя 1,2 мкм г шагом интервалов (на основе оптимального блок сканирования рассчитано с помощью программного обеспечения Fluoview) Калмана с усреднением (два кадра).

Часть C: Трехмерная визуализация и анимация

11. Трехмерные (3D) визуализации и анимации

  1. Открытое Fluoview файлов в программном обеспечении Imaris x64 (версия 7.3, Bitplane AG) для визуализации 3D наборов изображений.
  2. Настройка параметров экрана, сколько необходимо для повышения контрастности нервных специфический сигнал.
  3. Создать Суrface визуализировать кожно-эпидермального границы. С помощью контурного инструмента в режиме рисования провести границу.
  4. Назначьте полупрозрачной поверхности к границе для того, чтобы увидеть основные флуоресцентных сигналов.
  5. Захват неподвижных изображений 3D флуоресцентные сигналы для создания снимка изображения 3D-фильмов.
  6. Используйте функцию анимации для создания 3D-фильма. Фотографии можно повернуть на 360 градусов несколько раз, чтобы показать каждого сигнала отдельно и объединенной (рис. 2, 3, и 4). Набор анимации для создания фильмов, состоящих из 200 кадров анимированы при 15 кадрах в секунду. Сохранить каждый фильм в качестве сырьевого файл AVI.
  7. Сжатие заключительный фильм AVI с VirtualDub (версии 1.9.4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы применили текущий протокол для изучения морфологии IENF в СТ и биопсии кожи DL от пациентов с PN. Кожа, из трех предметов, была собрана в университете штата Юта, чтобы продемонстрировать патоморфологию связанные с PN. Предметы включают: Случай 1: 51-летний мужчина с историей PN сахарного диаб...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Измерение IENFD широко используется для определения степени периферические невропатии 13,14. В настоящее время наиболее часто используемый протокол только измеряет плотность нервных волокон, которые проникают через базальную мембрану эпидермиса, она не учитывает аксональное ветв?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов не объявить.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения Гранты K08 NS061039-01A2, Программа исследований неврологии и Discovery, и Альфред Таубман А. Института медицинских исследований в Университете Мичигана. Наша работа Морфология и анализ изображений Основные научно-исследовательского Мичиган Диабет и учебный центр, финансируемый Национальным институтом здоровья Грант 5P90 DK-20572 от Национального института диабета, желудочно-кишечных и почечных заболеваний. Авторы хотели бы поблагодарить Робинсон Синглтон и Гордон Смит (Университет штата Юта) за их щедрое пожертвование образцы кожи человека для поддержки первоначального развития ноцицептивной технику иммуногистохимию биомаркеров.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10X PBSFisher ScientificBP399-4To make up 1X PBS
Image-IT FX SignalInvitrogenI36933Image-IT
Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit)AbD Serotec7863-0504PGP
Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat)R&D SystemsAF1056Trk A
Alexa Fluor 488 donkey α-rabbitInvitrogenA21206AF488 donkey α-goat
Alexa Fluor 647 donkey α-goatInvitrogenA21447AF647 donkey α-goat
Albumin, from Bovine SerumSigma-AldrichA7906-100BSA
Triton X- 100Sigma-AldrichT9284TX-100
Non-calibrated LoopLeLoopMP 199025inoculating Loop
96-well assay plateCorning Incorporated3603Well plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPIInvitrogenP36931DAPI
Microscope Cover Glass 22x22 mmFisher Scientific12-541-BCoverslips
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15Microscope Slides
Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal MicroscopeOlympusFV500Confocal Microscope
Optimum Cutting TemperatureSakura4583OCT
Leica cryostatLeicaCM1850Cryostat

Ссылки

  1. Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  2. Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).
  3. McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).
  4. Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies. Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).
  5. Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes. Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).
  6. Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).
  7. Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies. Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).
  8. Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation. J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).
  9. Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin. Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).
  10. Lauria, G., Morbin, M., et al. Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies. J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).
  11. Penna, G., Fibbi, B., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  12. Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  13. Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy. Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).
  14. Lauria, G. Small fibre neuropathies. Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).
  15. Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes. Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).
  16. Lauria, G., Morbin, M., et al. Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies. Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).
  17. Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy. Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).
  18. Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

74IENFD

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены