人間の皮膚生検における侵害受容性表皮内神経線維の三次元イメージング

要約

痛みを伴う神経障害（PN）における侵害受容性表皮内神経線維（IENFs）の変化を調べるために、我々が直接侵害受容IENFsで観察された三次元形態学的変化を調べることができるプロトコルを開発した。 IENFsの三次元解析はPNでIENFの形態学的変化を評価するための可能性を秘めている。

要約

皮膚パンチ生検は、一般に周辺多発神経^1,2の診断のための表皮内神経線維密度（IENFD）を定量化するために使用される。現在のところ、遠位脚部（DL）と長さに依存する多発³の評価のための近位大腿（PT）からの3mm皮膚生検を採取するのが一般的である。しかし、IENFsの多方向性質のために、2次元（2D）イメージングの分析を通して神経構造を重複検査する困難である。あるいは、三次元（3D）画像化は、このジレンマのためのより良い解決策を提供することができる。

現在のレポートでは、痛みを伴う神経障害（PN）を研究するために3D画像を適用するための方法を提示する。 IENFsを識別するために、皮膚サンプルをタンパク質遺伝子産物9.5（PGP）、パンニューロンマーカーの免疫蛍光分析のために処理される。現在のところ、それはIENFDが阻止用いた小型光ファイバ神経障害を診断するための標準的な方法です明視野顕微鏡^4を使用してPGPの免疫組織化学によって採掘。現在の研究では、PGPを使用して、合計IENFDを識別するために二重免疫蛍光分析を適用し、侵害受容IENF、神経成長因子^5（TrkのA）、高親和性受容体トロポミオシン受容体キナーゼを認識する抗体を使用することによって。 PGPとTrkの抗体との共染色IENFの利点は明らかにPGP陽性、侵害受容繊維を染色することによって、PNの研究に利益をもたらす。これらの蛍光信号はPNと関連付けIENFの侵害IENFD及び形態学的変化を決定するために定量することができる。蛍光画像は、共焦点顕微鏡で取得し、3次元解析のために処理されます。 3Dイメージングは​​さらにPNに関連付けられている形態学的変化を分析するために、回転力を提供します。まとめると、蛍光共染色、共焦点イメージング、3次元解析が明らかにPNの研究に利益をもたらす。

概要

現在のところ、それは小さなファイバ神経障害^{、3つ6-8を}診断するために使用され得る皮膚パンチ生検から、表皮内神経線維密度、（IENFD）を定量化する医師にとって一般的である。生検は、遠位脚（DL）、外果より10センチメートル、および近位大腿（PT）、前腸骨棘⁹ 20以下CMから取得されます。すべてIENFは、タンパク質遺伝子産物9.5（PGP）、パン神経マーカー^10-12を使用してラベルが付いています。現在のところ、明視野顕微鏡⁶ PGP染色によって決定IENFD用いた小型光ファイバ神経障害を診断するための標準的な方法です。さらに、いくつかの研究グループは、PGP免疫組織化学^7-9用免疫のプロトコルを使用している。小さな繊維神経障害は、一般的に神経因性疼痛に関連付けられています。さらに、痛みの処理のために不可欠IENFの役割を理解するために、我々は、痛みを生成繊維で共標識合計IENFに技術を開発した。 NocicepTIVE IENFは、特にAδおよびC線維、PGPでIENFの共同ラベリングと侵害受容性マーカー、トロポミオシン受容体キナーゼ（Trkは^）5を通して研究することができる。ムーブ痛覚の開発に必須である神経成長因子に対する高親和性受容体である。 TrkはA陽性侵害受容神経線維はペプチド性繊維であることを明示サブスタンスP（SP）およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）。以前は、ラウリアらはPN、侵害受容性マーカー¹⁰との共同標識PGP陽性IENFを研究する二重標識法を適用した。我々の以前の研究では、我々はTrkの陽性IENFを実証しなく、Trkの陰性IENF、痛みを伴う糖尿病性神経障害⁵の動物モデルにおいてアップレギュレートされた。この共同標識法はIENFDとPNに関連付けられている形態学的変化を研究する能力を合計する侵害受容IENFDの定量化を比較する機能を提供します。侵害受容IENFとコンパを可視化する機能侵害IENFDにIENFD合計の定量化を再度客観的疼痛の存在の証拠、そしておそらくPNに伴う痛みの重症度に関する洞察を提供することができます。また、この手法は、動物モデルの皮膚に適用可能である。以前の研究と比較して、現在のプロトコルは、2D画像解析で発生するエラーを回避する機会を作成し、3次元画像解析のための方法が記載されている。

プロトコル

パート：免疫組織化学

バックグラウンド染色パンチ皮膚生検の96ウェルプレートおよび予防の作製は、ヒト被験体から採取し、固定液中で12〜24時間（2％113 M L-リジン溶液（pH7.4）中でホルムアルデヒドおよび0.05 mMの過ヨウ素酸ナトリウムなど）とインキュベートする。 4℃で前述したように^8。次いで、試料を取り付け、その後メディア最適な切削温度（OCT）、クライオスタットに厚さ50μmのセクションに区分に埋め込まれ、最大1週間のために4で20％グリセロール°Cとリン酸緩衝食塩水（PBS）で凍結保護されています。以下に説明するプロトコルは、8皮膚切片ワン96ウェルプレートに浮遊免疫組織化学を受けることが可能な皮膚切片の最大数に設計されている。

1日目：

1。角質層非特異免疫反応の防止

1. ラベル96ウェルプレート、 図1に示すように。
2. 画像-IT 96ウェルプレートの1行目の各ウェルにバックグラウンド染色^11,12を遮断するための効果的なFX信号（画像-IT）、150μlのを追加します。
3. 96ウェルプレートの2行目と3で各ウェルに1×PBSを150μlを加える。
4. DLで撮影生から1セクション、PTで取ら生から1セクション：患者ごとに2つの50μmのセクションを取得します。接種ループ（LeLoop）は形態的損傷を避けるために、次へのすすぎ1からセクションを転送するために使用されます。そっと画像-ITを含む、よく行1の個体に、接種ループを使用して、各50μmのセクションを転送します。フラットロッカーで室温で30分間画像-ITのセクションをインキュベートする。
5. 室温で10分間1X PBS（行2と3）で2回のセクションをすすぐ。リンスの間にフラットロッカーにウェルプレートを置きます。

2。 5％BSAブロッキング溶液と1％のリンス液の調製

1. 生検のセクションでは、画像-ITでインキュベートされていますが、ソリューションをブロック5％を準備る（5％BSAが完全に溶解するまでBSA、0.3％TX-100、0.1 M PBS-渦溶液）。
2. 4行目の各ウェルに5％BSAブロッキング溶液150μlのを追加します。
3. 接種ループを使用して、5％BSAブロッキング溶液の個々のウェル内にセクションを転送します。フラットロッカーで室温で1〜2時間で5％BSAブロッキング溶液内のセクションをインキュベートする。

3。一次抗体の1％BSAリンス液と希釈の調製

1. のセクションでは、5％BSAブロッキング溶液でインキュベートされていますが、1％のリンス液（1％BSA、0.3％TX-100、0.1 M PBS-渦解をBSAが完全に溶解するまで）をご用意。
2. のセクションでは、5％BSAブロッキング溶液でインキュベートされていますが、1％のリンス液に一次抗体を希釈。
   1. 8つのセクション（8×150μlを= 1,200μl）を、1,200μlの合計が必要です。一次抗体は1,500μL（約20％の余分なボリューム）で構成されています。
   2. 一次抗体の希釈：PGP、1:500; TrkのA、1％BSAリンス液で1:500。

4。一次抗体に区画検のインキュベーション

1. 96ウェルプレート（5行目）の指定されたウェルに希釈した一次抗体を150μlを加える。
2. 指定されたプライマリ抗体井戸（5行目）に5％ブロッキング溶液（行4）からセクションを転送します。
3. 乾燥および露光を避けるために、パラフィルム及びアルミ箔で96ウェルプレートを密封する。
4. フラットロッカーで96ウェルプレート4でO / N°Cをインキュベートする。

2日目：

5。 1％BSAリンス液で生検をすすぐ

1. 各行6でよく、図7、図8に1％BSAリンス液を150μlを加える。
2. RTで1時間たびに1％BSAリンス液（列6,7、および8）で切片を三回すすぎ。リンスの間にフラットロッカー上のアルミホイルと場所とのウェルプレートをカバーしています。

6。二次抗体の希釈

1. 1％BSAリンス液（行8）のすすぎセクションが最後でインキュベートされているが、1％BSA溶液でリンス二次抗体を希釈する。
   1. 8つのセクション（8×150μlを= 1,200μl）を、1,200μlの合計が必要です。二次抗体は1,500μL（約20％の余分なボリューム）で構成されています。
   2. 二次抗体の希釈液：1％BSAリンス液でTrkのA（アレクサフルーア647ロバ抗ヤギ、1:250）のためのPGP（アレクサフルーア488ロバ抗ウサギ、1:250）、のために。

7。二次抗体に区画検のインキュベーション

1. 96ウェルプレート（行9）の彼らの指定ウェルに希釈した二次抗体を150μlを加える。
2. よく二次抗体に1％BSAブロッキング溶液（行8）（行9）からセクションを転送します。
3. 乾燥および露光を避けるために、パラフィルム及びアルミ箔で96ウェルプレートを密封する。
4. 指定した二次抗体Oのセクションをインキュベート4℃/ N°フラットロッカー上のC。

8。 1％BSAリンス液で生検をすすぐ

1. 行10,11、および12の各ウェルに1％BSAリンス液を150μlを加える。
2. RTで1時間たびに1％BSAリンス液（列10,11、および12）で切片を三回すすぎ。リンスの間にフラットロッカー上のアルミホイルと場所とのウェルプレートをカバーしています。

9。顕微鏡スライドとマウント区分検の準備

1. 生検のセクションでは、1％BSAリンス液（行12）の最後のすすぎにインキュベートされていますが、顕微鏡スライドを準備します。
2. 一度スライドに1％BSAすすぎ溶液50μlを置きます。
3. 1％BSAリンス液（行12）からセクションを削除し、指定した顕微鏡スライド上の1％BSAリンス液50μlのドロップに配置します。セクションの位置を最適化した後、対策を講じて、球根のガラスピペットで余分な1％BSAリンス液を除去標本に触れないように。

注：セクションが折り返されていないことを確認し、試料が顕微鏡スライドの表面に平らにする必要があります。

4. 顕微鏡スライド上に生の近くにDAPIでゴールド退色マウンティング試薬を延長の代わりに1滴。 22x22のmmの顕微鏡カバーガラスを取り、優しく生と延長のドロップDAPIドロップゴールド退色防止剤の上に置きます。各セクションごとに繰り返します。
5. 暗闇の中で室温でO / N顕微鏡スライドが乾燥しましょう​​。

注：ピペットチップを使用して、任意の気泡を取り除きます。 Gold退色防止試薬を延長過剰拭き取り。

パートB：共焦点イメージング

10。共焦点像

1. FluoViewバージョン5.0ソフトウェアと40X油浸（1.3 NA）客観的かつズームで2回共焦点顕微鏡オリンパスFluoView 500レーザーを使用して画像蛍光シグナル。
2. それぞれ543 nmのヘリウムネオングリーンレーザーと633 nmのヘリウムネオン赤色レーザーを励起するためにアレクサフルーア488とアレクサフルーア647を使用してください。アレクサフルーア488信号が赤LUTによって緑見上げるテーブル（LUT）とアレクサフルーア647で表されます。
3. 信号を強化するためには400μmで、各検出器のための共焦点開口部を設定します。シーケンシャルスキャンは1,024×信号分離を最大化するために1,024の解像度で撮影する必要があります。
4. カルマンアベレージ（2フレーム）と1.2μmのZステップの間隔（FluoViewソフトウェアによって計算された最適なスキャンユニットに基づく）を使用して三次元のZシリーズをキャプチャします。

パートC：三次元可視化とアニメーション

11。 3次元（3D）可視化とアニメーション

1. 3D画像セットを可視化するImaris x64のソフトウェアで開くFluoviewファイル（バージョン7.3、ビットプレンAG）。
2. として神経特定の信号のコントラストを向上させるために必要な表示に調整します。
3. suコマンドを作成します。真皮表皮境界を可視化するためにデータポート。境界線を描画する描画モードで等高線ツールを使用します。
4. 基礎蛍光シグナルを見るために境界に半透明な表面を割り当てます。
5. 3D映画のスナップショットイメージを作成するために、3D蛍光シグナルの静止画をキャプチャします。
6. 3D映画を作成するためにアニメーション機能を使用します。画像（ 図2、図3、及び図4）別々にマージされた各信号を表示するために360度を数回回転させることができる。毎秒15フレームでアニメーション化された200のフレームで構成されるムービーを作成するためにアニメーションを設定します。生のAVIファイルとして各ムービーを保存します。
7. VirtualDubのソフトウェア（バージョン1.9.4）で最終AVIムービーを圧縮します。

結果

私たちは、PNの患者からPTとDL皮膚生検でIENFの形態を研究する現在のプロトコルを適用した。皮膚は、3名の被験者から、PNに関連付けられた病理形態を実証するためにユタ大学で集めた。被験者が含まれます：ケース1：2型糖尿病のPNの歴史（期間：14ヶ月、疼痛スコア：51）;と51歳の男性ケース2：PNの歴史を持つ56歳の男性をとケース3：2型糖尿病（期間：42ヶ月、疼痛スコア：46）のPNの歴史を...

ディスカッション

IENFDの測定は広く末梢神経障害^13,14の程度を決定するために使用されている。現時点では、最も一般的に使用されるプロトコルは、表皮の基底膜を貫通する神経線維の密度を測定し、それは考慮に軸索の分岐および/または神経の形態学的変化を取ることはありません。また、電流IENFD分析はPN ¹⁵の痛みの存在とIENFD相関することが示されていない。

我々は?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X PBS	Fisher Scientific	BP399-4	To make up 1X PBS
Image-IT FX Signal	Invitrogen	I36933	Image-IT
Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit)	AbD Serotec	7863-0504	PGP
Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat)	R&D Systems	AF1056	Trk A
Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit	Invitrogen	A21206	AF488 donkey α-goat
Alexa Fluor 647 donkey α-goat	Invitrogen	A21447	AF647 donkey α-goat
Albumin, from Bovine Serum	Sigma-Aldrich	A7906-100	BSA
Triton X- 100	Sigma-Aldrich	T9284	TX-100
Non-calibrated Loop	LeLoop	MP 199025	inoculating Loop
96-well assay plate	Corning Incorporated	3603	Well plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36931	DAPI
Microscope Cover Glass 22x22 mm	Fisher Scientific	12-541-B	Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Microscope Slides
Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	FV500	Confocal Microscope
Optimum Cutting Temperature	Sakura	4583	OCT
Leica cryostat	Leica	CM1850	Cryostat