Permanente oclusión vascular cerebral<em&gt; Vía</em&gt; Ligadura doble y transección

Resumen

Se describe un método altamente reproducible para la oclusión permanente de un vaso sanguíneo principal cerebral de roedor. Esta técnica se puede lograr con muy poco daño periférico, mínima pérdida de sangre, una alta tasa de supervivencia a largo plazo, y el volumen del infarto coherente acorde con la población clínica humana.

Resumen

El accidente cerebrovascular es la principal causa de muerte, discapacidad y pérdidas socioeconómicas en todo el mundo. La mayoría de todos los accidentes cerebrovasculares resultado de una interrupción en el flujo sanguíneo (isquemia) ^1. La arteria cerebral media (ACM) ofrece una gran mayoría de la sangre a la superficie lateral de la corteza ^2, es el sitio más común de accidente cerebrovascular humano ^3, y la isquemia dentro de su territorio puede resultar en la muerte o la disfunción extensa ^1,4,5. Los sobrevivientes de un accidente cerebrovascular isquémico menudo sufren pérdida o alteración de las capacidades motoras, déficit sensorial, e infarto. En un esfuerzo para capturar estas características clave de accidente cerebrovascular, y de este modo desarrollar un tratamiento eficaz, una gran cantidad de énfasis se pone sobre modelos animales de isquemia en MCA.

Aquí se presenta un método de oclusión permanente de un vaso sanguíneo superficie cortical. Vamos a presentar este método con un ejemplo de una oclusión de los vasos relevante que modela el tipo más común, la ubicación y outcome de la carrera humana, oclusión de la arteria cerebral media permanente (pMCAO). En este modelo, nos exponemos quirúrgicamente MCA en la rata adulta y, posteriormente, a través de ocluir doble ligadura y la sección transversal del recipiente. Este pMCAO bloquea la rama cortical proximal de la MCA, causando isquemia en todo el territorio de la MCA cortical, una gran porción de la corteza. Este método de oclusión también se puede utilizar para ocluir porciones más distales de los vasos corticales con el fin de lograr la isquemia focal más centradas en una región más pequeña de la corteza. Las desventajas principales de pMCAO son que el procedimiento quirúrgico es un poco invasivo ya que se requiere una pequeña craneotomía para acceder a MCA, aunque esto da como resultado un daño mínimo del tejido. Las principales ventajas de este modelo, sin embargo, son: el sitio de la oclusión está bien definido, el grado de reducción del flujo sanguíneo es coherente, funcional y deterioro neurológico se produce rápidamente, el tamaño del infarto es consistente, y la alta tasa de supervivencia permite a largo evaluación crónica plazo.

Introducción

Con el fin de inducir estados isquémicos que imitan efectivamente accidente cerebrovascular isquémico humano, varios modelos animales de accidente cerebrovascular se emplean ampliamente, con diferentes volúmenes de infarto resultantes. En el modelo de photothrombotic, el cerebro se irradia a través del cráneo intacto utilizando iluminación láser después de la inyección intravenosa de una sustancia fotosensible (por ejemplo, rosa de bengala-), lo que resulta en la coagulación fotoquímica, obstrucción de los vasos irradiados, y la isquemia en el tejido circundante ^{6, 7.} Photothrombosis puede resultar en regiones muy pequeñas, aisladas de infarto y se utiliza típicamente como un medio de modelado "mini derrames cerebrales", o "micro-accidentes cerebrovasculares".

La técnica más ampliamente adoptado para la inducción de accidente cerebrovascular isquémico, particularmente en la arteria cerebral media (ACM), es el modelo de monofilamento intraluminal ^8, en el que un filamento se introduce quirúrgicamente en la arteria carótida externa y se hace avanzar hasta que la punta ocluye la base de la MCA. A primary desafío de la oclusión filamento intraluminal es la alta tasa de mortalidad (70% cuando MCA está ocluida durante 3 horas, un punto de tiempo relevante para la investigación de accidentes cerebrovasculares) ^9. Otros problemas con el método incluyeron posible hemorragia subaracnoidea, la oclusión incompleta, y el volumen del infarto variable de ^10,11. Este modelo da como resultado un amplio grado de infarto tanto en la corteza y subcorticalmente ^12, y los modelos de un accidente cerebrovascular humana masiva.

Aunque tanto las micro y masiva modelos ictus son importantes, movimientos humanos son por lo general en algún punto intermedio. En grandes estudios clínicos, los rangos de tiempos de infarto de tamaño 28 a 80 cm ^3, que se traduce en 4,5 a 14% de la IPSI ishemic hemisferio ^9. En comparación, nuestros rata pMCAO el tamaño del infarto oscila entre aproximadamente 9-35 mm ^3, que constituye de 3 a 12% del hemisferio ipsilateral ishemic. Nuestro modelo pMCAO, por lo tanto, se asemeja mucho a los volúmenes de infarto con accidente cerebrovascular isquémico humanos por porcentaje de cerebrovolumen.

Además de modelar el daño estructural de accidente cerebrovascular, los resultados pMCAO en déficits funcionales y de comportamiento similares a la condición humana. Como mínimo, un modelo eficaz de los resultados de accidente cerebrovascular en trastornos del movimiento contralateral a daño por apoplejía ^13-15, pérdida o alteración de la función motora y sensorial ^16,17, pérdida o alteración de la actividad neuronal evocada ^16,18, reducciones en el flujo sanguíneo cerebral ^{19, 20,} e infarto ^21,22. Por consiguiente, nuestros modelos pMCAO una oclusión de la MCA grave resulta en una discapacidad física, pérdida de la función dentro de la corteza sensorial (y cortezas vecinos), la interrupción de la actividad neuronal, una severa reducción en el flujo sanguíneo MCA, y los atributos del infarto-sello de accidente cerebrovascular isquémico ^{23 -25,} por lo tanto, servir como un modelo efectivo de apoplejía humana.

Procedimiento, pMCAO implica una pequeña craneotomía en la que nos retiramos con cuidado el cráneo y la duramadreun x mm "ventana quirúrgica" 2 2 sobre el segmento inicial (M1) de la MCA, justo antes de la bifurcación primaria de la MCA en las ramas corticales anteriores y posteriores (Figuras 1A y 1B). Pasamos la mitad de la curva inversa de corte aguja e hilo de sutura (seda 6-0) a través de la capa pial de las meninges, por debajo de MCA y sobre la superficie cortical (véase la tabla de reactivos y equipos específicos para los suministros quirúrgicos necesarios para llevar a cabo pMCAO ). Luego atamos una doble ligadura, apriete los dos nudos alrededor de MCA, y seccionar el vaso entre los dos nudos. El doble ligadura y corte transversal a través de M1 se produce justo distal a la bifurcación lenticuloestriadas, de tal manera que sólo las ramas corticales de MCA son afectados-por lo tanto sólo de infarto cortical (sin daño subcortical) se produce ^26,27 (Figura 2). Aunque derrame cerebral humana a menudo implica infarto subcortical, modelar esto en roedores requiere aumento de la invasividad (ocluir los vasos cerebrales antes de la cortical Branching arterias requiere el acceso a través de la arteria carótida en el cuello y requiere oclusiones adicionales) y en la técnica de aumento de la variabilidad en el tamaño del infarto. El modelo descrito aquí no se puede realizar más proximalmente como el acceso a las ramas anteriores de la MCA no es posible a través de una simple craneotomía. Si bien puede ser posible inducir quirúrgicamente un infarto subcortical a través de pMCAO, oclusión implicaría un procedimiento muy invasivo y por lo tanto no es lo ideal.

Eficacia de la oclusión puede ser confirmado a través de láser Doppler, o láser speckle imágenes ^12,24,25 (Figura 3), o histológicamente post mortem (Figura 2). Cabe señalar que la investigación anterior ha demostrado que la estimulación sensorial puede desempeñar un papel importante en la evolución y el resultado de infarto; conferir protección contra el daño cuando se administra dentro de 2 h de pMCAO y causando un aumento en el daño por apoplejía cuando se administra a las 3 horas después de la pMCAO ^24,25,28. Hemos confirmado que a las 5 horas después de la pMCAO, la estimulación ya no tiene un efecto sobre el resultado (datos no publicados). Por lo tanto, la estimulación sensorial de los sujetos debe minimizarse durante 5 horas tras pMCAO obtener volúmenes de infarto con una variabilidad mínima. En consecuencia, nuestro grupo se ejecuta "controles no tratados" de este tipo, manteniendo las ratas anestesiadas durante 5 horas después de la pMCAO, en la oscuridad, con la estimulación sensorial mínimo, y expresamente sin estimulación bigote.

Cabe señalar además que la variación ocasional en la estructura de la MCA, incluyendo excesiva ramificación, múltiples segmentos primarios, o la ausencia de arterias comunicantes puede ocurrir a una frecuencia de 10 a 30% en adultos varones de ratas Sprague Dawley ^29,30. Si se observan anomalías en el MCA, se aconseja no utilizar este tema en particular como la adición de los animales con tales anomalías vasculares aumentará la variabilidad del infarto.

Además, hay varios aspectos prácticos de la oprocedimiento de ur que hacen que este método de oclusión ventajosa para la investigación apoplejía. En primer lugar, las suturas pueden ser colocados alrededor de la arteria, pero no apretados con el fin de recoger una evaluación de línea base, seguido de evaluación post-isquémica después de la ligadura y corte transversal. De esta manera, la preparación quirúrgica necesaria para la oclusión se controla eficazmente para, dentro de los sujetos. Debido a que los sujetos pueden permanecen estacionarios o dentro de un marco estereotáxico lo largo de la oclusión, es posible llevar a cabo la evaluación experimental de cada sujeto antes de, durante, y después de la oclusión sin mover el objeto o molestar a cualquier equipo experimental en uso ^25,28. Además, este procedimiento da como resultado una tasa de mortalidad muy baja, incluso dentro de los sujetos de roedores envejecidos 21-24 meses de edad (equivalente a un ser humano de edad avanzada) ^31, y por lo tanto pueden ser utilizados para evaluar los tratamientos con accidente cerebrovascular en ratas que más de cerca modelar los más comunes grupo de edad de los enfermos de ictus ^25,28. Vessel transection También sirve para varios propósitos prácticos. La ausencia de sangrado después de la transección confirma que el vaso se ocluye completamente en ambos sitios de ligadura. Además, la transección asegura una interrupción permanente de flujo sanguíneo. Por último, la transección asegura que cualquier flujo de sangre detectado en las porciones distales del vaso ocluido debe provenir de una fuente alternativa.

Por último, aunque se describe específicamente esta técnica de oclusión de la MCA en este manuscrito y de vídeo, la misma técnica transección doble ligadura se puede aplicar a cualquier vaso cerebral que se puede acceder a través de craneotomía. Nuestro laboratorio, por ejemplo, utiliza pMCAO en conjunción con varias oclusiones permanentes adicionales de MCA ramas distales con el fin de bloquear tanto primaria, y el flujo sanguíneo secundario ²⁴ de una manera similar a la de técnicas diseñadas para inducir selectivamente la isquemia dentro de la corteza somatosensorial primaria ^32.

En conclusión, tsu método para la oclusión permanente tal como se aplica a MCA modela estrechamente tres facetas principales de accidente cerebrovascular isquémico en humanos: la ubicación más común (MCA), tipo (isquemia), y el grado de daño (infarto) asociado con la literatura clínica humana de accidente cerebrovascular. Además, este método de oclusión se puede aplicar a uno o varios sitios de oclusión en todo el cerebro, y puede llevarse a cabo en sujetos de edad con una alta tasa de supervivencia. Dado el carácter dinámico y permanente, y relativamente no invasivo de esta oclusión, esta técnica representa una herramienta adicional a los investigadores preclínicos evalúan nuevos enfoques para la protección y tratamiento del ictus.

Protocolo

1. Primeros pasos: Instrumentos quirúrgicos requeridos

Vea la Figura 4

1. Taladro dental (Kavo Dental Equipment, modelo: UMXL-TM), taladro de 2 bits, y un taladro de 3 bits
2. Dos agujas hipodérmicas de calibre 30 ~
3. Serrated pinzas, punta curvada opcional (puede ser útil, pero no esencial)
4. Dos pinzas de punta fina
5. cortador de alambre
6. Hilo de sutura
7. Micro tijeras

2. Creación de la ventana quirúrgica

1. Anestesia: Los procedimientos están en conformidad con las directrices del NIH y han sido aprobados por la UC Irvine Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Los sujetos experimentales son 295 a 400 g de ratas macho Sprague Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, EE.UU.) y el siguiente procedimiento de anestesia se debe utilizar:
   1. Se inyecta por vía intraperitoneal rata con un bolo de pentobarbital sódico (55 mg / kg de peso corporal) seguido por una inyección intramuscular de atropina (0,05 mg / kg, de peso corporal) en el hind pierna, y se administró 3,0 cc de 5% de dextrosa en agua por vía subcutánea.
   2. Suplemento pentobarbital de sodio (27,5 mg / kg, de peso corporal) inyecciones como sea necesario. Administrar una pomada antibiótica oftálmica para los ojos para proteger las córneas durante los procedimientos siguientes. Administrar dextrosa al 5% (3 ml) y atropina (0,05 mg / kg, de peso corporal) cada seis horas disminuyen las secreciones respiratorias durante la anestesia. Medida de la temperatura del cuerpo a través de una sonda rectal, y mantener la temperatura corporal a 37 º C mediante una manta térmica auto-regulación.
2. Busque la MCA ya sea por:
   1. Adelgazamiento de 2 x 2 mm de imagen / visualización de la ventana sobre la corteza somatosensorial con un tamaño de 3 HP broca hasta que el cráneo es casi transparente y adelgazamiento de la plena transparencia con un tamaño de 2 HP broca. Ubicación de la MCA a continuación, puede verse a través de esta ventana y su trayectoria proximal se utiliza para aproximar la ubicación del segmento inicial. MCA funcionarán generalmente en diagonal a través de esteventana en una rostral a caudal / ventral a la dirección dorsal (por ejemplo, a la izquierda a la inferior derecha / arriba cuando vea hemisferio izquierdo desde el punto de vista del cirujano). La ventana quirúrgica a continuación, se puede crear por encima de donde el observador estima el segmento M1 (proximal a cortical ramificación) que se encuentra sobre la base de las ramas distales visibles a través de la primera ventana. Con el fin de reducir al mínimo la cantidad de cráneo que se retira con el fin de obtener acceso a MCA, la ventana de proyección de imagen / visualización debe colocarse cerca de, pero separada de la ventana quirúrgica.
      O
   2. Una pequeña ventana quirúrgica debe colocarse aproximadamente 3 mm por delante y 1 mm lateral a la foramen oval o el nervio mandibular, cerca de la tribuna arco ^30,33,34. Con el fin de acceder efectivamente el vástago de la MCA (también conocida como el segmento M1), el músculo temporal se refleja temporalmente lejos de la superficie del cráneo. (Nota: En el caso de las cirugías de supervivencia a largo plazo, la experiencia de nuestro laboratorio ha sido that al permitir que el músculo temporal para permanecer unido en su ancla, el músculo se vuelva a hibridar con la superficie del cráneo, lo que permite para el comportamiento de alimentación saludable y el mantenimiento eficaz de peso corporal.
3. Siga MCA a la esquina ventral rostral de la ventana de la imagen (si se utiliza como una referencia) con el fin de estimar dónde está su rama cortical inicial.
4. Crear una nueva región cráneo-delgada (nos referimos a esto como la ventana quirúrgica) ligeramente rostral y ventral a la ventana de la imagen (si se utiliza como una referencia) en el segmento M1 (pre-cortical ramificación) de MCA debe ser. NOTA IMPORTANTE: Deje aproximadamente un hueco de 2 mm entre la ventana de la imagen (si se utiliza como una referencia) y la ventana quirúrgica.
5. Localizar el tallo de la MCA (también conocida como el segmento M1) justo antes de ramificación cortical de la arteria como se muestra en las Figuras 1A y 1B.
6. Con un tamaño de HP-3 broca delgada del cráneo por encima de la ubicación del segmento M1 estimado. Cuando elcráneo se convierte en algo transparente, cambie el tamaño más delicado bits HP-2 taladro y delgada del cráneo hasta que sea completamente transparente. Confirmar visualmente como área de la ventana quirúrgica se vuelve lo suficientemente delgada para ver la vasculatura, y evaluar la ubicación de M1 en este punto y completar la ventana de tal manera que no es de 2-3 mm a cada lado de la longitud del segmento M1 (esto permite espacio para la inserción y salida de la aguja de sutura a cada lado de la MCA).

NOTA IMPORTANTE: detener el adelgazamiento cuando el espesor del cráneo es similar a la de una envoltura de plástico. El recipiente se romperá si el taladro se rompe a través del cráneo y la duramadre. Si el cráneo no es lo suficientemente delgada como en el otro lado, para la eliminación de la oclusión será difícil y puede provocar daños a la corteza o arteria.

7. Tome una de calibre 30 (30 G) aguja hipodérmica y doblar la punta de la aguja, usando unas pinzas dentadas.
8. Utilice la aguja de 30 G para perforar el cráneo cuidadoplenamente en una zona no directamente encima de una arteria. Utilice este orificio de punción para permitir pinzas para sujetar el cráneo y retirar con cuidado la zona adelgazada de la ventana quirúrgica.
9. Tome una nueva 30 G necesidad, doble la punta como en el paso 6, y retirar con cuidado la duramadre.

NOTA: Cortar la duramadre hará que se desprenda y MCA se hará más prominente, como resultado de la presión reducida.

3. Oclusión de la MCA

1. Use cortadores de alambre para cortar un corte de aguja de sutura (ronda 3/8, 16 mm aguja de sutura) hacia abajo hasta aproximadamente 3-5 mm inversa medio de la curva.
2. Enrosque la aguja de sutura recortada, como se muestra en la imagen de la figura 4E. NOTA IMPORTANTE: Es importante que la aguja se enhebra por lo que ambos extremos del hilo de sutura son de longitud equivalente. Esto permite que el hilo tirando de ambos extremos bajo M1, al mismo tiempo, la aguja se puede cortar entonces libre de salir de dos longitudes de hilo para atar los dos nudos alrededor de la MCA.
3. Utilice la sierra de las pinzas deslice la aguja de sutura bajo M1. Inserte con aproximadamente 0,5-1 mm de distancia de la CRM, quedando como poco profunda como sea posible a fin de minimizar el daño a la corteza, pero evitando demasiada tensión en MCA así.
4. Cuando la aguja de sutura sale por el otro lado de tal manera que se encuentra bajo la MCA, utilizar una pinza de punta fina (como se muestra a continuación) para tirar de la punta de la aguja de sutura desde el lado opuesto, mientras que la alimentación continua o empujar el otro extremo de la sutura aguja con la punta dentada pinzas.
5. Una vez que la aguja de sutura está completamente pasa por debajo de MCA y se ha extraído, continuar a tirar de la aguja de sutura o hilo hasta que la longitud de la rosca es igual a cada lado de la MCA. Presionar hacia abajo el hilo, ya que se alimenta a través de minimizar la tensión en MCA puede ser útil para evitar la ruptura como el hilo pasa por debajo de la arteria.
6. Corte el hilo cerca de la aguja de sutura.
7. Use las dos pinzas de punta fina para desenredar los dos hilos de sutura resultantes por lo que hay dos temas independientes encadenados bajo MCA que no se tocan. Lo ideal sería que los hilos serán de aproximadamente 1 mm entre sí en los que pasan por debajo de la MCA.
8. Use las dos pinzas de punta fina para atar dos nudos separados (dos ligaduras) con los hilos alrededor MCA tratan de mantener ese ~ 1 mm de espacio entre los nudos para dejar espacio para la transección.

NOTA: Si se desea un control interno simulado, preparar la oclusión dejando los nudos de oclusión sueltos para que no se contraen MCA en absoluto y recoger los datos antes de apretar los nudos y cortar el vaso. Corte el hilo para evitar que se enganche en cualquier cosa antes de la oclusión, pero dejan suficiente hilo para permitir el endurecimiento de los nudos más tarde. De esta manera, cualquier formación de imágenes de referencia o la recogida de datos se puede realizar con todos de la misma invasión quirúrgica como la oclusión y los nudos apretados en el punto de tiempo apropiado con poco retardo.

9. Una vez que los nudos han seres tensada, use las tijeras micro para seccionar M1 entre los dos nudos.
10. En el caso de los estudios, la supervivencia a largo plazo:
    1. Sutura incisión colgajo del cuero cabelludo en su lugar con hilo quirúrgico estéril o fijar el tejido con grapas para heridas estériles.
    2. Administrar antibióticos localmente en el área de la herida (tales como bacitracina pomada) y sistémicamente por inyección profiláctica de ampicilina (150 mg / kg IM).
    3. Mientras que el tema sigue siendo anestesiado administrar una pomada oftálmica antibiótica en los ojos.
    4. Administrar suplementario atropina (0,05 mg / kg IM) para reducir las secreciones respiratorias durante la anestesia.
    5. Inyectar flunixina meglumina (1,1 mg / kg) por vía subcutánea en la conclusión de la cirugía y de nuevo a la mañana siguiente (~ 12 horas más tarde) para el control del dolor.
    6. Coloque el animal sobre una superficie seca, caliente, inclinada de manera que la nariz de los animales está por encima de la cola en la pendiente (esto facilita la respiración hasta que el animal está despierto).
    7. Monitorear el animal hasta que esté despierto y en movimiento de forma segura en su propia.
    8. Una vez que el animal está de vuelta en el vivero, la actividad del animal, la apariencia, la vocalización, y la alimentación y la bebida comportamiento debe ser revisado diariamente.

4. Eutanasia

1. A la conclusión de cada experimento, las ratas deben ser sacrificados con pentobarbital de sodio (2-3 ml, por vía intraperitoneal).

Resultados

Oclusión exitosa de un buque puede confirmarse mediante láser speckle imágenes (LSI), entre otras técnicas de imagen de flujo sanguíneo. El flujo de sangre en las principales ramas corticales de MCA debe caer a ~ 25% de la línea de base o menos siguiente oclusión en función del nivel de ruido en el sistema de grabación y la sensibilidad de la técnica. Ver la Figura 3 para una imagen representativa LSI de un segmento de una rama cortical del MCA antes y después de oclusión de...

Discusión

Este protocolo fue desarrollado con el fin de inducir isquemia dentro de la corteza de roedores, y hacerlo con un mínimo impacto periférico a los sujetos experimentales. El doble oclusión y transección método permite la confirmación visual de que el buque ha sido ocluida de forma permanente, y se pueden realizar sin invasión excesiva o daños en los tejidos, y con una alta tasa de supervivencia. Este protocolo de oclusión puede ser aplicada a cualquier recipiente de cortical que se puede acceder a través de cra...

Materiales

Name of the equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Extra Fine Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Slight Curve (1)	Fine Science Tools	11151-10
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2)	Fine Science Tools	11252-50
Extra Fine Bonn Scissors, straight (1)	Fine Science Tools	14084-08
Round 3/8 (16 mm) Suture Needles	Fine Science Tools	12050-02
6-0 Braided Silk Suture	Fine Science Tools	NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461
30 gauge needle, ½" length	Fine Science Tools	NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL