L'imagerie tridimensionnelle de nociceptifs fibres nerveuses intra-épidermiques dans des biopsies de peau humaine

Résumé

Afin d'étudier les changements de fibres nerveuses nociceptives (intraépidermiques IENFs) dans les neuropathies douloureuses (PN), nous avons développé des protocoles qui pourraient examiner directement les modifications morphologiques tridimensionnels observés dans IENFs nociceptifs. Analyse tridimensionnelle de IENFs a le potentiel d'évaluer les changements morphologiques des IENF en PN.

Résumé

Une biopsie de la peau est couramment utilisé pour quantifier la densité des fibres nerveuses intraépidermiques (IENFD) pour le diagnostic de neuropathie périphérique ^1,2. À l'heure actuelle, il est de pratique courante de collecter 3 biopsies cutanées mm de la jambe distale (DL) et la cuisse proximale (PT) pour l'évaluation des polyneuropathies dépendant de la longueur ^3. Toutefois, en raison de la nature multidirectionnelle de IENFs, il est difficile d'examiner chevauchement structures nerveuses à travers l'analyse de l'imagerie en deux dimensions (2D). Alternativement, l'imagerie en trois dimensions (3D) pourrait fournir une meilleure solution à ce dilemme.

Dans le présent rapport, nous présentons les méthodes d'application de l'imagerie 3D pour étudier neuropathie douloureuse (PN). Afin d'identifier IENFs, des échantillons de peau sont traités pour l'analyse d'immunofluorescence d'un produit de gène de la protéine 9.5 (PGP), un marqueur neuronal casserole. À l'heure actuelle, il est de pratique courante pour diagnostiquer petits neuropathies de fibres en utilisant IENFD dissuaderminées par PGP immunohistochimie en utilisant la microscopie en fond clair ^4. Dans la présente étude, nous avons appliqué double analyse d'immunofluorescence pour identifier IENFD totale, en utilisant PGP, et IENF nociceptive, grâce à l'utilisation d'anticorps qui reconnaissent la tropomyosine-récepteur-kinase A, le récepteur (Trk A) une forte affinité pour le facteur de croissance nerveuse ^5. Les avantages de IENF co-marquage avec PGP et Trk anticorps de prestations de l'étude des PN par coloration clairement fibres PGP-positives, nociceptifs. Ces signaux de fluorescence peuvent être quantifiés pour déterminer les changements IENFD et morphologiques nociceptifs de IENF associés à PN. Les images fluorescentes sont acquises par microscopie confocale et traitées pour l'analyse 3D. 3D-imagerie fournit des capacités de rotation pour analyser plus avant les modifications morphologiques associées à PN. Pris dans leur ensemble, fluorescent co-marquage, l'imagerie confocale et l'analyse 3D bénéficient clairement de l'étude des PN.

Introduction

À l'heure actuelle, il est de pratique courante pour les médecins de quantifier la densité des fibres nerveuses intra-épidermique (IENFD) à partir de biopsies de peau poinçon, qui peuvent être utilisés pour diagnostiquer les petits neuropathies de fibres ^{3, 6-8.} Les biopsies sont prises à partir de la jambe distale (DL), 10 cm au-dessus de la malléole externe, et la cuisse proximale (PT), 20 cm en dessous du épine iliaque antérieure ^9. Tous IENF sont marquées d'utiliser le produit de gène de la protéine 9.5 (PGP), un marqueur neuronal pan ^10-12. À l'heure actuelle, il est de pratique courante pour diagnostiquer petits neuropathies de fibres en utilisant IENFD déterminé par coloration avec PGP brightfield microscopie ^6. En outre, plusieurs groupes de recherche ont utilisé des protocoles d'immunofluorescence pour PGP immunohistochimie ^7-9. Neuropathie des petites fibres est souvent associée à la douleur neuropathique. Afin de mieux comprendre le rôle de IENF indispensables pour le traitement de la douleur, nous avons développé une technique de co-label IENF totale avec des fibres qui génèrent des douleurs. Nociceptive IENF, spécifiquement Aδ et les fibres de carbone, peuvent être étudiés à travers le co-marquage de IENF avec PGP et le marqueur nociceptive, tropomyosin-récepteur-kinase A (Trk A) ^5. Trk A est le récepteur de haute affinité pour le facteur de croissance du tissu nerveux qui est essentiel pour le développement de la nociception. Les fibres nerveuses nociceptives A-positifs sont des fibres Trk peptidergiques qui expriment la substance P (SP) et la calcitonine de peptide lié au gène de (CGRP). Auparavant, Lauria et ses collègues ont appliqué la technique du double étiquetage pour étudier PN, co-marquage IENF PGP-positif avec un marqueur nociceptive ^10. Dans notre précédente étude, nous avons démontré que Trk IENF A-positif, mais pas Trk IENF A-négatif, ont été régulés à la hausse dans un modèle animal de la neuropathie diabétique douloureuse ^5. Cette technique de co-marquage permet de comparer la quantification des IENFD nociceptive au total IENFD et la possibilité d'étudier les changements morphologiques associés à PN. La capacité de visualiser nociceptive IENF et sociétésre quantification de IENFD total à IENFD nociceptive pourrait fournir une preuve objective de la présence de la douleur, et peut-être un aperçu de la gravité de la douleur associée à la PN. Cette technique est également applicable à la peau des modèles animaux. En comparaison avec les études précédentes, le protocole actuel décrit les méthodes d'analyse d'image 3D, créant la possibilité d'éviter des erreurs qui pourraient se produire dans l'analyse d'images 2D.

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Protocole

Partie A: immunohistochimie

Préparation de la plaque de 96 puits et la prévention de fond coloration biopsies de peau sont recueillies auprès de sujets humains et incubé pendant 12-24 heures dans la solution de fixation (paraformaldéhyde à 2% avec une solution de L-lysine 0,75 M (pH 7,4) et 0,05 mM periodate de sodium) à 4 ° C comme précédemment décrit ^8. Les échantillons sont ensuite cryoprotégés en phosphate salin (PBS) tamponné avec 20% de glycérol à 4 ° C pendant 1 semaine, ancrée dans les milieux de montage de la température de coupe optimale (OCT), puis découpé en 50 sections um d'épaisseur sur un cryostat. Le protocole décrit ci-dessous est destiné à huit coupes de peau, le nombre maximal de coupes de peau possible de subir immunohistochimie flottant librement dans une plaque à 96 puits.

JOUR 1:

1. Prévention des Immunoréactivité non spécifique dans le stratum corneum

1. Étiquette plaque 96 ainsi que le montre la figure 1.
2. Ajouter 150 pi de Image-IT FX Signal (Image-IT), efficace pour bloquer la coloration de fond ^11,12, dans chaque puits dans la rangée 1 de la plaque de 96 puits.
3. Ajouter 150 pi de PBS 1X dans chaque puits dans la rangée 2 et 3 de la plaque de 96 puits.
4. L'acquisition de deux sections de 50 um par patient: une section de la biopsie prise à DL, une section de la biopsie prise à PT. Une anse (LeLoop) est utilisé pour transférer des sections d'un rinçage à l'autre pour éviter d'endommager morphologique. Transférer délicatement chaque section de 50 um, en utilisant une anse, dans un puits individuel de rang 1, contenant l'image-IT. Incuber les coupes dans l'image-IT pendant 30 min à température ambiante sur un rocker plat.
5. Rincer sections deux fois avec du PBS 1X (lignes 2 et 3) pendant 10 min à température ambiante. Placer la plaque et sur un rocker plat entre rinçages.

2. Préparation de 5% de BSA Solution de blocage et 1% solution de rinçage

1. Alors que des coupes de biopsies sont en incubation dans Image-IT, préparer 5% blocage solutiontion (5% de BSA, 0,3%-100 TX, 0,1 M solution PBS-BSA Vortex jusqu'à dissolution complète).
2. Ajouter 150 pi de solution de blocage de BSA 5% dans chaque puits de la rangée 4.
3. En utilisant une anse, transférer sections dans des puits individuels d'une solution de blocage de 5% de BSA. Incuber les coupes dans une solution de blocage de BSA 5% pendant 1-2 heures à la température ambiante sur une bascule plat.

3. Préparation de 1% de BSA solution de rinçage et la dilution des anticorps primaires

1. Tandis que les sections sont en incubation dans une solution de blocage de 5% de BSA, préparer une solution de rinçage de 1% (1% de BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M solution PBS-BSA Vortex jusqu'à dissolution complète).
2. Tandis que les sections sont en incubation dans une solution de blocage de 5% de BSA, diluer anticorps primaires dans 1% solution de rinçage.
   1. Pendant huit sections (8 x 150 pi = 1,200 pi), un total de 1.200 pi est nécessaire. Les anticorps primaires sont constitués en 1500 pl (sur un volume supplémentaire de 20%).
   2. Les dilutions des anticorps primaires: PGP, 1:500; Trk A,1:500 à 1% de BSA solution de rinçage.

4. L'incubation des biopsies sectionné Anticorps primaire

1. Ajouter 150 ul d'anticorps primaires dilués dans les puits désignés de la plaque de 96 puits (ligne 5).
2. Transfert sections de solution de blocage de 5% (Ligne 4) dans les puits d'anticorps primaires désignées (ligne 5).
3. Sceller la plaque de 96 puits avec du parafilm et du papier d'aluminium pour éviter le dessèchement et exposition à la lumière.
4. Incuber la plaque à 96 puits O / N à 4 ° C sur une bascule plat.

JOUR 2:

5. Rincer biopsies dans 1% BSA solution de rinçage

1. Ajouter 150 pi de solution de rinçage de BSA 1% dans chaque puits dans la rangée 6, 7 et 8.
2. Rincer sections trois fois avec une solution de rinçage de BSA à 1% (lignes 6, 7 et 8) pendant 1 heure à chaque fois à température ambiante. Couvrir la plaque et de papier d'aluminium et placer sur rocker plat entre rinçages.

6. La dilution des anticorps secondaires

1. Tandis que les sections sont incubés dans le dernier rinçage de solution de rinçage de BSA à 1% (Ligne 8), diluer Anticorps secondaires dans la solution de rinçage BSA à 1%:
   1. Pendant huit sections (8 x 150 pi = 1,200 pi), un total de 1.200 pi est nécessaire. Les anticorps secondaires sont constitués en 1500 pl (sur un volume supplémentaire de 20%).
   2. Des dilutions des anticorps secondaires: pour PGP (Alexa Fluor 488 âne anti-lapin, 1:250), pour Trk A (Alexa Fluor 647 âne anti-chèvre, 1:250) dans une solution de rinçage de la BSA 1%.

7. L'incubation des biopsies sectionné Anticorps secondaires

1. Ajouter 150 ul d'anticorps secondaires dilués dans leurs puits désignés de la plaque de 96 puits (Ligne 9).
2. Transfert sections de solution à 1% de BSA blocage (Ligne 8) en anticorps secondaire bien (Ligne 9).
3. Sceller la plaque de 96 puits avec du parafilm et du papier d'aluminium pour éviter le dessèchement et exposition à la lumière.
4. Incuber les coupes dans l'anticorps secondaire désigné O/ N à 4 ° C sur une bascule plate.

8. Rincer biopsies dans 1% BSA solution de rinçage

1. Ajouter 150 pi de solution de rinçage de BSA 1% dans chaque puits dans la rangée 10, 11 et 12.
2. Rincer sections trois fois avec une solution de rinçage de BSA à 1% (lignes 10, 11, et 12) pendant 1 heure à chaque fois à température ambiante. Couvrir la plaque et de papier d'aluminium et placer sur un rocker plat entre rinçages.

9. Préparation des lames de microscope et de montage biopsies sectionnés

1. Alors que des coupes de biopsies sont en incubation dans la dernière eau de rinçage de la solution de rinçage BSA 1% (ligne 12), préparer des lames de microscope.
2. Placez 50 pi de 1% solution de rinçage BSA sur une diapositive à l'autre.
3. Supprimer des sections de 1% de solution de rinçage BSA (Ligne 12), et le placer dans la chute de 50 pi de solution de rinçage de BSA 1% sur la lame du microscope désigné. Après l'optimisation de la position de la section, enlever l'excès de solution de rinçage de BSA 1% avec une pipette en verre bulbe, en prenant des précautionspour éviter de toucher l'échantillon.

NOTE: Assurez-vous que la section ne soit pas plié; l'échantillon doit être à plat sur ​​la surface de la lame de microscope.

4. Placer 1 goutte d'or Prolongez antifade réactif montage avec DAPI près de la biopsie sur la lame du microscope. Jetez un microscope mm lamelle de verre 22x22 et placer délicatement sur une biopsie et une goutte de réactif Prolongez antifade or avec une chute DAPI. Répétez l'opération pour chaque section.
5. Laissez lames de microscope sec O / N à température ambiante dans l'obscurité.

NOTE: Retirer les bulles d'air à l'aide d'une pipette. Essuyez l'excès de prolonger réactif antifade d'or.

Partie B: imagerie confocale

10. Imagerie confocale

1. signaux de fluorescence de l'image en utilisant un Olympus FluoView 500 microscope confocal à balayage laser avec une immersion dans l'huile (1,3 NA) objectif et le zoom à deux reprises avec le logiciel version 5.0 de FluoView 40X.
2. Utilisation Alexa Fluor 488 et Alexa Fluor 647 pour exciter le 543-nm laser HeNe vert et le laser HeNe rouge 633 nm, respectivement. Le signal Alexa Fluor 488 est représentée par un aspect vert table de consultation (LUT) et l'Alexa Fluor 647 par une LUT rouge.
3. Définissez les ouvertures confocale pour chaque détecteur à 400 um à améliorer les signaux. Balayages séquentiels devraient être prises à une résolution de 1024 x 1024 pour maximiser la séparation du signal.
4. Capturer trois dimensions Z-série en utilisant 1,2 um d'intervalles z étape (basé sur l'unité de numérisation optimale calculée par le logiciel FluoView) avec Kalman moyenne (deux cadres).

Partie C: visualisation en trois dimensions et d'animation

11. Trois dimensions (3D) Visualisation et animation

1. Ouvrez des fichiers FluoView dans le logiciel Imaris x64 (version 7.3, Bitplane AG) pour visualiser les ensembles d'images 3D.
2. Réglez afficher au besoin pour améliorer le contraste du signal spécifique nerf.
3. Créer un surface de visualiser la limite dermo-épidermique. Utilisez l'outil de contour en mode DRAW pour dessiner la frontière.
4. Attribuez une surface semi-transparente à la frontière afin de voir les signaux fluorescents sous-jacents.
5. Capturer des images fixes des signaux de fluorescence 3D pour créer des images instantanées de l'animation 3D.
6. Utilisez la fonction d'animation pour créer un film en 3D. Les images peuvent être tournés de 360 degrés à plusieurs reprises de montrer chaque signal séparément et fusionnés (figures 2, 3 et 4). Réglez animation pour créer des films constitués de 200 images animées à 15 images par seconde. Enregistrez chaque film comme un fichier AVI brut.
7. Compresser le film AVI finale avec le logiciel VirtualDub (version 1.9.4).

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Résultats

Nous avons appliqué le protocole actuel pour étudier la morphologie des IENF dans PT et DL biopsies cutanées de patients atteints de PN. La peau, à partir de trois sujets, ont été recueillis à l'Université de l'Utah pour démontrer la pathomorphologie associé avec PN. Les sujets suivants: Cas 1: un homme de 51 ans avec une histoire de PN du diabète de type 2 (durée: 14 mois; score de douleur: 51); Cas 2: un homme de 56 ans avec une histoire de PN du diabète de type 2 (durée: 108 mois; score de doule...

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Discussion

Mesure de IENFD a été largement utilisé pour déterminer le degré de neuropathies périphériques ^13,14. À l'heure actuelle, le protocole le plus couramment utilisé ne mesure que les densités de fibres nerveuses qui traversent la membrane basale de l'épiderme, elle ne tient pas compte de branchement axonal et / ou les modifications morphologiques des nerfs. En outre, l'analyse IENFD actuelle n'a pas été montré une corrélation IENFD avec la présence de la douleur chez PN ^15.

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X PBS	Fisher Scientific	BP399-4	To make up 1X PBS
Image-IT FX Signal	Invitrogen	I36933	Image-IT
Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit)	AbD Serotec	7863-0504	PGP
Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat)	R&D Systems	AF1056	Trk A
Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit	Invitrogen	A21206	AF488 donkey α-goat
Alexa Fluor 647 donkey α-goat	Invitrogen	A21447	AF647 donkey α-goat
Albumin, from Bovine Serum	Sigma-Aldrich	A7906-100	BSA
Triton X- 100	Sigma-Aldrich	T9284	TX-100
Non-calibrated Loop	LeLoop	MP 199025	inoculating Loop
96-well assay plate	Corning Incorporated	3603	Well plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36931	DAPI
Microscope Cover Glass 22x22 mm	Fisher Scientific	12-541-B	Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Microscope Slides
Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	FV500	Confocal Microscope
Optimum Cutting Temperature	Sakura	4583	OCT
Leica cryostat	Leica	CM1850	Cryostat