Permanent occlusion des vaisseaux cérébraux<em&gt; Via</em&gt; Double ligature et Transection

Résumé

Nous décrivons une méthode hautement reproductible pour l'occlusion permanente d'un important vaisseau sanguin cérébral des rongeurs. Cette technique peut être accompli avec très peu de dommages périphérique, la perte de sang minime, un taux élevé de survie à long terme, et le volume de l'infarctus cohérent en rapport avec la population clinique humaine.

Résumé

L'AVC est une des principales causes de décès, d'invalidité et de perte socio-économiques dans le monde entier. La majorité de tous les AVC causé par une interruption de la circulation sanguine (ischémie) ^1. L'artère cérébrale moyenne (MCA) offre une grande majorité de sang à la surface latérale du cortex ^2, est le site le plus fréquent de l'homme course ^3, et de l'ischémie sur son territoire peut entraîner des dysfonctionnements large ou la mort ^1,4,5. Les survivants d'un AVC ischémique souffrent souvent la perte ou la perturbation des capacités motrices, déficits sensoriels, et l'infarctus. Dans un effort pour capturer ces caractéristiques clés de la course, et ainsi développer un traitement efficace, beaucoup d'accent est mis sur des modèles animaux d'ischémie à MCA.

Nous présentons ici une méthode d'occlusion permanente d'un vaisseau sanguin de la surface corticale. Nous allons présenter cette méthode en utilisant un exemple d'une occlusion du vaisseau pertinente qui modélise le type le plus commun, l'emplacement et outcome de la course humaine, l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne permanent (pMCAO). Dans ce modèle, nous exposons chirurgicalement MCA chez le rat adulte et obturer ensuite par un double ligature et la section transversale du navire. Cette pMCAO bloque la branche corticale proximale du MCA, provoquant une ischémie dans tous MCA territoire cortical, une grande partie du cortex. Cette méthode d'occlusion peut également être utilisé pour occlure des portions plus distales des vaisseaux corticaux pour obtenir une ischémie focale plus ciblant une région inférieure du cortex. Les principaux inconvénients de pMCAO sont que l'intervention chirurgicale est peu invasive comme une petite craniotomie est nécessaire pour accéder MCA, même si cela entraîne des lésions tissulaires minimes. Les principaux avantages de ce modèle, cependant, sont les suivants: le site de l'occlusion est bien définie, le degré de réduction du flux sanguin est cohérent, fonctionnel et neurologique dépréciation se produit rapidement, taille de l'infarctus est cohérent, et le taux élevé de survie permet de long évaluation chronique à long terme.

Introduction

Afin d'induire des conditions ischémiques qui imitent efficacement AVC ischémique humaine, plusieurs modèles de course d'animaux sont largement utilisés, avec des volumes d'infarctus résultant divers. Dans le modèle photothrombotic, le cerveau est irradiée à travers le crâne intact utilisant un éclairage laser après l'injection intraveineuse d'une substance photosensible (par exemple, de rose bengale), conduisant à la coagulation photochimique, l'obstruction des vaisseaux irradiées, et de l'ischémie dans le tissu environnant ^{6, 7.} Photothrombosis peut entraîner des très petites régions isolées de l'infarctus et est généralement utilisé comme un moyen de modélisation «mini-AVC», ou «micro-AVC».

La technique plus largement adoptée pour induire un AVC ischémique, en particulier dans l'artère cérébrale moyenne (MCA), est le modèle de monofilament intraluminal ^8, dans lequel un filament est introduit par voie chirurgicale dans l'artère carotide externe et s'avança jusqu'à la pointe obture la base du MCA. A primary défi de l'occlusion intraluminale de filament est le taux de mortalité élevé (70% lorsque MCA est obstruée pendant 3 heures, un point de temps pertinente pour les accidents vasculaires cérébraux) ^9. Autres problèmes avec la méthode incluses possible hémorragie méningée, occlusion incomplète, et le volume de l'infarctus variable de ^10,11. Ce modèle mène à un diplôme étendue de l'infarctus à la fois dans le cortex et subcortically ^12, et des modèles d'un accident vasculaire cérébral humain énorme.

Bien que les modèles à la fois micro et massive AVC sont importantes, coups droits sont généralement quelque part entre les deux. Dans les grandes études cliniques, le temps varie d'infarctus dans la taille 28 à 80 cm ^3, ce qui correspond à 4,5 à 14% de l'IPSI ishemic hémisphère ^9. En comparaison, nos rats pMCAO infarctus taille varie entre environ 9-35 mm ^3, ce qui constitue 3 à 12% de l'hémisphère IPSI ishemic. Notre modèle pMCAO, donc, ressemble étroitement volumes d'infarctus AVC ischémique humaines en pourcentage du cerveauvolume.

En plus de la modélisation des dommages structurels des accidents vasculaires cérébraux, les résultats pMCAO des déficits fonctionnels et comportementaux similaires à la condition humaine. Au minimum, un modèle efficace de résultats AVC chez les déficits de mouvement controlatéral à un accident vasculaire ^13-15, la perte ou la perturbation des fonctions motrices et sensorielles ^16,17, la perte ou la perturbation de l'activité neuronale évoquée ^16,18, réduction du débit sanguin cérébral ^{19, 20, 21,22} et infarctus. En conséquence, nos modèles pMCAO une occlusion grave de MCA entraînant une invalidité physique, la perte de fonction au sein du cortex sensoriel (et cortex voisins), la perturbation de l'activité neuronale, une forte réduction du débit sanguin MCA, et les attributs de l'infarctus cachet d'accident vasculaire cérébral ischémique ^{23 -25,} donc de servir comme un modèle efficace d'accident vasculaire cérébral humain.

Procédural, pMCAO implique une petite craniotomie dans lequel on enlève soigneusement le crâne et la dure deun x mm "fenêtre chirurgical" 2 2-dessus du segment initial (M1) de MCA, juste avant la bifurcation primaire de MCA dans les branches corticales antérieure et postérieure (figures 1A et 1B). Nous passons une demi-courbe inverse de coupe aiguille de suture et le fil (6-0 soie) à travers la couche pial des méninges, MCA-dessous et au-dessus de la surface corticale (voir le tableau de réactifs et d'équipements spécifiques pour les fournitures chirurgicales nécessaires pour mener à bien pMCAO ). Nous attachons donc une double ligature, serrez les deux noeuds autour de MCA, et sectionner le navire entre les deux nœuds. Le double ligature et résection par M1 commence juste en aval de la ramification lenticulostriées, de sorte que seules les branches corticales du MCA sont touchés-ainsi que l'infarctus cortical (aucun dégât sous-corticales) survient ^26,27 (Figure 2). Bien course humaine implique souvent des infarctus sous-corticaux, la modélisation de cette augmentation chez les rongeurs nécessite invasif (occlusion vaisseaux cérébraux avant cortical Branching nécessite artères accès via l'artère carotide dans le cou et nécessite occlusions supplémentaires) dans la technique et de la variabilité accrue dans taille de l'infarctus. Le modèle décrit ici ne peut être effectuée plus proximale que l'accès aux branches antérieures de MCA n'est pas possible via un simple craniotomie. Bien qu'il puisse être chirurgicalement possible d'induire un infarctus sous-corticaux via pMCAO, occlusion impliquerait une procédure extrêmement invasive et n'est donc pas idéal.

Efficacité de l'occlusion peut être confirmée par laser Doppler, ou granularité laser imagerie ^12,24,25 (Figure 3), ou histologique post-mortem (Figure 2). Il convient de noter que les recherches antérieures ont montré que la stimulation sensorielle peut jouer un rôle majeur dans l'évolution et l'issue de l'infarctus, conférant une protection contre les dommages lorsqu'il est administré dans les 2 heures de pMCAO et provoquant une augmentation des dommages course lorsqu'il est administré à 3 heures après pMCAO ^24,25,28. Nous avons confirmé que, à 5 h post-pMCAO, la stimulation n'a plus d'effet sur les résultats (données non publiées). Par conséquent, la stimulation sensorielle des sujets doit être minimisée pendant 5 heures après pMCAO pour obtenir volumes d'infarctus avec une variabilité minimale. En conséquence, notre groupe va «témoins non traités" de ce type en gardant rats anesthésiés pendant 5 heures post-pMCAO, dans l'obscurité, avec minimum de stimulation sensorielle, et expressément aucune stimulation des moustaches.

Il convient également de noter que la variation occasionnelle dans la structure MCA, y compris une ramification excessive, plusieurs segments primaires, ou de l'absence d'artères communicantes peut se produire à une fréquence de 10 à 30% chez les adultes mâles Sprague Dawley ^29,30. Si des anomalies sont observées MCA, il est conseillé de ne pas utiliser ce sujet particulier que l'ajout d'animaux avec de telles anomalies vasculaires va augmenter la variabilité infarctus.

En outre, il ya plusieurs aspects pratiques de l'our procédure qui rendent cette méthode d'occlusion avantageux pour enquête accident vasculaire cérébral. D'abord, les sutures peuvent être placées autour de l'artère, mais pas serrés afin de recueillir une évaluation de base, suivie par une évaluation post-ischémique après ligature et résection. De cette manière, la préparation chirurgicale nécessaire pour l'occlusion est effectivement contrôlé pour, au sein sujets. Parce que les sujets peuvent rester stationnaire ou dans un cadre stéréotaxique tout au long de l'occlusion, il est possible de procéder à une évaluation expérimentale de chaque sujet avant, pendant, et après occlusion sans déplacer l'objet ou de déranger l'équipement expérimental utilisé ^25,28. En outre, cette procédure aboutit à un taux de mortalité très faible, même à l'intérieur de rongeurs sujets âgés 21-24 mois (équivalent à un homme âgé) ^31, et peuvent donc être utilisés pour évaluer les traitements de l'AVC chez les rats qui modèle plus étroitement la plus courante tranche d'âge des personnes atteintes d'AVC ^25,28. Navire transection sert également plusieurs fins pratiques. L'absence de saignement après une section confirme que le navire a été complètement occulté dans les deux sites de ligature. En outre, transsection assure une interruption permanente de l'écoulement sanguin. Enfin, transsection garantit que tout le débit sanguin détectées dans les parties distales du vaisseau occlus doit provenir d'une autre source.

Enfin, bien que nous décrivons précisément cette technique d'occlusion pour le MCA dans ce manuscrit et de la vidéo, la même technique de résection double ligature peut être appliquée à n'importe quel vaisseau cérébral qui peut être accessible via une craniotomie. Notre laboratoire, par exemple, utilisé pMCAO en collaboration avec plusieurs occlusions permanents supplémentaires de branches MCA distales afin de bloquer à la fois primaire et garanties flux sanguin ²⁴ de manière à s'apparente aux techniques destinées à induire sélectivement l'ischémie dans le cortex somatosensoriel primaire ^32.

En conclusion, tsa méthode pour occlusion permanente appliquée à MCA modélise étroitement trois facettes primaire de l'AVC ischémique humain: la localisation la plus fréquente (MCA), le type (ischémie), et le degré de dommage (infarctus) associé à la littérature clinique humain de course. En outre, cette méthode d'occlusion peut être appliquée à des sites d'occlusion simples ou multiples dans le cerveau, et peut être effectuée chez les sujets âgés avec un taux élevé de survie. Compte tenu de la nature dynamique, permanente et relativement non invasive de cette occlusion, cette technique représente un outil supplémentaire pour les chercheurs précliniques évaluer de nouvelles approches pour la protection et de traitement de l'AVC.

Protocole

1. Mise en route: Obligation Instruments chirurgicaux

Voir Figure 4

1. Fraise dentaire (KaVo Dental Equipment, Modèle: UMXL-TM), 2-foret et foret 3-bit
2. Aiguilles hypodermiques Two ~ 30 gauge
3. Dentelé pincettes, courbé pointe en option (peut être utile mais pas indispensable)
4. Deux pinces à pointe fine
5. coupe-fil
6. fil de suture
7. Micro ciseaux

2. Création de la fenêtre chirurgicale

1. Anesthésie: Des procédures sont en conformité avec les directives du NIH et ont été approuvés par l'UC Irvine protection des animaux et le Comité d'utilisation. Sujets expérimentaux sont 295-400 g rats Sprague Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) et la procédure d'anesthésie suivant doit être utilisé:
   1. Injecter par voie intrapéritonéale chez le rat avec un bolus pentobarbital de sodium (55 mg / kg pc) suivie d'une injection intramusculaire d'atropine (0,05 mg / kg, pc) dans l'hind jambe, et administré 3,0 cc de dextrose à 5% dans l'eau sous-cutanée.
   2. Supplément pentobarbital de sodium (27,5 mg / kg, pc) injections si nécessaire. Administrer une pommade antibiotique ophtalmique aux yeux de protéger la cornée pendant les procédures suivantes. Administrer dextrose à 5% (3 ml) et de l'atropine (0,05 mg / kg, pc) toutes les six heures diminuent les sécrétions respiratoires pendant l'anesthésie. Mesurer la température du corps par l'intermédiaire d'une sonde rectale, et maintenir la température corporelle à 37 ° C par une couverture thermique auto-régulation.
2. Localisez le MCA soit:
   1. Dilution à 2 x 2 mm imagerie / visualisation fenêtre sur le cortex somatosensoriel utilisant une taille HP foret 3 jusqu'à ce que le crâne est presque transparent, puis éclaircie pour une transparence totale en utilisant une taille foret HP 2. L'emplacement de MCA peut alors être vu à travers la fenêtre et sa trajectoire proximale utilisé pour estimer l'emplacement du segment initial. MCA sera généralement courir en diagonale à travers cettefenêtre dans un rostre à caudale / ventral à dorsal direction (par exemple, de gauche à droite en bas / en haut lors de la visualisation hémisphère gauche du point de vue du chirurgien). La fenêtre chirurgical peut alors être créé au-dessus de laquelle l'observateur évalue le segment M1 (corticale proximale de branchement) pour être situé sur la base des branches distales visibles à travers la première fenêtre. Afin de minimiser la quantité de crâne qui est retiré afin d'accéder à MCA, le / la fenêtre de visualisation d'imagerie doit être positionné proche, mais distincte de la fenêtre chirurgicale.
      Ou
   2. Une petite fenêtre chirurgicale doit se situer environ 3 mm et 1 mm antérieure latérale pour le foramen ovale ou le nerf mandibulaire, à proximité de la tribune arc ^30,33,34. Pour accéder efficacement la tige de la MCA (aussi connu comme le segment M1), le muscle temporal se reflète temporairement loin de la surface du crâne. (Note: Dans le cas des chirurgies de survie à long terme, l'expérience de notre laboratoire a été that en permettant au muscle temporal à rester attaché à sa cheville, le muscle se re-recuit à la surface du crâne, ce qui permet à de saines habitudes alimentaires et l'entretien efficace de poids corporel.
3. Suivez MCA à l'angle rostral, ventrale de la fenêtre d'imagerie (si vous utilisez comme référence) afin d'estimer où sa branche corticale initiale réside.
4. Créer une nouvelle région mince crâne (nous nous référons à ce que la fenêtre chirurgicale) légèrement rostrale et ventrale à la fenêtre d'imagerie (si vous utilisez comme référence) où le segment M1 (pré-cortical ramification) de MCA devrait être. NOTE IMPORTANTE: Laissez environ un écart de 2 mm entre la fenêtre d'imagerie (si vous utilisez comme référence) et la fenêtre chirurgicale.
5. Repérez la tige de la MCA (aussi connu comme le segment M1) juste avant de bifurquer cortical de l'artère comme le montrent les figures 1A et 1B.
6. Utiliser une taille de foret HP-3, mince du crâne au-dessus de l'emplacement du segment M1 estimé. Lorsque l'crâne devient un peu transparent, passer à la taille plus délicat de bits HP-2 perceuse et mince du crâne jusqu'à ce qu'il soit complètement transparent. Confirmer visuellement que la zone de la fenêtre chirurgical devient suffisamment minces pour visualiser le système vasculaire, et d'évaluer la position de M1 au niveau de ce point et terminer la fenêtre de telle sorte qu'il est de 2-3 mm de part et d'autre de la longueur du segment M1 (ce qui permet l'insertion de pièces et la sortie de l'aiguille de suture sur chaque côté de MCA).

NOTE IMPORTANTE: arrêter l'amincissement lorsque l'épaisseur du crâne est similaire à celle de la pellicule plastique. Le navire se rompt si la perceuse perce le crâne et la dure. Si le crâne n'est pas assez mince, d'autre part, de le retirer pour l'occlusion sera difficile et peut entraîner des dommages au cortex ou une artère.

7. Prenez un calibre 30 (30 G) aiguille hypodermique et pliez la pointe de l'aiguille, en utilisant dentelé pincettes.
8. Utilisez l'aiguille de calibre 30 pour perforer le crâne de soins deentièrement dans une zone non directement au-dessus d'une artère. Utilisez ce trou de perforation pour permettre pince à épiler pour saisir crâne et retirer délicatement la zone amincie de la fenêtre chirurgicale.
9. Prendre un nouveau G 30 nécessité, plier sa pointe comme à l'étape 6, puis retirez soigneusement la dure-mère.

NOTE: Couper la dure-mère lui fera décoller et MCA va devenir plus important, en raison de la pression réduite.

3. Occlusion de l'ACM

1. Utilisez un coupe-fil pour couper une demi-courbe inverse coupe aiguille de suture (ronde 3/8, 16 mm aiguille de suture) à environ 3-5 mm.
2. Enfilez l'aiguille de suture recadrée comme le montre la photo à la figure 4E. NOTE IMPORTANTE: Il est important que l'aiguille est enfilée afin que les deux extrémités du fil de suture sont de longueur équivalente. Cela permet le tirage de deux bouts de fil sous M1 dans le même temps, l'aiguille peut ensuite être découpé libre laissant deux longueurs de fil pour attacher les deux noeuds autour de MCA.
3. Utilisation du dentelée la pincette glisser l'aiguille de suture sous M1. Insérez avec environ 0,5-1 mm distance de MCA, rester aussi basses que possible afin de minimiser les dommages au cortex, mais en évitant trop de pression sur MCA ainsi.
4. Lorsque l'aiguille de suture sort de l'autre côté de telle sorte qu'il est en cours de MCA, utiliser une pince à pointe fine (comme montré ci-dessous) pour tirer la pointe de l'aiguille de suture à partir du côté opposé, tout en continuant à alimenter ou pousser l'autre extrémité du fil de suture aiguille avec l'embout dentelé pincettes.
5. Une fois que l'aiguille de suture est complètement passée sous MCA et a été sorti, continuez à tirer sur l'aiguille de suture ou un fil jusqu'à ce que la longueur du fil est égale de chaque côté du MCA. En appuyant sur le fil comme il est alimenté par le biais de réduire la pression sur MCA peut être utile pour prévenir la rupture que le fil passe sous l'artère.
6. Couper le fil à proximité de l'aiguille de suture.
7. Utilisez les pinces à pointe fine pour démêler le fil de deux suture résultants de sorte qu'il ya deux threads indépendants enfilées sous MCA qui ne se touchent pas. Idéalement, les discussions seront d'environ 1 mm d'intervalle où ils passent sous MCA.
8. Utilisez les pinces à pointe fine pour attacher deux noeuds distincts (deux ligatures) avec les fils autour de MCA qui tentent d'affirmer que ~ 1 mm d'espace entre les noeuds pour permettre de place pour transsection.

NOTE: Si un simulacre de contrôle interne est souhaitée, préparer l'occlusion laissant les nœuds d'occlusion lâche de sorte qu'ils ne contractent MCA à tous et recueillir des données avant de serrer les noeuds et le découpage du navire. Couper le fil pour l'empêcher attraper quoi que ce soit avant l'occlusion, mais laisser assez de fil pour permettre le serrage des noeuds plus tard. De cette façon, toute image de ligne de base ou la collecte de données peut être réalisée avec tous de la même invasion chirurgicale telle que l'occlusion et les noeuds serrés au niveau du point de temps appropriée avec peu de retard.

9. Une fois que les noeuds ont êtrefr tendu, utiliser les micro-ciseaux pour sectionner M1 entre les deux nœuds.
10. Dans le cas des études, de survie à long terme:
    1. Suture incisé rabat cuir chevelu en place avec du fil chirurgical stérile ou sécuriser le tissu en utilisant des agrafes stériles.
    2. Administrer antibiotiques localement à la surface de la plaie (tels que bacitracine pommade), et par voie systémique par injection prophylactique de l'ampicilline (150 mg / kg IM).
    3. Alors que le sujet est encore anesthésié administrer une pommade ophtalmique antibiotique pour les yeux.
    4. Administrer supplémentaire atropine (0,05 mg / kg IM) pour diminuer les sécrétions respiratoires pendant l'anesthésie.
    5. Injecter flunixine méglumine (1,1 mg / kg) par voie sous cutanée à la fin de la chirurgie et de nouveau le lendemain matin (~ 12 h plus tard) pour le contrôle de la douleur.
    6. Placez l'animal sur un chaud, sec, incliné de telle sorte que le nez de l'animal est au-dessus de sa queue sur la pente (ce qui facilite la respiration jusqu'à ce que l'animal est éveillé).
    7. Surveiller l'animal jusqu'à ce qu'il soit éveillé déplacer en toute sécurité sur son propre.
    8. Une fois que l'animal est de retour dans le vivarium, l'activité de l'animal, l'apparence, la vocalisation, et l'alimentation et le comportement potable doit être surveillée tous les jours.

4. Euthanasie

1. À la fin de chaque expérience, les rats doivent être euthanasiés avec du pentobarbital sodique (2-3 ml, par voie intrapéritonéale).

Résultats

Succès occlusion d'un vaisseau peut être confirmé en utilisant granularité laser d'imagerie (LSI) parmi d'autres techniques d'imagerie du flux sanguin. La circulation du sang dans les principales branches corticales du MCA devrait tomber à environ 25% du niveau de référence ou occlusion moins suivante en fonction du niveau de bruit dans le système d'enregistrement et la sensibilité de la technique. Voir Figure 3 pour une image représentant LSI d'un segm...

Discussion

Ce protocole a été développé afin d'induire une ischémie dans le cortex des rongeurs, et de le faire avec un impact minimal périphérique de sujets expérimentaux. Le double occlusion et la méthode de résection permet la confirmation visuelle que le navire a été occultée en permanence et peuvent être effectuées sans invasion excessive ou des dommages aux tissus, et avec un taux de survie élevé. Ce protocole occlusion peut être appliquée à tout navire corticale qui peut être accessible via une cran...

matériels

Name of the equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Extra Fine Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Slight Curve (1)	Fine Science Tools	11151-10
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2)	Fine Science Tools	11252-50
Extra Fine Bonn Scissors, straight (1)	Fine Science Tools	14084-08
Round 3/8 (16 mm) Suture Needles	Fine Science Tools	12050-02
6-0 Braided Silk Suture	Fine Science Tools	NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461
30 gauge needle, ½" length	Fine Science Tools	NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL